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Developmental Biology

चमड़े के नीचे न्यूरोट्रोफिन 4 आसमाटिक पंप्स या डायरेक्ट पेशी इंजेक्शन का उपयोग करने वाली आसव

Published: June 13, 2017 doi: 10.3791/55837
Automatic Translation
1, 1, 2, 2
1Department of Rehabilitation Sciences, University of Kentucky, 2Department of Physiology, University of Kentucky

Summary

यहां, हम न्यूरोट्रॉफ़िन 4 (एनटीएफ 4) के प्रयोग को व्यवस्थित और सीधे चूहे की उम्र बढ़ने वाले लेरिंजल मांसपेशियों को फिर से तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल पेश करते हैं।

Abstract

बुजुर्गों में वृद्धावस्था में शिथिलता विकलांगता का एक प्रमुख कारण है, आवाज विकारों से डिस्फागिया और वायुमार्ग सुरक्षात्मक सजगता का नुकसान। कुछ, यदि कोई हो, तो उपचार मौजूद होता है जो लक्ष्य आयु-संबंधित लारेंग्जल मांसपेशियों में शिथिलता है। न्यूरोट्रोपिन मांसपेशियों में स्थिरता और न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों (NMJs) के भेदभाव में शामिल हैं। ऐसा माना जाता है कि न्यूरोट्रोपिन न्यूरोट्रांसमीटर रिलायंस बढ़ाने से न्यूरोमस्कुलर ट्रांसमिशन को बढ़ाते हैं। कार्यात्मक झुकाव के सबूत के साथ, स्नायोस्कुलर जंक्शनों (एनएमजे) वृद्धावस्था में चूहे की गोलाकार मांसपेशियों में छोटे और कम प्रचुर मात्रा में होते हैं। भविष्य में नैदानिक ​​उपयोग के लिए हमने एनटीएफ 4 के प्रभावों का पता लगाया है ताकि एक चिकित्सक के रूप में उम्र बढ़ने के मानवीय गोलाकार मांसपेशियों में समारोह में सुधार किया जा सके। यहां, हम NTF4 आवेदन के जवाब में रीमोडल के लिए उम्र बढ़ने वाली चूहे लेरिंजल मांसपेशियों की क्षमता की जांच करने के लिए प्रणालीगत आवेदन और NTF4 के प्रत्यक्ष इंजेक्शन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस पद्धति में, चूहों को या तो NT के माध्यम से या तो व्यवस्थित रूप से प्राप्त हुआमुखर सिलवटों के माध्यम से टकराव पंप या प्रत्यक्ष इंजेक्शन द्वारा लारिंवल की मांसपेशियों को तब विच्छेदित किया गया था और आकारिकी और आयु से संबंधित घनत्व के ऊतक विज्ञान परीक्षा के लिए इस्तेमाल किया गया था।

Introduction

लारिन्जियल मांसपेशियों को तेजी से और लगातार अनुबंध करते हैं, और बुढ़ापे के प्रतिकूल प्रभावों के प्रति कमजोर होते हैं। 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 के 65 वर्ष से अधिक उम्र के व्यक्तियों में मनाया जाने वाली समस्याओं या डसैफियाइज की आवाज में योगदान करने के लिए इस निरंतर गतिविधि का योगदान माना जाता है। कई आणविक और पैथोफिसियोलोगिक तंत्र इस आयु से संबंधित रोगों में योगदान करते हैं। इन तंत्रों में लेरिंजल श्लेष्मा, मांसपेशी फाइबर शोष या हानि, मांसपेशी फाइबर उत्थान या शोष की कमी शामिल है जो मुखर परतों को झुकाते हैं और 8 , 9 , 10 , 11 को बंद करने की असमर्थता को शामिल कर सकते हैं। इस समय कोई सिद्ध चिकित्सा चिकित्सा उपलब्ध नहीं हैइन मांसपेशियों में इन उम्र से संबंधित परिवर्तनों को रोक या पुनर्स्थापना।

