Summary
Ici, nous présentons un protocole pour décrire l'utilisation de la neurotrophine 4 (NTF4) systémique et directement pour remodeler les muscles laryngés du rat.
Abstract
Le dysfonctionnement du larynx chez les personnes âgées est une cause majeure d'invalidité, des troubles de la voix à la dysphagie et à la perte de réflexes protecteurs des voies aériennes. Peu de thérapies, le cas échéant, existent qui visent le dysfonctionnement du muscle laryngien lié à l'âge. Les neurotrophines sont impliquées dans l'innervation musculaire et la différenciation des jonctions neuromusculaires (NMJ). On pense que les neurotrophines augmentent la transmission neuromusculaire en augmentant la libération des neurotransmetteurs. Les jonctions neuromusculaires (NMJ) deviennent plus petites et moins abondantes dans le vieillissement des muscles laryngés du rat, avec des signes de dénervation fonctionnelle. Nous avons exploré les effets du NTF4 pour une utilisation clinique future en tant que thérapeutique pour améliorer la fonction dans le vieillissement des muscles laryngés humains. Ici, nous fournissons le protocole détaillé pour l'application systémique et l'injection directe de NTF4 pour étudier la capacité du vieillissement du muscle laryngé du rat à remodeler en réponse à l'application NTF4. Dans cette méthode, les rats ont soit reçu NTF4 soit systémiquement via oPompe smotique ou par injection directe à travers les plis vocaux. Les muscles laryngés ont ensuite été disséqués et utilisés pour l'examen histologique de la morphologie et la dénervation liée à l'âge.
Introduction
Les muscles laryngés se contractent rapidement et constamment, et sont vulnérables aux effets néfastes du vieillissement. On pense que cette activité constante contribue aux problèmes de la voix ou à la dysphagie chez les personnes de plus de 65 ans 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Plusieurs mécanismes moléculaires et pathophysiologiques contribuent à ce dysfonctionnement lié à l'âge. Ces mécanismes peuvent inclure le remodelage de la muqueuse laryngée, l'atrophie ou la perte de fibres musculaires, le manque de régénération ou d'atrophie des fibres musculaires, ce qui entraîne l'inclinaison des plis vocaux et l'incapacité de la fermeture des glottes 8 , 9 , 10 , 11 . Il n'y a pas de thérapie médicale prouvée à ce moment qui peut comPrévenir ou réhabiliter complètement ces changements liés à l'âge dans ces muscles.
La modulation de l'efficacité de la transmission neuromusculaire peut influencer grandement la performance neuromoteuse. La famille des neurotrophines comprend le facteur de croissance nerveuse (NGF), le facteur de croissance du nerf dérivé du cerveau (BDNF), la neurotrophine 3 (NTF3) et le NTF4 12 , 13 . Les neurotrophines ont montré qu'ils modulent l'efficacité synaptique 1 , 4 . Le facteur de croissance des hépatocytes, le facteur de croissance transformant bêta et le facteur de croissance des fibroblastes ont récemment été utilisés chez les humains pour le traitement des cicatrices de plomb vocal de 15 à 17 ans . NTF4 régule également l'efficacité NMJ; Les souris dépourvues de NTF4 montrent des NMJ désassemblés 11 , 18 , 19 . Ces études conduisent à des effets prometteurs du traitementT des troubles du muscle laryngien vieillissant et la dénervation avec des facteurs de croissance.
La thérapie par injection directe aux tissus des plis vocaux n'est pas sans précédent chez les humains. Par exemple, les injections locales de toxine botulique sont actuellement utilisées comme traitement efficace pour les troubles du mouvement neurologique qui affectent les muscles du larynx, tels que la dysphonie spasmodique et la paralysie bilatérale du nerf laryngé récurrent 20 , 21 . L'hydrogel d'acide hyaluronique est un autre injectable, qui est utilisé pour traiter l'affection des plis vocaux et l'insuffisance glotale 22 , 23 . La laryngoplastie par injection peut être utilisée pour traiter une variété de troubles de la communication 24 . Ces méthodes d'injection directe sont prometteuses pour améliorer la fonction vocale et la déglutition dans les populations vieillissantes.
