Summary
在这里，我们提出一个协议来描述神经营养因子4（NTF4）的系统和直接用于改造大鼠老化的喉部肌肉。
Abstract
老年人的喉功能障碍是残疾的主要原因，从语音障碍到吞咽困难和气道保护性反射丧失。存在少量针对年龄相关性喉部肌肉功能障碍的治疗方法。神经营养因子参与神经肌肉接头（NMJ）的肌肉神经支配和分化。据认为神经营养蛋白通过增加神经递质释放来增强神经肌肉传递。神经肌肉接头（NMJ）在衰老的大鼠喉部肌肉中变得越来越小，具有功能去神经支配的证据。我们探讨了NTF4对未来临床应用的作用，作为改善老年人类喉部肌肉功能的治疗剂。在这里，我们提供了系统应用和直接注射NTF4的详细方案，以调查老化大鼠喉肌肉响应NTF4应用重建的能力。在这种方法中，大鼠通过 o系统地接受NTF4雾状泵或直接注射通过声带。然后解剖喉部肌肉，用于组织学检查形态学和年龄相关的去神经支配。
Introduction
喉部肌肉迅速，一致地收缩，容易受到衰老的不利影响。这种不断的活动被认为有助于在65岁以上的人，1,2,3,4,5,6,7人群中观察到的语音问题或吞咽困难。几种分子和病理生理机制有助于这种年龄相关的功能障碍。这些机制可能包括喉粘膜的重塑，肌肉纤维的萎缩或丧失，缺乏肌纤维再生或萎缩，导致声带弯曲和声门关闭不能8,9,10,11。目前还没有经过证实的药物治疗彻底预防或恢复这些年龄相关的这些肌肉变化。
调节神经肌肉传播的有效性可以极大地影响神经运动的表现。神经营养蛋白家族包括神经生长因子（NGF），脑源性神经生长因子（BDNF），神经营养因子3（NTF3）和NTF4 12,13 。神经营养因子已经显示出调节突触功效1,4 。肝细胞生长因子，转化生长因子β和成纤维细胞生长因子最近已被用于人类治疗声带皱纹瘢痕15-17 。 NTF4也调节NMJ的有效性;缺乏NTF4的小鼠显示了拆卸的NMJ 11,18,19。这些研究导致治疗有希望的效果t老化喉部肌肉疾病和去神经与生长因子。
对人体组织的直接注射治疗不是人类前所未有的。例如，局部注射肉毒杆菌毒素目前用作影响喉部肌肉的神经运动障碍的有效治疗方法，如痉挛性发音障碍和双侧复发性喉神经麻痹20,21 。透明质酸水凝胶是另一种可注射的，用于治疗声带褶皱和声门功能不全22,23 。注射喉成形术可用于治疗各种通气障碍24 。这些直接注射方法有望改善老年人群的声音功能和吞咽。
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Protocol
对于这个方案，在6和30个月龄时使用雄性Fischer 344-Brown Norway大鼠。大鼠从国家老龄鼠老鼠研究所获得。我们使用老鼠进行这项研究，因为大鼠喉的结构类似于人类的结构，功能上用于气道保护和物种特异性发声本研究是按照PHS对人类关心和使用实验动物的政策进行的， NIH“实验动物护理和使用指南”和“动物福利法”（7 USC等）;动物使用协议由肯塔基大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
大麻麻醉
- 通过将盐酸氯胺酮（解离麻醉剂）和盐酸赛拉嗪（镇静和镇痛）混合在缓冲盐水中来制备麻醉药。最终溶液中氯胺酮和赛拉嗪的浓度为100mg / 8mg / kg体重分别为
- 通过使用25 G针的注射器通过腹膜内给药将麻醉剂注入大鼠。
- 通过用镊子夹住脚趾或脚来确定大鼠是否充分麻醉。如果大鼠对痉挛没有反应，那么手术就可以开始了。如果大鼠对反射或肌肉收缩的脚趾反应，则等待1-2分钟，然后重复捏捏测试。如果大鼠再次反应，用新动物代替大鼠，并从步骤1.2开始重复操作。
- 在大鼠不动之后，向大鼠的眼睛涂抹眼科软膏，以防止角膜变干。
渗透泵植入
- 将大鼠腹侧置于无菌手术区域。管理美洛昔康作为美容前药。使用25 G针的注射器以1-4mg / kg体重腹膜内给药。
- 使用剪刀去除一个近似值脖子后面有1“x 1”平方英尺的毛皮，肩膀之间的距离大约为1英尺，剃须尽可能靠近皮肤。
- 用乙醇消毒（70％）将背部和颈部润湿。
- 剃须后，用3次擦洗擦洗颈部背部碘酒精酒精。
- 通过将其放置在设置在34℃的加热垫上来保持大鼠的体温。
- 用无菌制备的渗透泵用50μL的NTF4或盐水进行全身NTF4处理（ 图1 ）。
- 使用手术刀做一个大约2厘米宽的水平切口，通过皮肤，只是颅骨到肩胛骨之间的空间。用镊子用镊子提起切口的后边缘，同时插入止血钳的尖端，轻轻地推到切口的后方。
- 止血垫的尖端约为2厘米c在切口处行走，打开止血钳上的手柄，将尖端扩张，在切口部位皮下形成一个空心的“口袋”。这将是泵的安置点。
- 在插入后首先定位泵输送入口端，以最小化NTF4与口腔切口部位愈合的任何相互作用。
- 送出50μL的NTF4盐水7天14天。 7天组的NTF4达到6.72mg /天，总剂量为47.04mg。 14天组每天接受6.72mg /天的总剂量为94.08mg的NTF425。