न्यूरोमस्कुलर ट्रांसमिशन की प्रभावशीलता का मॉड्यूलेशन, न्यूरोमोटर प्रदर्शन को बहुत प्रभावित कर सकता है। न्यूरोट्रोफिन्स के परिवार में तंत्रिका वृद्धि कारक (एनजीएफ), मस्तिष्क प्राप्त तंत्रिका वृद्धि कारक (बीडीएनएफ), न्यूरोट्रोफिन 3 (एनटीएफ 3) और एनटीएफ 4 12 , 13 शामिल हैं । न्यूरोट्रोपिन को अन्तर्ग्रथनी प्रभावकारिता 1 , 4 को विनियमित करने के लिए दिखाया गया है। हेपेटोसाइट विकास कारक, विकास कारक बीटा और फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक को बदलने में हाल ही में मुखर घावों के इलाज के लिए मनुष्यों में 15 से 17 का उपयोग किया गया है । NTF4 भी एनएमजे प्रभावशीलता को नियंत्रित करता है; एनटीएफ 4 शो की कमी के कारण एनएमजेएस 11 , 18 , 1 9 को अलग किया गया । इन अध्ययनों से दावतों के बढ़ते प्रभाव का कारण बनता हैवृद्धावस्था में लेरिंजल मांसपेशी विकारों की वृद्धि और विकास कारकों के साथ झुकाव

मुखर सिलवटों के ऊतकों को डायरेक्ट इंजेक्शन चिकित्सा विज्ञान मनुष्यों में अभूतपूर्व नहीं हैं। उदाहरण के लिए, बोटिलिनम विष के स्थानीय इंजेक्शन वर्तमान में तंत्रिका संबंधी आंदोलन संबंधी विकारों के लिए एक प्रभावी उपचार के रूप में उपयोग किया जाता है जो गला में मांसपेशियों को प्रभावित करता है, जैसे कि ऐंस्पामोलिक डिस्फोनिया और द्विपक्षीय आवर्तक लारेंजेल नर्व पक्षाघात 20 , 21 । Hyaluronic एसिड हाइड्रोजेल एक और इंजेक्शन है, जो मुखर गुना डरावना और ग्लोटटल अपर्याप्तता 22 , 23 का इलाज करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इंजेक्शन लैरींगोप्लास्टी का इस्तेमाल विभिन्न प्रकार के संचार विकारों के इलाज के लिए किया जा सकता है। इन प्रत्यक्ष इंजेक्शन विधियों में मुखर फ़ंक्शन को सुधारने और उम्र बढ़ने की आबादी में निगलने का वादा है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल के लिए नर फिशर 344-ब्राउन नॉर्वे की चूहों का उपयोग 6 और 30 महीने की उम्र में करें। चूहे नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एजिंग रोडेंट कॉलोनी से प्राप्त हुए थे हम इस अध्ययन के लिए चूहों का इस्तेमाल करते हैं क्योंकि चूहे की लारेंक्स की संरचना मानव के समान है, वायुमार्ग संरक्षण और प्रजाति-विशिष्ट स्वरिकीय कार्यों के लिए कार्यरत है। यह अध्ययन मानव स्वास्थ्य देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग पर पीएचएस नीति के अनुसार किया गया था, प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए एनआईएच गाइड, और पशु कल्याण अधिनियम (7 यूएससी एट सीक।); पशु प्रयोग प्रोटोकॉल केंटुकी के विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. चूहे के संज्ञाहरण

  1. बफर्ड खारा में केटामाइन हाइड्रोक्लोराइड (डिसोसिएेटिव एनेस्थेटिक) और एक्सयलैजैन हाइड्रोक्लोराइड (शामक और एनाल्जेसिक) मिश्रण करके एनेस्थेटिक्स तैयार करें। अंतिम समाधान में केटामाइन और एक्सलायलिन की सांद्रता 100 मिलीग्राम / 8 मिलीग्राम प्रति किलो हैशरीर का वजन क्रमशः
  2. एक 25 जी सुई के साथ एक सिरिंज का प्रयोग करके इंटराटेरिटोनियल एडमिनिस्ट्रेशन द्वारा एन्थिथिक्स को चूहा में लेना
  3. निर्धारित करें कि चूहे को संदंश के साथ पैर या पैर को छानने के लिए पर्याप्त रूप से anesthetized किया जाता है। यदि चूहे चुटकी पर प्रतिक्रिया नहीं करता है, तो शल्य चिकित्सा शुरू हो सकती है। यदि चूहे पलटा या मांसपेशियों के संकुचन के साथ पैर की अंगुली की चुटकी पर प्रतिक्रिया करता है, तो 1-2 मिनट प्रतीक्षा करें और चुटकी परीक्षण को दोहराएं। यदि चूहे ने फिर से प्रतिक्रिया दी है, तो चूहे को एक नया जानवर और दोहराने की प्रक्रिया को कदम 1.2 से प्रारंभ करें।
  4. चूहे की आंखों में नेत्र आंखे लगाने के बाद, चूहे स्थिर नहीं होने के कारण कॉर्निया को सूखने से रोकने के लिए।