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Protocol
Utilisez les rats mâles Fischer 344-Brown Norway à 6 et 30 mois pour ce protocole. Les rats ont été obtenus auprès de la colonie de rongeurs de l'Institut national de vieillissement. Nous avons utilisé des rats pour cette étude parce que la structure du larynx de rat est similaire à celle de l'humain, servant fonctionnellement pour la protection des voies respiratoires et les vocalisations spécifiques aux espèces. Cette étude a été réalisée conformément à la Politique de PHS sur les soins de santé et l'utilisation des animaux de laboratoire, Le Guide NIH pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et la Loi sur le bien-être animal (7 USC et suivants); Le protocole d'utilisation des animaux a été approuvé par le Comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université du Kentucky.
1. Anesthésie des rats
- Préparer les anesthésiques en mélangeant du chlorhydrate de kétamine (anesthésie dissociative) et du chlorhydrate de xylazine (sédatif et analgésique) dans une solution saline tamponnée. Les concentrations de kétamine et de xylazine dans la solution finale sont de 100 mg / 8 mg par kgPoids corporel respectivement.
- Injecter les anesthésiques dans le rat par administration intrapéritonéale en utilisant une seringue à l'aiguille de 25 G.
- Déterminer que le rat est suffisamment anesthésié en pinçant l'orteil ou le pied avec une pince. Si le rat ne réagit pas au pincement, la chirurgie peut commencer. Si le rat réagit à la pincée de l'orteil avec des contractions réflexes ou musculaires, attendez 1-2 minutes et répétez le test de pincement. Si le rat réagit à nouveau, remplacez le rat par un nouvel animal et répétez la procédure à partir de l'étape 1.2.
- Appliquer une pommade ophtalmique aux yeux du rat, après que le rat est immobile, pour éviter que les cornées ne se dessèchent.
2. Implantation de pompe osmotique
- Placez le ventral du rat sur la zone chirurgicale aseptique. Administrer le meloxicam comme médicament pré-anesthésique. Administrer par voie intrapéritonéale à une dose de 1 à 4 mg / kg de poids corporel à l'aide d'une seringue à l'aiguille de 25 G.
- Utilisez des tondeuses pour enlever une approximationUn carré de fourrure de 1 "x 1" du dos du cou et environ 1 "d'espace caudal entre les épaules. Raser le plus près possible de la peau.
- Mouiller le dos et le cou avec de l'éthanol désinfectant (70%).
- Après le rasage, frottez l'aspect dorsal du cou avec 3 gommages en succession d'alcool iodé avec de l'alcool.
- Maintenir la température corporelle du rat en le plaçant sur un coussin chauffant réglé à 34 ° C.
- Remplissez les pompes osmotiques préparées de manière aseptique avec 50 μL de NTF4 ou solution saline pour le traitement NTF4 systémique ( Figure 1 ).
- Utilisez un scalpel pour faire une incision horizontale d'environ 2 cm de large dans la peau, juste crânienne dans l'espace entre l'omoplate. Soulevez le bord postérieur de l'incision avec une pince avec une seule main tout en insérant la pointe des hémostats et en poussant doucement à la suite de l'incision.
- Après que la pointe des hémostats soit d'environ 2 cm cCourants à l'incision, ouvrez les poignées sur les hémostats, élargissant les pointes pour former une "poche" creuse sous-cutanée sur le site de l'incision. Ce sera le site de placement de la pompe.
- Orientez le portail de livraison de la pompe avant d'être inséré pour minimiser toute interaction du NTF4 et la guérison du site d'incision de poche.
- Livrer 50 μL de solution saline NTF4 pendant 7 14 jours. Le groupe de 7 jours a reçu 6,72 mg / jour de NTF4 pour une dose totale de 47,04 mg. Le groupe de 14 jours a reçu 6,72 mg / jour pour une dose totale de 94,08 mg de NTF4 25 .
- Utilisez un fil de suture en nylon 5-0, des hémastes et des pinces pour fermer l'incision pour le placement de la pompe.
- Observez les rats pendant au moins 30 minutes à mesure qu'ils se remettent de l'anesthésie. Les critères d'achèvement de la surveillance incluent l'animal en train de devenir actif, le déplacement de la cage, l'eau potable et le début d'autres activités normales telles que le toilettage.
