Summary
这份手稿提供了一个详细的 two-step 手术程序执行小鼠 5/6th部分肾切除 (PNx) 与极结扎。手术后四周, 与假手术小鼠相比, PNx 小鼠肾功能受损, 贫血, 心肌肥厚, 心脏纤维化, 心脏收缩和舒张功能下降。
Abstract
慢性肾脏疾病 (CKD) 是心血管疾病事件和死亡率的一个很大的危险因素, 并逐步发展到临床表型称为 "尿毒症心肌病"。我们在这里描述一个实验性 CKD 小鼠模型, 命名为 5/6th部分肾切除 (PNx) 与极结扎, 在四周后的发展为尿毒症心肌病。这种 PNx 模型是由 two-step 手术进行的。在第一步手术中, 左肾的两极都结扎了。在第一步手术7天后进行的两次手术中, 右肾切除。对于假手术, 同样的手术程序进行, 但没有极结扎左肾或切除右肾。与其他方法相比, 手术过程更容易、更耗时。然而, 残余功能性肾肿块不像肾动脉结扎那样容易控制。手术后四周, 与假手术小鼠相比, PNx 小鼠肾功能受损, 贫血, 心肌肥厚, 心脏纤维化, 心脏收缩和舒张功能下降。
Introduction
CKD, 也被称为慢性肾衰竭, 是随着时间的推移肾脏功能的逐步丧失, 最终发展成永久性肾衰竭。CKD, 从早期肾脏疾病状态到终末期肾脏疾病 (末期), 是心血管疾病事件和死亡率的一个很大的危险因素, 并逐步发展到临床表型称为 "尿毒症心肌病"1, 2,3。CKD 或末期患者的尿毒症心肌病与心血管异常有关, 主要是由于左心室 (lv) 压力和/或容积超负荷导致的, 导致 lv 肥厚、lv 扩张和 lv 收缩功能障碍4 ,5,6。心脏纤维化是尿毒症心肌病的另一种常见的病理过程, 它能降低心脏顺应性, 导致左心室舒张功能障碍。严重的心脏纤维化可能导致心脏猝死甚至在那些没有心脏症状的患者中7。
5/6th PNx 是一种常用的 CKD 动物模型, 用于动物研究, 包括肾衰竭、尿毒症心肌病和高血压。PNx 是通过消融5/6 肾实质来实现的。大鼠模型最初是用两种最常用的手术切除或梗塞的方法开发的。大鼠 PNx 模型是一个非常有用的模型来研究尿毒症心肌实质升高血压, 心肌肥厚和舒张功能受损。后来, 老鼠 PNx 模型, 操作与相似的技术作为鼠模型, 被开发了由于广泛的可及性在小鼠系统做基因操纵。
有文献记载, 全身氧化剂应激是临床和实验性尿毒症心肌病的一个恒定特征8,9。此外, 氧化剂的压力有助于尿毒症综合征10, 并在尿毒症心肌病的发病机制中起关键作用111213。在这一点上, 我们已经证明了啮齿动物 5/6th PNx 模型导致尿毒症心肌病的生理、形态和生化特征1415,16, 17. 在这里描述的鼠标 PNx 模型中, PNx 操作的小鼠产生了明显的氧化应激, 至少部分由钠/钾 atp 酶信号传导, 这在 PNx 介导的尿毒症心肌病中是至关重要的。钠/钾 atp 酶信号的衰减不仅降低了氧化放大, 而且还改善了 PNx 介导的实验性尿毒症心肌病的型变化18。
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Protocol
所有动物护理和实验均由马歇尔大学机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 根据国家卫生研究院 (NIH) 关于实验室动物的护理和使用指南获得批准。雄性 C57BL/6 小鼠 (10-12 周大) 被安置在一个无病原体的动物设施中, 在指定的房间里装有可在12小时的光照/暗循环下提供纯净空气的网箱。食物和水被提供了 ad 随意 .
1. 手术准备
注意: 外科手术器械和材料是从不同的来源获得的, 不特定于手术操作。其他来源的仪器和材料也可用于同一目的。有关手术器械的列表, 请参阅 材料目录 .