2. Osmotic पंप आरोपण

  1. सड़न रोकनेवाला शल्य चिकित्सा क्षेत्र पर चूहे उदर प्लेस। मैनेक्सीकैम को प्रीनेस्टेसियल दवा के रूप में प्रशासन करना 25 जी सुई के साथ एक सिरिंज का उपयोग करके 1-4 मिलीग्राम / किग्रा के शरीर के वजन के खुराक पर इंट्राटेरिटोनियल रूप से प्रशासन करें।
  2. एक अनुमानित निकालने के लिए कतरनी का उपयोग करेंगर्दन के पीछे से 1 "एक्स 1" फर का वर्ग, और लगभग 1 "कंधों के बीच अंतरिक्ष का दुल्हन। संभव के रूप में त्वचा के करीब दाढ़ी।
  3. इथेनॉल (70%) disinfecting के साथ पीठ और गर्दन गीला
  4. शेविंग के बाद, शराब के साथ आयुध-शराब के खत्म होने के बाद 3 स्क्रब्स के साथ गर्दन के पृष्ठीय पहलू को साफ़ करें।
  5. चूहे के शरीर का तापमान 34 डिग्री सेल्सियस पर सेट किए गए हीटिंग पैड पर रखकर बनाए रखें
  6. सिस्टमिक एनटीएफ 4 उपचार ( चित्रा 1 ) के लिए 50 μL NTF4 या खारा के साथ असम्बद्ध रूप से तैयार किए गए आसमाटिक पंपों को भरें।
    1. त्वचा के माध्यम से एक क्षैतिज चीरा लगभग 2 सेमी चौड़ा करने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें, केवल scapulae के बीच अंतरिक्ष के लिए कपाल। एक हाथ के साथ संदंश के साथ चीरा के पीछे की ओर बढ़ो और ऊपरी हिस्से की टिप डालने और धीरे-धीरे चीरा के पीछे पीछे की तरफ खींचें।
    2. हेमोस्टैट्स की नोक लगभग 2 सेंटीमीटर सी हैचीयस के लिए रियालियल, चीरों के लिए एक खोखले "जेब" चमड़े के नीचे बनाने के लिए युक्तियों का विस्तार, हेमोस्टैट्स पर हैंडल खोलें। यह पंप के लिए प्लेसमेंट साइट होगी।
  7. एनटीएफ 4 की किसी भी बातचीत को कम करने और जेब चीरा साइट के उपचार को कम करने के लिए पंप वितरण पोर्टल की ओरिएंट पहले प्रविष्टि करने पर।
  8. या तो 7 14 दिनों के लिए 50 μL NTF4 लवण वितरित करें। 7 दिन के समूह को 47.04 मिलीग्राम की कुल खुराक के लिए एनटीएफ 4 के 6.72 मिलीग्राम / दिन का लाभ मिला। एनटीएफ 4 25 की 94.08 मिलीग्राम की कुल खुराक के लिए 14-दिन के समूह को 6.72 मिलीग्राम / दिन का लाभ मिला।
  9. पंप प्लेसमेंट के लिए बने चीरा को बंद करने के लिए 5-0 नायलॉन सिवनी धागा, हेमोस्टैट्स और संदंश का प्रयोग करें।
  10. चूहे को न्यूनतम 30 मिनट के लिए निरीक्षण करें क्योंकि वे संज्ञाहरण से उबर गए हैं। निगरानी के पूरा होने के लिए मानदंड में जानवर सक्रिय हो जाते हैं, पिंजरे, पीने के पानी के बारे में बढ़ रहा है, और अन्य सामान्य गतिविधियां जैसे कि सौंदर्य को शुरू करना शामिल है।
  11. दैनिक जानवरों की निगरानी करेंसर्जिकल साइट, सामान्य फीड और पानी की खपत और मूत्र / मल के गुजर, और तनाव, दर्द या अन्य पोस्ट-ऑपरेटिव जटिलताओं के किसी भी असामान्य व्यवहार के लक्षणों को देखकर पहले सप्ताह के लिए।
  12. यदि चूहे दर्द या संकट में प्रतीत होता है, दर्द को दूर करने के लिए 5 दिन में प्रत्येक 24 घंटे के लिए कारप्रोफेन के 5 मिलीग्राम / किग्रा के चमड़े के नीचे के इंजेक्शन के साथ चूहे प्रदान करें।
  13. यदि कोई संक्रमण प्रतीत होता है, तो यह सुनिश्चित करने के लिए एक पशुचिकित्सा से परामर्श करें कि घाव ठीक से भर देता है
  14. धागा से जलन को रोकने के लिए सर्जरी के 5-10 नायलॉन सीवन को 7-10 दिनों के बाद में जो प्रायोगिक समूह में चूहा लगा रहता है, उसके आधार पर।