- Surveiller les animaux tous les joursPendant la première semaine en observant la cicatrisation du site chirurgical, la consommation normale d'alimentation et d'eau, le passage d'urine / excréments et tout signe de comportement anormal du stress, de la douleur ou d'autres complications post-opératoires.
- Si le rat semble souffrir ou détresse, fournir au rat une injection sous-cutanée de 5 mg / kg de carprofène une fois toutes les 24 h pendant 5 jours pour soulager la douleur.
- S'il semble y avoir une infection, consultez un vétérinaire afin de s'assurer que la plaie se guérit correctement.
- Selon le groupe expérimental sur lequel le rat est entré, enlever la suture de nylon 5-0 7-10 jours après la chirurgie pour éviter l'irritation du fil.
3. Anesthésie des rats pour injection directe
- Retenir les aliments des rats la veille de la procédure. Cela garantit qu'il n'y a pas de nourriture pour bloquer l'endoscope ou l'aiguille d'injection.
- Peser les rats et préparer l'accepromazine 1-2 mg / kg de poids corporel. Injecter par voie intramusculaire (l'emplacement IM est leMuscle thyroaryténoïde gauche).
- Placez le rat dans la boîte d'induction. Induire l'anesthésie dans la boîte d'induction avec 5% d'isoflurane et 1 LO 2 .
- Déplacez le rat à un cône de nez avec 2% d'isoflurane et 600 ml de O 2 .
- Déterminer que le rat est suffisamment anesthésié en pinçant l'orteil ou le pied avec une pince. Si le rat ne réagit pas au pincement, le protocole d'injection peut commencer. Si le rat réagit à la pincée de l'orteil avec des contractions réflexes ou musculaires, attendez 1-2 minutes et répétez le test de pincement. Si le rat réagit à nouveau, remplacez le rat par un nouvel animal et répétez la procédure à partir de l'étape 3.4.
4. Injection directe et visualisation
- Placer des doses de 50 μL préparées de manière aseptique contenant du NTF4 ou une solution saline dans un bain de H 2 O réglé à 25 ° C pendant 30 minutes avant l'injection.
- Placez le rat en position couchée et couchée sur une plate-forme en plexiglas ( figure 2 ). SusPendent le rat dans la position inclinée à partir de leurs incisives supérieures frontales par un fil de guidage accroché sur le dessus de la plate-forme.
- Fixez une seringue de 50 mm, 30 jauges, 100 μL à un endoscope sinusal de 1,9 mm, 30 ° ( Figure 3 ).
REMARQUE: L'ensemble de la seringue est fixé par un gabarit qui maintient fermement la canule à la paroi externe de l'endoscope. L'endoscope permet de visualiser les plis vocaux et le guidage de la seringue par voie intra-orale. La position de la pointe de la canule est ajustée avant chaque animal pour s'assurer que la pointe est complètement et clairement visible via la vue endoscopique ( Figure 4 ). - Utilisez une pince à pointe en caoutchouc pour étendre la langue et la déplacer latéralement. Ensuite, insérez un spéculum en plastique pour maintenir la perméabilité par voie orale. Faire le spéculum d'un cylindre de seringue plastique de 5 mL qui est coupé sur une longueur de 1,5 à 2 cm, les bords découpés étant ébavurés et polis lisses.
- Éteignez les lumières dans le rooM et attacher une source de lumière halogène à l'endoscope. Activez le magnétoscope pour capturer la procédure.
- Immergez l'extrémité distale de l'endoscope dans de l'eau tiède pendant quelques secondes pour minimiser le développement de la condensation sur la pointe du verre lorsqu'il est inséré dans la bouche du rat.
- En utilisant le retour visuel du moniteur, orientez soigneusement l'aiguille vers la zone du pli vocal gauche.
- Temps d'injection de la solution avec la phase inspiratoire du cycle de respiration des animaux pour accéder pleinement au pli vocal. Pendant la phase inspiratoire de la respiration, le pli vocal est pleinement exposé.
- Une fois que le pli vocal est complètement visible, insérez l'aiguille dans le thyroarythénoïde gauche, qui se trouve latéralement au bord médian blanc du pli vocal. Avec l'aiguille en place, transmettre l'injecte par dépression de la seringue.
- Éteignez la source de lumière halogène sur l'endoscope et le lecteur vidéo, et tournez-vous sur le roOm lights.