- 使用5-0尼龙缝合线，止血钳和镊子关闭用于泵放置的切口。
- 从麻醉中恢复至少30分钟观察大鼠。完成监测的标准包括动物变得活跃，围绕笼子，饮水，开始其他正常的活动，如梳理。
- 每天监视动物通过观察手术部位的愈合，正常饲料和耗水量以及尿/粪便的通过以及压力，疼痛或其他手术后并发症的任何异常行为迹象，第一周。
- 如果大鼠似乎处于疼痛或痛苦状态，则每24小时给予大鼠5mg / kg皮下注射卡洛芬，持续5天以缓解疼痛。
- 如果出现感染，请咨询兽医，以确保伤口愈合良好。
- 根据大鼠在哪个实验组中，手术后7-10天取出5-0尼龙缝线，以防止线刺激。
3.直接注射大鼠麻醉
- 在手术前一天晚上从老鼠身上取食食物。这确保没有食物阻塞内窥镜或注射针。
- 称重大鼠，并制备1-2mg / kg乙酰丙嗪的体重。肌内注射（IM位置是左侧甲状腺肌肉）。
- 将大鼠放在感应盒中。在感应箱中诱导5％异氟烷和1 LO 2的麻醉。
- 将大鼠移至2％异氟烷和600 mL O 2的鼻锥。
- 通过用镊子夹住脚趾或脚来确定大鼠是否充分麻醉。如果大鼠对痉挛没有反应，则注射方案可以开始。如果大鼠对反射或肌肉收缩的脚趾反应，则等待1-2分钟，然后重复捏捏测试。如果大鼠再次反应，用新动物代替大鼠，并从步骤3.4开始重复操作。
直接注入和可视化
- 将无菌制备的含有NTF4或盐水的50μL剂量在设定为25℃的H 2 O浴中注射30分钟。
- 将大鼠放置在有机玻璃平台上的俯卧位置（ 图2 ）。野猪通过穿过平台顶部的导丝，从前额上切牙通过斜倚的姿势来摆放大鼠。
- 将50毫米，30磅，100μL注射器连接到1.9毫米，30度鼻窦内窥镜（ 图3 ）。
注意：注射器组件通过将插管牢固地保持在内窥镜的外壁上的夹具连接。内窥镜允许在口腔内可视化的声带和注射器的引导。在每个动物之前调整套管尖端的位置，以确保通过内窥镜视图完全清晰地看到尖端（ 图4 ）。 - 使用橡胶一对镊子延伸舌头并将其横向移动。之后，插入塑料窥器以保持口腔通畅。将5毫米塑料注射器筒中的勺子切成1.5至2厘米的长度，切割边缘去毛刺并抛光光滑。
- 关掉车上的灯并将卤素光源附着到内窥镜。打开录像机以捕获该过程。
- 将内窥镜的远端浸入温水中几秒钟，以便在插入大鼠口中时最大限度地减少玻璃尖端上凝结的发展。
- 使用来自显示器的视觉反馈，仔细地将针引导到左声带的区域。
- 随着动物呼吸循环的吸气阶段注射溶液，以完全进入声带。在呼吸的吸气阶段，声带完全暴露。
- 一旦声带完全可见，将针插入左侧甲状腺激素，发现在声带的白色中间边缘的外侧。将针插入到位，通过注射器的凹陷输送注射器。
- 关闭内窥镜和视频播放器上的卤素光源，然后转回room灯。
- 将老鼠回到家中的笼子上放在加热垫上。
- 从加热垫取出前，让老鼠恢复。更换笼子里的食物和水。
- 注射后监测大鼠7天，然后安乐死。取出喉部进行冷冻切片24 。
5.大鼠安乐死
- 用盐酸氯胺酮和盐酸赛拉嗪麻醉麻醉大鼠（100mg / 8mg / kg体重腹膜内注射）。
- 通过内侧胸廓切开术安乐死。
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Representative Results
大鼠在渗透泵输注2周后直接注射NTF4后1周安乐死。收获喉，置于冷冻保护剂（30％蔗糖和70％磷酸盐缓冲盐水）中，然后用低温恒温器以10μm的宽度连续切片。老化的喉部肌肉受NTF4 25的施用影响。除了老年和老鼠之外，我们比较了甲状腺素肌肉的注射和非注射侧。通常，我们看到纤维尺寸随年龄的变化，其根据NTF4的施用途径而变化（ 图5 ）。治疗后也定性观察到较少的纤维化。去神经纤维的百分比随老化大鼠全身和直接应用NTF4而降低（ 图6 ）。 NMJ的数量也增加（ 图7 ）。这种增长的意义取决于治疗或治疗途径的长短。
渗透泵的代表性图像。在用NTF4填充泵后，将流量调节剂插入主体以密封泵。
图2：注射程序平台。将大鼠放置在平台上的仰卧姿势中，并通过安装在平台顶部的引导线由前上切牙悬挂。 请点击此处查看此图的较大版本。
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图3：注射器的代表性图像。用NTF4和盐水混合物填充注射器。 请点击此处查看此图的较大版本。
图4：注射程序。 （ A ）注射器连接到19.9mm 30°内窥镜（如图所示）; （B）检查光线以确保该程序有光线; （ C ）实时视频确保针头被引导到正确的位置。
图5：纤维尺寸和形态的变化。代表他在30日龄26,27,28天，7天治疗（右）和未治疗（左）甲状腺肌肉的全身NTF4的酪蛋白和伊红染色切片。从控制到处理的动物的纤维尺寸有所增加。用NTF4治疗可将30 mo纤维尺寸改为6月龄较小的动物。 * p <0.05与30个月（照片在40倍放大倍数捕获;比例尺=25μm，P <0.001）。顶部图片中的箭头指向纤维化区域。治疗动物纤维化也有定性的降低。 请点击此处查看此图的较大版本。