3. सीधे इंजेक्शन के लिए चूहे की संज्ञाहरण

  1. प्रक्रिया से पहले रात को चूहों से खाना रोकें यह सुनिश्चित करता है कि एन्डोस्कोप या इंजेक्शन सुई को ब्लॉक करने के लिए कोई भोजन नहीं है।
  2. चूहों का वजन और एसिप्रोमियम 1-2 मिलीग्राम / किग्रा के शरीर का वजन तैयार करें। Intramuscularly इंजेक्षन (आईएम स्थान हैछोड़ दिया thyroarytenoid मांसपेशियों)
  3. प्रेरण बॉक्स में चूहा रखें 5% isoflurane और 1 लो 2 के साथ प्रेरण बॉक्स में संज्ञाहरण प्रेरित करें।
  4. चूहे को नाक शंकु में 2% आईसोफ्लुरेन और 600 एमएल ओ 2 के साथ ले जाएं।
  5. निर्धारित करें कि चूहे को संदंश के साथ पैर या पैर को छानने के लिए पर्याप्त रूप से anesthetized किया जाता है। यदि चूहे चुटकी पर प्रतिक्रिया नहीं करता है, तो इंजेक्शन प्रोटोकॉल शुरू हो सकता है। यदि चूहे पलटा या मांसपेशियों के संकुचन के साथ पैर की अंगुली की चुटकी पर प्रतिक्रिया करता है, तो 1-2 मिनट प्रतीक्षा करें और चुटकी परीक्षण को दोहराएं। यदि चूहे ने फिर से प्रतिक्रिया दी है, तो चूहे को एक नया जानवर और दोहराने की प्रक्रिया को चरण 3.4 से प्रारंभ करें।