- Retournez le rat à sa cage de maison et placez-le sur un coussin chauffant.
- Laisser le rat se rétablir avant de le retirer du coussin chauffant. Remplacez les aliments et l'eau dans la cage.
- Surveiller les rats pendant 7 jours après l'injection puis l'euthanasier. Supprimer les larynges pour la cryotypie 24 .
5. Euthanisation des rats
- Anesthésier les rats avec du chlorhydrate de kétamine et du chlorhydrate de xylazine (100 mg / 8 mg par kg d'injection intrapéritonéale injectée par le poids corporel).
- Éuthaniser par une exsanguination suite à une thoracotomie médiale.
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Representative Results
Les rats ont été euthanasiés après 2 semaines de perfusion de pompe osmotique ou 1 semaine après injection directe de NTF4. Les larynges ont été récoltés, placés en cryoprotecteur (30% de saccharose et 70% de solution salée tamponnée au phosphate), puis séchés en série sur 10 μm de large avec un cryostat. Le vieillissement des muscles laryngés est affecté par l'administration de NTF4 25 . En plus du rat jeune et ancien, nous avons comparé le côté injecté et non injecté des muscles thyroaryténoïdes. En règle générale, nous voyons une modification de la taille de la fibre avec l'âge, qui varie en fonction de la voie d'administration de NTF4 ( figure 5 ). Moins de fibrose est également observée qualitativement après le traitement. Le pourcentage de fibres dénervées diminue avec l'application systémique et directe de NTF4 chez des rats âgés ( figure 6 ). La quantité de NMJ augmente également ( figure 7 ). La signification de cette augmentation de Dépend de la durée du traitement ou de la voie d'administration.
Figure 1: image représentative de la pompe osmotique. Après avoir rempli la pompe avec NTF4, le modérateur d'écoulement est inséré dans le corps principal pour sceller la pompe.
Figure 2: Plate-forme pour la procédure d'injection. Le rat est placé en position couchée sur la plate-forme et suspendu par les incisives supérieures frontales via un fil guide monté sur le dessus de la plate-forme. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Figure 3: Image représentative de la seringue. Remplir la seringue avec NTF4 et un mélange salé. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Procédure d'injection. ( A ) La seringue est couplée à un endoscope de 19,9 mm à 30 ° (montré); (B) La lumière optique est vérifiée pour s'assurer qu'il y a de la lumière pour la procédure; ( C ) La vidéo en temps réel garantit que l'aiguille est guidée au bon endroit.
Figure 5: Changements dans la taille de la fibre et la morphologie. Représentant, ilLes sections colorées par de la matoxyline et de l'éosine de NTF4 système 7 jours traités (à droite) et les muscles thyroaryténoïdes non traités (à gauche) à 30 mois 26 , 27 , 28 ans . Il y a une augmentation de la taille de la fibre du contrôle aux animaux traités. Le traitement par NTF4 modifie la taille de la fibre de 30 Mo à celle d'un animal de 6 mois plus jeune. * P <0,05 contre 30 mois (les images ont été capturées à un grossissement de 40X; Barre d'échelle = 25 μm, P <0,001). Les flèches dans le point d'image supérieur vers une zone de fibrose. Il existe également une diminution qualitative de la fibrose chez les animaux traités. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6: Changements dans l'intérieurVations avec traitement NTF4. Les sections colorées Nav1.5 représentatives des muscles traumatiques systémiques NTF4 de 14 jours traités (à droite) et non traités (à gauche) à 30 mois (les images ont été capturées à un grossissement de 40X, Barre d'échelle = 25 μm) 29 . Il existe une réduction de la dénervation avec l'âge par l'étiquetage Na v 1.5 (vert). Le panneau de gauche est représentatif Na v 1.5 (vert) et phalloidine, pour désigner les sections colorées (rouges) des muscles thyroaryténoïdes non traités, le panneau droit est traité par les muscles. L'insert vert est une coloration Na v 1.5 seule.
Figure 7: Changements dans les NMJ avec traitement NTF4. Des images représentatives de microscopie de fluorescence de NMJ provenant de sections musculaires thyroaryténoïdes thérapeutiques NTF4 systémiques de 14 jours provenant de différents animaux marqués avec α-bungarotoxine (vert) etPhalloidine (rouge) montrant que le nombre NMJ augmente avec le traitement NTF4 à 30 mois (Barre d'échelle = 25 μm), (P <0,001) 11 .