- 手术准备
- 在操作表的范围内放置以下内容: 暖垫、卤素灯、氧气罐和异氟醚罐、异氟醚蒸发器、理发剪、脱毛膏、鳞片、灭菌操作套装, 消毒的手术亚麻布, 棉签, 70% 酒精, polyhydroxydine 溶液 (含1% 碘), 0.9% 氯化钠溶液, 1 毫升注射器和针头 (30 克), 3-0 和4-0 丝缝线, 丁丙诺啡和青霉素, 抗生素软膏,润滑油眼膏.
- 清洁一个笼子, 并在床下放置一个热垫, 供小鼠在手术后居住.
2。一步手术: 左肾极结扎术
注意: 在手术期间保持无菌状态。用无菌垫覆盖蒸压的外科器械。在手术中, 多套外科手术器械, 进行多项手术, 以防止交叉污染。如果需要再次使用仪器, 在多项手术的情况下, 用控告溶液和70% 乙醇对仪器进行消毒, 然后在器官玻璃微珠消毒器中消毒5分钟, 用70% 乙醇消毒操作区域。穿上长袍、面罩 (盖住鼻子和嘴巴)、帽 (盖头) 和一副无菌手套。每次手术后更换手套.
- 清洗和消毒双手, 并佩戴无菌手术手套。戴头帽和面具.
- 用70% 酒精消毒桌子。将润滑剂眼膏涂抹在老鼠的双眼上, 防止麻醉时眼部干燥.
- 将鼠标放置在异氟醚蒸发器系统的感应室中, 并以2.5% 异氟醚100% 氧 (0.8-1.2 升/分) 的混合物诱导麻醉, 用于 1-2 min.
注: 麻醉的功效是由捏尾引起的疼痛反射, 以及眼睑没有眼睑反射而决定的. - 注射青霉素 (4万单位/千克体重, IM) 和丁丙诺啡 (0.02 毫克/千克体重, SC), 以防止感染和疼痛的手术过程中.
- 将鼠标放在暖垫 (最初设置在42和 #176; c) 上, 用直肠温度计来保持和监测37和 #176 的体温; 在手术过程中。在手术过程中, 将小鼠的鼻子放入鼻锥, 用 0.8-1.2% 的异氟醚与100% 氧 (0.8-1.2 升/分) 的混合物进行通气.
- 将鼠标放在右侧。用理发剪刮掉手术区的毛发, 然后用脱毛膏除去。用 polyhydroxydine 溶液 (含1% 碘) 消毒现场, 然后用70% 乙醇。将蒸压的外科亚麻布对准手术区.
- 做一个〜1.0 厘米腰椎切口和分离的肌肉和筋膜暴露左肾使用手术刀和钳 ( 图 1a ).
- 通过用小钝钳拉动肾脂肪轻轻拉出左肾。在这个过程中, 为了不扰乱肾上腺, 用镊子将肾上腺从肾脏向上移.
- 使用钝钳, 轻轻地从肾脏的上端将结缔组织和肾上腺从肾的上部向肾的中间的幽门处, 血管进入和出口。识别和隔离输尿管.
注: 输尿管位于肾脏的下半部, 在结缔组织内, 在光下清晰可见. - 轻轻地抓住结缔组织并从肾脏组织中分离, 以确保输尿管没有结扎.
- 在极性结扎之前, 使用无菌尺来鉴别肾脏的1/3 部分的优劣。老鼠肾脏通常是大约 1.25-1.5 cm 长.
- 结扎使用3-0 丝线缝合线和适当的力量, 大约0.4 厘米从上级部分往幽门的中部和相似地, 0.4 cm 从下等部分对幽门 ( 图 1a , 点式行).
- 在结扎两个极点 ( 图 1b ) 后, 允许2分钟观察时间以确保没有出血.
注意: 在这个过程中, 避免结扎肾上腺、肾动脉和输尿管是非常重要的。如果左输尿管被结扎, 老鼠将在第二步手术中切除右肾后死亡。结扎力可以限制血流到两极, 而不会引起肾出血。在结扎后的 1-2 分钟内, 两极因血液流向两极的极限而变色. - 将左肾推回到原来的位置。分别用4-0 和3-0 丝缝合线将肌肉和皮肤闭合。将抗生素软膏应用于手术区, 以更好的恢复和消毒.
- 结扎后, 将鼠标放在笼中, 将其放在一个带有热灯的笼子中, 使寝具区域接近37和 #176; C (用温度计监测), 然后将动物放在单独的笼子里.