4. प्रत्यक्ष इंजेक्शन और विज़ुअलाइज़ेशन

  1. इंजेक्शन से पहले 30 मिनट तक 25 डिग्री सेल्सियस पर सेट ए एच 2 ओ बाथ में एनटीएफ 4 या खारा युक्त अस्वाभाविक रूप से तैयार 50-μL खुराक रखें।
  2. चूहे को एक लापरवाह और एक पिक्सीग्लैस प्लेटफॉर्म ( चित्रा 2 ) पर रिक्त स्थिति में रखें। Susप्लेटफॉर्म के शीर्ष पर एक मार्गदर्शक तार के माध्यम से अपने ललाट टॉप इन्सियर्स की ओर से रिक्ति की रस्सी को चूना।
  3. एक 50 मिमी, 30 गेज, 100 μL सिरिंज को 1.9 मिमी, 30 डिग्री साइनस एंडोस्कोप ( चित्रा 3 ) में संलग्न करें।
    नोट: सिरिंज असेंबली एक जिग के माध्यम से जुड़ी हुई है जो कैनोला को एंडोस्कोप की बाहरी दीवार तक मजबूती से रखती है। एंडोस्कोप आंतरिक स्वर के मुखर सिलवटों के मार्गदर्शन और मार्गदर्शन के लिए अनुमति देता है। प्रवेशसूत्र की टिप की स्थिति प्रत्येक पशु से पहले समायोजित की जाती है यह सुनिश्चित करने के लिए कि टिप एन्डोस्कोपिक दृश्य ( चित्रा 4 ) के माध्यम से पूरी तरह से और स्पष्ट रूप से दिखाई दे।
  4. जीभ का विस्तार करने के लिए एक रबर-दबाया संदंश की जोड़ी का प्रयोग करें और उसे बाद में स्थानांतरित करें। इसके बाद, मौखिक परिपालन बनाए रखने के लिए एक प्लास्टिक की सिकुड़ियां डालें। एक 5 मिलीलीटर प्लास्टिक सिरिंज बैरल से चपटा बनाओ जो 1.5 से 2 सेंटीमीटर की लंबाई तक काटा जाता है, कट किनारों के साथ कमजोर और पॉलिश चिकनी
  5. रू में रोशनी बंद करेंएंडोस्कोप के लिए मील और एक हलोजन प्रकाश स्रोत संलग्न। प्रक्रिया को पकड़ने के लिए वीडियो रिकॉर्डर चालू करें।
  6. चूहे के मुंह में डालने के दौरान कांच की टिप पर संक्षेपण के विकास को कम करने के लिए कुछ सेकंड के लिए गर्म पानी में एंडोस्कोप के बाहर का अंत विसर्जित करें।
  7. मॉनिटर से विज़ुअल फीडबैक का उपयोग करना, बाईं ओर के मुखर गुना के क्षेत्र में सुई को ध्यान से निर्देशित करें।
  8. जानवरों के श्वसन चक्र के प्रेरक चरण के साथ समाधान के इंजेक्शन का समय पूरी तरह मुखर गुना तक पहुंचने के लिए। श्वसन के प्रेरक चरण के दौरान मुखर गुना पूरी तरह से उजागर होता है।
    1. मुखर गुना पूरी तरह से एक बार दिखाई देने पर, बाएं थेरोरेटेनोइड में सुई डालें, जो मुखर गुना की सफेद औसत दर्जे का किनारा है। जगह में सुई के साथ, सिरिंज के अवसाद के माध्यम से इंजेक्शन देने।
  9. एन्डोस्कोप और वीडियो प्लेयर पर हलोजन प्रकाश स्रोत को बंद करें, और ro पर वापस जाएंओम लाइट्स
  10. चूहा अपने घर के पिंजरे पर लौटें और हीटिंग पैड पर रखें।
  11. चूहे को हीटिंग पैड से हटाने से पहले ठीक होने दें। पिंजरे में भोजन और पानी को बदलें
  12. इंजेक्शन के 7 दिनों के बाद चूहों पर मॉनिटर करें और उसके बाद एउथैनैज करें। Cryosectioning 24 के लिए लैरींजेस निकालें

5. चूहे के ईथनीकरण

  1. केटामाइन हाइड्रोक्लोराइड और एक्सयलैनीज हाइड्रोक्लोराइड (100 मिलीग्राम / 8 मिलीग्राम प्रति किलोग्राम शरीर का वजन इंटरेपेरेटोनियल इंजेक्शन इंजेक्शन) के साथ चूहों को anesthetize करें।
  2. एक औसत दर्जे का thoracotomy निम्नलिखित exsanguination द्वारा euthanize

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Representative Results

चूहों को ओस्मोटिक पंप जलसेक के 2 सप्ताह या NTF4 के प्रत्यक्ष इंजेक्शन के 1 सप्ताह के बाद euthanized थे। लियोरीज का कटाई किया गया, क्रियोप्रोटेक्टेंट (30% सूक्रोज और 70% फॉस्फेट बफर खारा) में रखा गया था और फिर क्रिस्टोस्ट के साथ 10- माइक्रोन चौड़ाई में क्रमिक रूप से वर्गीकृत किया गया था। वृद्धावस्था में लारेंग्जियल मांसपेशियों को एनटीएफ 4 25 के प्रशासन से प्रभावित होता है युवा और बूढ़े चूहे के अलावा, हमने थायरोएरेनटेनॉयड मांसपेशियों के इंजेक्टेड और गैर-इंजेक्टेड पक्ष की तुलना की। आम तौर पर हम उम्र के साथ फाइबर आकार में परिवर्तन देखते हैं, जो एनटीएफ 4 ( चित्रा 5 ) के प्रशासन के मार्ग के आधार पर भिन्न होता है। इलाज के बाद कम फाइब्रोसिस भी गुणात्मक रूप से देखा जाता है। वृद्ध चूहों ( चित्रा 6 ) में एनटीएफ 4 के प्रणालीगत और प्रत्यक्ष अनुप्रयोग के साथ अवरुद्ध फाइबर का प्रतिशत घटता है। एनएमजे की मात्रा भी बढ़ जाती है ( चित्रा 7 )। इस वृद्धि के महत्व को डी इलाज या प्रशासन के मार्ग की लंबाई पर निर्भर करता है।