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Discussion
Les muscles laryngés sont vulnérables aux effets défavorables du vieillissement. Des études antérieures ont démontré des changements dans les muscles laryngés vieillissants qui incluent des changements dans la taille de la fibre, le nombre total de fibres, la capacité de régénération, la taille NMJ et les changements de quantité, en plus des variations de la fonction contractile et des changements d'isoforme de myosine 4 , 11 , 27 , 30 , 31 . Le vieillissement du muscle laryngien peut être modifié par l'application de neurotrophines. Ces changements peuvent facilement être mesurés. Par conséquent, les muscles laryngés du rat fournissent un modèle utile pour étudier les effets du vieillissement et des maladies / troubles vocaux. L'étude de ces muscles peut également aider à développer des interventions ou des processus de protection chez le vieillissement humain.
Notre méthode d'application systémique ou directe de NTF4 produit une réponse de remodelage dans le vieillissement du larynx du ratmuscles. Cela démontre que les neurotrophines peuvent avoir un potentiel thérapeutique sur le dysfonctionnement musculaire lié au vieillissement. L'application directe de neurotrophines peut facilement être traduite au modèle humain du vieillissement vocal par des vecteurs d'injection 25 .
Il faut tenir compte de nombreux facteurs lors de l'utilisation du protocole d'injection. Tout d'abord, il faut veiller à éviter les rayures et les blessures des tissus mous autour du vestiaire laryngé, compte tenu du fait que la pointe de l'endoscope a une aiguille pointue attachée. Deuxièmement, le chronométrage du mouvement de la pointe de l'aiguille dans le larynx pendant la phase inspiratoire du cycle respiratoire des animaux prend des mesures pour durer avec précision l'injection. Troisièmement, assurez-vous que la pointe de l'aiguille est clairement visible avant d'essayer la procédure en inspectant visuellement l'appareil sur le moniteur de l'ordinateur au préalable. Quatrièmement, réchauffer la pointe de l'endoscope dans de l'eau chaude pendant quelques secondes est une étape importante pour s'assurer que le brouillard de l'endoLa pointe de portée est évitée. Enfin, il est également important de relancer le rat la nuit avant toute procédure de détermination de la portée. Si les aliments ne sont pas retenus, il est très probable qu'ils auront encore des résidus alimentaires dans le pharynx, ce qui rend la procédure d'injection pratiquement impossible à réaliser. Les rats devraient être inspectés pour détecter les signes de déshydratation quotidienne et pesés pour s'assurer qu'il n'y a pas de perte de poids significative (plus de 10% du poids corporel).
Deux étapes essentielles dans le développement du protocole étaient la fixation de la seringue à l'endoscope et l'utilisation d'un spéculum oral. L'ancrage ferme de l'assemblage de la seringue était nécessaire pour faciliter l'opération d'une seule main pour l'insertion et l'injection de la portée. Compte tenu des objectifs de l'étude, en l'absence de visualisation directe pour guider l'injection du pli vocal, l'expérience n'a pas pu être réalisée. En outre, la création d'un spéculum oral a été jugée importante pour empêcher la langue de se déplacer et de maintenirE epiglottis ouverte tout au long de la procédure.
La méthode d'injection guidée visuellement a été plusieurs cycles de modification principalement liés à la recherche du moyen optimal d'ancrage sécurisé de la seringue et de l'aiguille à l'endoscope. Après avoir testé plusieurs formes différentes d'adhésifs à bande, on a constaté que le ruban athlétique élastique disponible dans le commerce était le meilleur moyen d'ancrer la seringue sur le corps de l'endoscope.
La plus grande limitation de la méthode d'injection guidée visuellement n'était pas liée à l'instrumentation, mais plutôt à la nécessité d'avoir un pharynx breveté et une voie aérienne. Bien que, restreignant les aliments pendant 24 heures avant la procédure résolue la plus grande partie de ce problème, les rats ingéreront quelque chose dans leurs cages, y compris la literie et les excréments. Lorsque cela s'est produit, il y avait deux solutions: (1) reporter l'injection jusqu'à ce que l'animal efface naturellement son pharynx, ou (2) essayer d'enlever manuellement le blocage à l'aide d'une pince. C'était notre expérienceE, que la première était la meilleure option car elle réduisait le risque de blessures potentielles dans la région du pharynx de l'animal.