图6：内在变化使用NTF4治疗。代表性Nav1.5染色切片，全身NTF4 14天处理（右）和未处理（左）甲状腺肌肉30个月龄（图片以40倍放大倍数拍摄;比例尺= 25微米） 29 。 Na v 1.5标记（绿色）有年龄减少的去神经支配。左图是代表性的Na v 1.5（绿色）和鬼笔环肽，表示来自未经治疗的甲状腺样肌肉的纤维（红色）染色切片，右图为处理肌肉。绿色插入物是单独的Na v 1.5染色。
图7：NTF4治疗NMJ的变化。来自全身NTF4的NMJ的代表性荧光显微镜图像用α-银环蛇毒素（绿色）标记的不同动物的14天处理的甲状腺素肌肉切片和显示NMJ值在30个月时NTF4治疗（比例尺=25μm），（P <0.001） 11的鬼笔环肽（红色）。
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Discussion
喉部肌肉易受老化不利影响。以前的研究已经证明了老化喉部肌肉的变化，包括纤维尺寸变化，纤维总数，再生能力，NMJ大小和数量变化，以及收缩功能和肌球蛋白异构体转变的变化4,11,27,30,31 。老化喉肌可以通过应用神经营养蛋白来改变。可以容易地测量这些变化。因此，大鼠喉部肌肉提供了一个有用的模型来研究衰老和声音疾病/失调的影响。这些肌肉的研究也可能有助于在老龄化人群中发展干预或保护过程。
我们的全身或直接应用NTF4的方法在老化大鼠喉中产生重塑反应肌肉。这表明神经营养蛋白可能对衰老相关的肌肉功能障碍具有治疗潜力。神经营养因子的直接应用可以通过注射载体很容易地转化为人类老龄化模型。
使用注射方案时要考虑很多因素。首先，考虑到内窥镜的尖端具有尖锐的针，必须注意防止在喉前庭周围的软组织的划伤和损伤。其次，在动物呼吸周期的吸气阶段期间，针尖进入喉部的运动是准确的，准确地注射时间。第三，通过预先在计算机显示器上目视检查设备，确保针尖在尝试过程前清晰可见。第四，在热水中加热内窥镜的尖端几秒是确定内镜雾化的重要一步避免了镜头。最后，在任何范围界定程序之前，晚上将鼠标放在同一位置也是很重要的。如果没有食用食物，它们很可能在咽中仍然有食物残留，这使得注射程序实际上是不可能执行的。每天应检查大鼠的脱水迹象并进行称重，以确保没有明显的体重减轻（大于体重的10％）。
方案开发中的两个关键步骤是注射器与内窥镜的连接以及口腔窥器的使用。注射器组件的牢固锚定是必要的，以便于单手操作以进行示范性插入和注射。考虑到研究的目的，没有直接的可视化来指导注射声带，实验就不可能实现。此外，创建口腔窥器被认为是重要的，以防止舌头移动和维持会议开放整个程序。
视觉引导的注射方法进行了几轮修改，主要涉及找到将注射器和针牢固地固定在内窥镜上的最佳方式。在测试了几种不同形式的胶带粘合剂之后，发现市售的弹性运动胶带是将注射器固定在内窥镜主体上的最佳方式。
视觉引导注射方法的最大限制与仪器无关，而与专利咽和气道的需要无关。虽然在手术前24小时限制食物解决了大部分问题，但老鼠会在笼子里摄入任何东西，包括床上用品和粪便。发生这种情况时，有两种解决办法：（1）推迟注射，直到动物自然清除咽部，或（2）用镊子手动取出堵塞物。这是我们的经历e，前者是更好的选择，因为它减少了对动物咽部区域的潜在伤害的风险。
鉴于该方案的新颖性以及需要直接将化合物注入声带，所以没有其他可靠的方法存在。鉴于动物喉部系统的体积小，通过口腔和咽部区域的视觉指导注射，以确保化合物在活体动物中的正确和一致的放置。直接注射声带的唯一其他手段是尝试从外部位置通过喉部的皮肤和软骨进行。虽然这种方法在经过肉毒杆菌毒素治疗的人中成功地进行以缓解喉部肌张力障碍，但是经皮注射方法在小动物中是不可行的。
该技术是强大的，可用于不仅注射声带，而且可用于注射部位咽和口腔地区。另外，该方法可以通过去除注射器来适应于简单的视觉监测动物咽和喉部区域。
总之，这种注射方法是研究与人类衰老相关的声音功能障碍治疗相关的生物学机制的新手段。这种方法也有可能应用于影响人的声音，声音功能，沟通和吞咽的其他疾病模型。
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Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家耳聋和其他传播障碍研究所（R21DC010806至CAM和JCS以及R01DC011285至CAM）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurotrophin 4 | Pepro Tech | 450-04 | 200 ng in 50 μL |
| Alzet Osmotic Pump | DURECT Corporation | 2001D | |