आकृति 1
चित्रा 1: Osmotic पंप की प्रतिनिधि छवि। एनटीएफ 4 के साथ पंप को भरने के बाद, पंप को सील करने के लिए प्रवाह मॉडरेटर मुख्य शरीर में डाला जाता है।

चित्र 2
चित्रा 2: इंजेक्शन प्रक्रिया के लिए प्लेटफार्म। चूहा मंच पर एक लापरवाह मुद्रा में रखा गया है और मंच के ऊपरी भाग तक घुड़सवार एक गाइड तार के माध्यम से सामने वाले ऊपरी उंगलियों द्वारा निलंबित कर दिया गया है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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चित्रा 3: सिरिंज की प्रतिनिधि छवि। एनटीएफ 4 और खारा मिश्रण के साथ सिरिंज भरें। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: इंजेक्शन प्रक्रिया। ( ए ) सिरिंज को 1 9 .9 मिमी 30 डिग्री एन्डोस्कोप (दिखाया गया) से जोड़ा जाता है; (बी) ऑप्टिक प्रकाश की जाँच की जाती है कि यह प्रक्रिया के लिए प्रकाश है; ( सी ) वास्तविक समय वीडियो यह सुनिश्चित करता है कि सुई को सही स्थान पर निर्देशित किया जाता है।

चित्रा 5
चित्रा 5: फाइबर आकार और आकृति विज्ञान में परिवर्तन वह प्रतिनिधि26 , 27 , 28 की 30 महीने की उम्र में प्रणालीगत एनटीएफ 4 7-दिवसीय उपचार (दाएं) और अनुपचारित (बाएं) थायरॉयैनटेनोइड मांसपेशियों के मटॉक्साइलिन और ईसिन सना हुआ वर्ग। इलाज के लिए पशुओं से फाइबर आकार में वृद्धि हुई है। एनटीएफ 4 के साथ उपचार 30-मो फाइबर आकार को एक छोटे 6 महीने के जानवरों में बदल देता है। * पी <0.05 बनाम 30 महीने (चित्र 40 एक्स बढ़ाई पर पकड़े गए; स्केल बार = 25 माइक्रोन, पी <0.001)। फाइब्रोसिस के क्षेत्र में शीर्ष चित्र बिंदु में तीर। इलाज वाले जानवरों में फाइब्रोसिस की गुणात्मक कमी भी है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 6
6 चित्रा: इनर में परिवर्तनNTF4 उपचार के साथ vations 30 नवंबर को सिस्टमिक एनटीएफ 4 14 दिन के इलाज (दाएं) और अनुपचारित (बाएं) थायरॉयटेनेयड मांसपेशियों से प्रतिनिधि एनवा 1.5 दाग वाले वर्ग (चित्र 40 एक्स बढ़ाई में पकड़े गए, स्केल बार = 25 माइक्रोन) 29 ना वी 1.5 लेबलिंग (हरा) द्वारा उम्र के साथ संरक्षण की कमी है। बाएं पैनल प्रतिनिधि ना वी 1.5 (हरा) और फोलोइडिन है, जो कि अनुपचारित थायरोएरेनटेनॉइड मांसपेशियों से फाइबर (लाल) दाग वाले वर्गों को निरूपित करने के लिए, सही पैनल को मांसपेशियों का इलाज किया जाता है हरे रंग का डालना ना वी 1.5 धुंधला अकेला है।