Compte tenu de la nouveauté de ce protocole et de la nécessité d'injecter directement le pli vocal avec le composé, il n'existe pas d'autres méthodes fiables. Compte tenu de la petite taille du système laryngé des animaux, une injection guidée visuellement à travers la région orale et pharyngée de la seule façon d'assurer un placement correct et cohérent du composé dans l'animal vivant. Le seul autre moyen d'injecter directement le pli vocal était de tenter de le faire à partir d'une position externe à travers la peau et le cartilage du larynx. Bien que cette méthode soit réalisée avec succès chez les humains qui subissent des traitements contre la toxine botulinique pour atténuer les dystonies laryngées, les méthodes d'injection transcutanée ne sont pas réalisables chez les petits animaux.
La technique est robuste et peut être utilisée non seulement pour l'injection du pli vocal, mais aussi pour les sites d'injection au sein deLes régions pharyngée et orale. En outre, la méthode peut être adaptée pour une surveillance visuelle simple de la région pharyngée et laryngée des animaux en retirant la seringue.
En résumé, cette méthode d'injection est un moyen novateur d'étudier les mécanismes biologiques liés au traitement des dysfonctions vocales liées au vieillissement chez l'homme. Cette méthode a également le potentiel d'être appliquée à d'autres modèles de maladies qui affectent la voix, la fonction vocale, la communication et la déglutition chez les humains.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de l'Institut national sur la surdité et autres troubles de la communication (R21DC010806 à CAM et JCS et R01DC011285 à CAM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurotrophin 4 | Pepro Tech | 450-04 | 200 ng in 50 μL |
| Alzet Osmotic Pump | DURECT Corporation | 2001D | |
| 30 ° endoscope | Stoltz | 61029D | |
| 50 mm 30 gauge 100-μL syringe | Hamilton | 84850 and 201812 | |
| saline (sodium chloride solution) | Sigma-Aldrich | S8776 | |
| ketamine hydrochloride | Henry Schein | 56344 | |
| xylazine hydrochloride | Henry Schein | 33198 | |
| 25 G 5/8 needle | Becton-Dickinson | 305901 | |
| 1 mL syringe | Becton-Dickinson | 309659 | |
| ophthalmic ointment | Henry Schein | 8897 | |
| clippers | Oster | 44-018 | |
| ethanol | Decon | 2716 | |
| iodine (Betadine) | Purdue Pharma L.P. | 606404 | |
| heating pad | Sunbeam | 731-5 | |
| 5-0 nylon suture thread | AD Surgical | PMN-518R6 | |
| crile hemostat | Fine Science Tools | 13005-14 | |
| delicate suture tying forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| meloxicam | Henry Schein | 49756 | |
| carprofen | Merritt Veterinary Supplies | 148700 | |
| antibiotic ointment | Henry Schein | 57110 | |
| acepromizine Aceproject | Henry Schein | 3845 | |
| isoflurane Isothesia | Henry Schein | 50033 | |
| induction box (anesthetizing box) | Harvard Apparatus | 50-0116 | |
| oxygen compressed tank | Scott Gross | UN1072 | |
| plexiglas platform | Small Parts Inc (Amazon) | ||
| rubber tipped forceps | Fine science tools rubber | 11075-00 | |
| liquid rubber for forceps above | Lowe's | 42518 | |
| plastic spectula (BD syringe cut to length) | Becton-Dickinson | 309659 | |
| halogen light source rhino-laryngeal stroboscope | Kay-Pentax | RLS 9100 B | |
| video recorder | Kay-Pentax | ||
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-500G | |
| phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| cryostat Mictotom HM525 | Thermo Scientific | HM 525 | |
| Gill 1 hematoxylin | VWR | 10143-142 | |
| Shandon eosin-Y alcoholic | Thermo Fisher Scientific | 6766007 | |
| anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | S0819 | |
| Texas red-X phalloidin | Sigma-Aldrich | T7471 | |
| alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | B-13422 | |
| Small animal anaesthesia machine | Smiths Medical | CDS 9000 |
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