| 30 ° endoscope | Stoltz | 61029D | |
| 50 mm 30 gauge 100-μL syringe | Hamilton | 84850 and 201812 | |
| saline (sodium chloride solution) | Sigma-Aldrich | S8776 | |
| ketamine hydrochloride | Henry Schein | 56344 | |
| xylazine hydrochloride | Henry Schein | 33198 | |
| 25 G 5/8 needle | Becton-Dickinson | 305901 | |
| 1 mL syringe | Becton-Dickinson | 309659 | |
| ophthalmic ointment | Henry Schein | 8897 | |
| clippers | Oster | 44-018 | |
| ethanol | Decon | 2716 | |
| iodine (Betadine) | Purdue Pharma L.P. | 606404 | |
| heating pad | Sunbeam | 731-5 | |
| 5-0 nylon suture thread | AD Surgical | PMN-518R6 | |
| crile hemostat | Fine Science Tools | 13005-14 | |
| delicate suture tying forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| meloxicam | Henry Schein | 49756 | |
| carprofen | Merritt Veterinary Supplies | 148700 | |
| antibiotic ointment | Henry Schein | 57110 | |
| acepromizine Aceproject | Henry Schein | 3845 | |
| isoflurane Isothesia | Henry Schein | 50033 | |
| induction box (anesthetizing box) | Harvard Apparatus | 50-0116 | |
| oxygen compressed tank | Scott Gross | UN1072 | |
| plexiglas platform | Small Parts Inc (Amazon) | ||
| rubber tipped forceps | Fine science tools rubber | 11075-00 | |
| liquid rubber for forceps above | Lowe's | 42518 | |
| plastic spectula (BD syringe cut to length) | Becton-Dickinson | 309659 | |
| halogen light source rhino-laryngeal stroboscope | Kay-Pentax | RLS 9100 B | |
| video recorder | Kay-Pentax | ||
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-500G | |
| phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| cryostat Mictotom HM525 | Thermo Scientific | HM 525 | |
| Gill 1 hematoxylin | VWR | 10143-142 | |
| Shandon eosin-Y alcoholic | Thermo Fisher Scientific | 6766007 | |
| anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | S0819 | |
| Texas red-X phalloidin | Sigma-Aldrich | T7471 | |
| alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | B-13422 | |
| Small animal anaesthesia machine | Smiths Medical | CDS 9000 |
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