चित्रा 7
चित्रा 7: एनटीएफ 4 उपचार के साथ एनएमजे में परिवर्तन। प्रतिनिधि फ्लोरोसेंस माइक्रोकॉपी की छवियों को एनएमजे के सिस्टमिक एनटीएफ 4 14-दिन से अलग-अलग जानवरों से थेरोअरेटेनटेयड मांसपेशियों के अनुभागों का इलाज किया जाता है जो α-बंगारोटॉक्सिन (हरा) के साथ लेबल करता है औरPhalloidin (लाल) दिखा रहा है कि एनएमजे नंबर एनटीएफ 4 उपचार के साथ 30 माह (स्केल बार = 25 माइक्रोन), (पी <0.001) 11 के साथ बढ़ता है।

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Discussion

वृद्धावस्था की मांसपेशियों को बुढ़ापे के प्रतिकूल प्रभावों के लिए कमजोर हैं पिछला अध्ययनों से वृद्धावस्था की मांसपेशियों में वृद्धावस्था में परिवर्तन का प्रदर्शन हुआ है जिसमें फाइबर आकार में परिवर्तन, कुल संख्या में फाइबर, पुनर्योजी क्षमता, एनएमजे आकार और मात्रा में परिवर्तन शामिल हैं, सिकुड़ाए समारोह में बदलाव के अलावा और मायोसिन आईसोफॉर्म 4 , 11 , 27 , 30 , 31 । न्यूरोट्रोफिन्स के प्रयोग से उम्र बढ़ने वाले लेरिंजल पेशी को बदल दिया जा सकता है। इन परिवर्तनों को आसानी से मापा जा सकता है। इसलिए, चूहे की लारेंगील मांसपेशियों में वृद्धावस्था के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल उपलब्ध है, और मुखर रोग / विकार इन मांसपेशियों के अध्ययन से वृद्धावस्था में मानवीय हस्तक्षेप या सुरक्षा प्रक्रियाओं को विकसित करने में मदद मिल सकती है।

एनटीएफ 4 के प्रणालीगत या प्रत्यक्ष आवेदन की हमारी पद्धति उम्रदराज चूहे लैर्यिंवल में एक रीमोडलिंग प्रतिक्रिया का उत्पादन करती हैमांसपेशियों। यह दर्शाता है कि न्यूरोट्रोपिन की उम्र बढ़ने से संबंधित मांसपेशी रोग पर चिकित्सीय क्षमता हो सकती है। न्यूरोट्रोफिन्स का प्रत्यक्ष प्रयोग आसानी से मुखर उम्र बढ़ने के मानव मॉडल में अनुवाद किया जा सकता है, हालांकि इंजेक्शन वैक्टर 25 ।

इंजेक्शन प्रोटोकॉल का उपयोग करने पर विचार करने के लिए कई कारक हैं। सबसे पहले, एन्डोस्कोप की नोक पर खराखना और नरभक्षी ऊतक को चोट लगने से रोकने के लिए सावधानी बरती जानी चाहिए ताकि एन्डोस्कोप की नोक पर तेज सुई लगा हो। दूसरा, जानवरों के श्वास चक्र के प्रेरक चरण के दौरान गले में सुई की टिप के आंदोलन का समय इंजेक्शन के सही समय पर अभ्यास करता है। तीसरा, यह सुनिश्चित करें कि कंप्यूटर मॉनिटर पर उपकरण का निरीक्षण करने से प्रक्रिया की कोशिश करने से पहले सुई की टिप स्पष्ट रूप से दिखाई देती है। चौथा, कुछ सेकंड के लिए गर्म पानी में एंडोस्कोप की नोक गर्म करना यह सुनिश्चित करने का एक महत्वपूर्ण कदम है कि एंडो के फॉगिंगगुंजाइश टिप से बचा जाता है अंत में, किसी भी प्रकार की कार्यप्रणाली से पहले रात को तेज करना भी महत्वपूर्ण है। अगर भोजन को रोक नहीं रखा जाता है तो यह अत्यधिक संभावना है कि वे अभी भी ग्रसनी में भोजन अवशेष पाएंगे, जो इंजेक्शन प्रक्रिया को लगभग असंभव बनाते हैं। निर्जलीकरण के लक्षणों के लिए चूहों का निरीक्षण किया जाना चाहिए और यह सुनिश्चित करने के लिए तौला जा सकता है कि कोई महत्वपूर्ण वजन घटाना नहीं है (अधिक से अधिक 10% शरीर का वजन)।