注意: 监测鼠标, 直到它已经恢复足够的意识, 以维护胸骨卧床. - 允许在恢复过程中方便地获得水和食物。管理青霉素和丁丙诺啡, 每12小时后头3天, 以防止感染和疼痛.
注意: 老鼠应该在 2-3 天内从手术创伤中恢复过来, 并且应该回到正常的饮食、饮酒和运动中。此时, 将鼠标逐个进行完全恢复。必须对以下情况进行监测: 饮酒、进食、行走方式、笨拙的步态、驼背、眼部和/或鼻腔分泌物以及攻击性行为。安乐如果它显示任何癫痫发作、昏迷、无法治愈的感染、行走困难、步态丧失、无法进食和饮水, 以及15% 的术后体重损失.
3。第二步手术: 右肾切除术
- 七天后, 在步骤2.1 到2.10 中将右肾暴露为左肾, 除非将鼠标放在其左侧.
- 将右肾放在亚麻布上, 用钝钳将周围的脂肪和结缔组织清除干净.
- 识别肾动脉和静脉, 然后将两个连字 (3-0 丝) 分别放置在血管周围的一个松散结。轻轻地挑逗结缔组织和肾上腺腺体从肾脏的上端向中间的幽门的肾脏使用钝钳。轻轻地将输尿管从下端移出, 并将所有的血管系在一起 (3-0 丝) 而不会造成出血.
- 将两个松散的连字节沿容器移动。一个朝向腹主动脉一侧, 另一个朝向肾侧.
- 首先将结扎结 (朝向腹主动脉侧) 与双节结; 实心结会改变右肾的颜色。将结扎结 (朝向肾脏一侧) 系成双结。在这两个结之间留出足够的空间, 以便在两节之间切断血管而不割断结扎结.
- 切开两节之间的肾血管, 取出右肾。检查肾血管是否可能出血.
- 用无菌纱布烘干右肾, 称其为重.
- 用4-0 丝缝合线关闭肌肉切口, 然后用3-0 丝缝合线闭合皮肤切口.
- 将鼠标分别放在一个干净的单独的笼子里, 在笼子上放一盏热灯 (步骤 2.15), 以方便地获得水和食物, 至少24小时才能恢复。管理青霉素和丁丙诺啡每12小时3天, 以防止感染和疼痛.
注意: 老鼠应该在 2-3 天内从手术创伤中恢复过来, 并且应该回到正常的饮食、饮酒和运动中. - 手术后, 每天两次监测小鼠三天, 然后每天一次进行实验。遵循步骤2.16 中描述的后监视和处理程序.
4。假手术
- 为假手术, 执行相同的手术程序, 包括肾脏暴露, 组织解剖, 伤口闭合, 但没有左肾极结扎或右肾切除.
5. 实验性尿毒症心肌病的评估
- 在牺牲前一天, 执行经胸超声心动图和捕获图像 18 。 注: 在这里, 经胸超声心动图进行了鼠标处理表和直肠温度计。超声心动图图像被捕获使用18-38 兆赫工作频率传感器连接到一个成像系统。根据我们描述的 18 , 计算出相对壁厚 (RWT)、心肌性能指数 (MPI) 和左心室质量指数 (LVMI).
- 在牺牲时, 测量体重。根据制造商和 #39 的指示, 用一台小贩的离心机测量红细胞压积 (小贩)。用肝素包膜管制备血浆样品, 离心10分钟, 在 1500 x g 在4和 #176; C 在台式冷藏离心机。根据制造商和 #39 的说明, 使用套件测量胱 C、肌酐和发髻。重复执行测量.
- 在实验结束时, 麻醉用氯胺酮 (90 毫克/千克, ip) 和 xylaxine (10 毫克/千克, ip) 和切口的牺牲。从胸部取出后测量心脏重量。准备心脏 (LV) 和肾脏匀, 以及 Type-1 胶原蛋白 (COL-1) 的测定, 磷酸化的 c Src 和蛋白质羰基, 如前所述, 18 , 19 .
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Representative Results
数据表明, 此修改后的 5/6 th PNx 模型是一种简单有效的研究尿毒症心肌病的模型。在四周后, 该 PNx 模型显示肾功能受损, 贫血, 心肌肥厚, 心脏纤维化, 并降低心脏收缩和舒张功能。结果概述如下。
在四周的后, PNx 小鼠除了心脏形态学和生化变化, 与人类尿毒症心肌病的表型相一致外, 还发育受损的肾功能。这些 PNx 介导的变化包括以下观察与假操作小鼠相比。首先, 正如预期的那样, PNx 手术引起了肾功能的严重损害。如图 2所示, PNx 手术显著增加了胱 C 的血浆水平 (图 2a, n = 16), 肌酐 (图 2b, n = 16), 发髻 (图 2C, n = 16), 当与虚假手术.其次, 在 PNx 小鼠 (图 2d, n=8) 中, 有明显的低 PNx 的受激性贫血。第三, PNx 介导的心肌肥厚和舒张功能障碍表现为增加的心脏重量/体重比 (图 3a), 和经胸超声心动图 (回声) 分析显示显着增加后壁厚度 (PWT)、前壁厚度 (AWT)、RWT (图 3b)、MPI (图 3c) 和 LVMI (图 3d)。射血分数没有显著变化 (EF,%)。第四, PNx 介导的心肌纤维化通过 PNx 诱导的 i 型胶原蛋白表达在 LV 匀 (图 4a) 和左残余肾脏匀 (图 4b) 中显示。第五, 氧化剂应激在实验性尿毒症心肌病中起重要作用。在这个 PNx 模型中, PNx 在 LV 匀中显著地刺激了蛋白质的直接蛋白羰化修饰 (图 4c) 和 c Src 激活 (图 4d)。PNx 手术并没有造成四周后的体重显著下降。然而, PNx 模型采用极结扎法并没有诱发高血压。在一步手术前的一天和一天前的一项治疗中, PNx 小鼠的收缩期血压、舒张 bp 和平均 bp (未显示的数据) 之间没有显著差异, 这与 C57BL/6 鼠菌株的概念是一致的。未建立高血压模型20,21。数据还表明, 这种 PNx 模型不太可能是急性肾衰竭的模型。此外, PNx 介导的心脏改变, 但不损害肾功能, 通过阻断 c 型钢 Src 活化或诱导血红素 oxygenase-1 (HO-1)18。
图 1: 左肾的极结扎.照片显示左肾结扎 (左) 和结扎后 (右)。左图中的被溺爱的线条显示了估计的结扎线。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: PNx 与极结扎导致肾功能受损和贫血.在四周后, PNx 手术显着增加血浆水平 (a) 胱 C (n = 16), (b) 肌酐 (n = 16), (C) 发髻 (n = 16), 与假手术相比。PNx 也明显减少 (d) 红细胞压积 (小贩) 在 PNx 小鼠 (n = 8)。数据被表示为平均± SEM. **, p 和 #60; 0.01, 假手术小鼠与 PNx 操作的小鼠。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: PNx 与极结扎刺激心肌肥大.在四周后, PNx 手术显著增加 (a) 的心脏重量/体重比 (a, n = 8), (b) 相对壁厚 (RWT, n = 1 9-21), (c) 心肌性能指数 (MPI, n = 19-21), 以及(d) 左心室质量指数 (LVMI, n = 19-21)。数据被表示为平均± SEM. **, p 和 #60; 0.01, 假手术小鼠与 PNx 操作的小鼠。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: PNx 与极结扎刺激 i 型胶原蛋白表达, 蛋白质羰基化和 c-Src 活化.在四周后, PNx 刺激 i 型胶原蛋白表达在左心室 (LV) 匀 (a, n=11) 和左残余肾脏匀 (b, n = 7-10)。也在 LV 匀, PNx 刺激直接蛋白质羰基化 (c, n = 6) 和 c Src 活化 (d, n = 6)。数据被表示为平均± SEM. **, p 和 #60; 0.01, 假手术小鼠与 PNx 操作的小鼠。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
大鼠 5/6th PNx 模型被广泛用于研究 CKD。由于小鼠的肾脏体积较小, 传统的动脉结扎和极切除术在小鼠模型中具有很大的挑战性, 可能造成高死亡率和意外出血/失血。
我们采用了小鼠 PNx 模型与极结扎, 以克服出血/失血。该 PNx 模型耗时少, 成活率高, 重现性好。这种极结扎模型在四周后时发展了人尿毒症心肌病的表型变化, 从而为研究其机制和治疗靶点提供了一个模型。
在这个 PNx 模型中, 5/6th PNx 是肾脏质量降低的一种近似估计, 至今为止, 还没有准确计算出两个不同大小/质量的肾脏残余肾脏质量的方法。但是, 结扎应以非常相似的方式进行, 以减少手术的变异。我们估计, 保持约40% 的左肾 (或约20% 的总肾脏质量) 可以显著降低死亡率 (约 20%), 而不牺牲的发展, 尿毒症型心肌病表型。另一个问题是结扎的力量需要练习。
与 5/6th PNx 模型通过极切除或肾动脉结扎1520相比, 极结扎法简便、快速, 且为要求较低。此 PNx 模型的可能优点包括: 1) 在 PNx 模型中, 通过极切除或动脉结扎, 2), 避免可能的出血, 从而使炎症反应引起的氧化应激减弱极结扎, 3) 更低的死亡率 (约 20%), 和 4) 快速发展的尿毒症心肌病表型。成功的极套结扎显示了连续的不可逆损伤和被结扎的极点的退化。在两周的后 (图 4) 中, 被结扎的极点是可见的, 并且主要在四周后 (图 5) 消失。比较两周和四周后的结扎极点, 表明对极结扎的炎症反应。
这种 PNx 模型可能有助于研究药物作用机制和药物筛选。我们最近使用这个 PNx 模型来研究钠/钾 atp 酶信号和氧化应激在尿毒症心肌病的发展中的作用。pNaKtide 是钠/钾 atp 酶信号的特异拮抗剂, 它不仅能防止尿毒症心肌病的发生, 而且还能逆转尿毒症心肌病的发生18。
该协议中的关键步骤是 follows:1) 一个更积极的结扎 (残余左肾肿块小于 30%) 将显著增加死亡率 (约 50%). 2) 结扎的力量需要实践达到的地步, 结扎限制血液供应到极点, 而不破坏胶囊和肾脏组织。打破肾脏组织导致肾出血, 可能导致死亡后, 右肾切除。一个成功的结扎杆在结扎后 1-2 分钟内变色, 由于血流到极点的限制。3) 需要特别注意避免结扎左肾的输尿管或在结扎两极时损害输尿管。在切除右肾后, 有结扎或损伤的输尿管的老鼠将无法存活。这可能是最明显的缺点的极点结扎方法。4) 在手术过程和后护理中保持体温。5) 用抗生素控制可能的感染。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了 nih R15 1R15DK106666-01A1 (对 j. 刘) 和 nih RO1 HL071556 (J.I. 夏皮罗) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iris Scissors, 11.5 cm, Straight | World Precision Instruments | 501758 | |
| WPI Swiss Tweezers #5 11 cm, 0.1x0.06 mm Tips | World Precision Instruments | 504506 | |
| Jewelers #5 Forceps, 11cm, Straight, Titanium | World Precision Instruments | 555227F | |
| Iris Forceps, 10cm, Straight, Serrated | World Precision Instruments | 15914 | |
| Tweezers #3, 11cm, 0.2x0.4mm Tips | World Precision Instruments | 501976 | |
| Medesy Iris 4.5" Curved Scissors, Stainless Steel | Net23 | 3512 | www.Net32.com |
| Dr. Slick Iris Scissors; 3.5" | Avid Max | 220-1-965-IrisScsrs-P | www.Avid Max.com |
| Miltex Iris Scissors 4 1/8" Curved | 4mdmedical | V95-306 | www.4mdmedical.com |
| 5" Hemostat clap, curved jaw | PJTool | 4355 | www.pjtool.com |
| sklar Knapp Iris scissors, straight and sharp/blunt 4" | Medical Device depot | 64-3430 | www.medicaldevicedepot.com |
| Kelly Hemostatic Forceps straight 5.5" | Pilgtimmedical | FA710-50 | www.pilgtimmedical.com |
| C57BL/6 mice | Hilltop Lab Animals Inc. | ||
| Mouse Handling Table and rectal thermometer | Visualsonics | ||
| MicroScan transducer | Vevo 1100 | MS400 | |
| Vevo 1100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics Inc. | ||
| Cystatin C ELISA kit and mouse creatinine kit | Crystal Chem. Inc. | ||
| Mouse BUN ELISA kit | MyBioSource Inc |
References
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