प्रोटोकॉल के विकास में दो महत्वपूर्ण कदम सिरिंज के एन्डोस्कोप के लिए लगाए गए थे, और मौखिक चिराग का इस्तेमाल करते थे। गुंजाइश सम्मिलन और इंजेक्शन के लिए सिंगल-हाथ ऑपरेशन की सुविधा के लिए सिरिंज असेंबली का प्रस्तोता आवश्यक था। अध्ययन के लक्ष्यों को ध्यान में रखते हुए, मुखर गुना के इंजेक्शन को निर्देशित करने के लिए प्रत्यक्ष दृश्यता की अनुपस्थिति में, प्रयोग का एहसास नहीं हो पाया। इसके अतिरिक्त, जीभ को आगे बढ़ने से रोकने और बनाए रखने के लिए मौखिक चिंतन का सृजन महत्वपूर्ण समझा गया थाई एपीग्लॉटिस पूरे प्रक्रिया के दौरान खुला है

नेत्रहीन निर्देशित इंजेक्शन पद्धति के तहत संशोधनों के कई दौरों में ज्यादातर एन्डोस्कोप को सुरक्षित रूप से सिरिंज और सुई लंगराने के इष्टतम साधन खोजने से जुड़े थे। टेप चिपकने वाले कई अलग-अलग प्रकारों का परीक्षण करने के बाद, यह पाया गया कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लोचदार एथलेटिक टेप एन्डोस्कोप बॉडी के लिए सिरिंज के लंगर का सर्वोत्तम साधन था।

नेत्रहीन निर्देशित इंजेक्शन विधि की सबसे बड़ी सीमा इंस्ट्रूमेंटेशन से संबंधित नहीं थी, बल्कि पेटेंट ग्रसनी और वायुमार्ग की आवश्यकता के बजाय। यद्यपि, प्रक्रिया से पहले 24 घंटों तक भोजन को सीमित करने से इस समस्या का हल हो गया, चूहे बिस्तरों और मल सहित उनके पिंजरों में कुछ खाएंगे। जब यह हुआ, तो दो समाधान थे: (1) जब तक पशु ने अपने घुटन को स्वाभाविक रूप से साफ़ न किया हो, तब तक इंजेक्शन को स्थगित करें, या (2) संदंश का उपयोग मैन्युअल रूप से रुकावट को हटाने का प्रयास। यह हमारे अनुभव थाई, यह पूर्व बेहतर विकल्प था क्योंकि यह पशु के ग्रसनी क्षेत्र को संभावित चोट के जोखिम को कम करता है।

इस प्रोटोकॉल की नवीनता और सीधे परिसर के साथ मुखर गुना इंजेक्षन करने की आवश्यकता को देखते हुए, कोई अन्य विश्वसनीय तरीके मौजूद नहीं हैं। जानवरों के छोटे आकार को देखते हुए, जीवित जानवरों में परिसर के सही और सुसंगत प्लेसमेंट को सुनिश्चित करने के लिए मौखिक और ग्रसनी क्षेत्र के माध्यम से नेत्रहीन मार्गदर्शन वाले इंजेक्शन को देखते हुए। मुखर गुना को सीधे इंजेक्शन लगाने का एकमात्र माध्यम यह था कि एक बाहरी स्थिति से त्वचा और लैरीनेक्स के उपास्थि के माध्यम से ऐसा करने का प्रयास किया गया। यद्यपि यह विधि सफलतापूर्वक बोटिलिनम विष उपचार के दौर से गुजरने वाले मनुष्यों में निष्पादित की जाती है, हालांकि लारिन्जियल डिस्टोनियास को कम करने के लिए, छोटे जानवरों में transcutaneous इंजेक्शन विधियां संभव नहीं होती हैं।

तकनीक मजबूत है और न केवल मुखर गुना के इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन अंदर इंजेक्शन साइटों के लिएग्रसनी और मौखिक क्षेत्रों। इसके अतिरिक्त, विधि सिरिंज को निकालने के लिए जंतु ग्रंथि और लेरिंजल क्षेत्र के सरल दृश्य निगरानी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

संक्षेप में, यह इंजेक्शन पद्धति एक उपन्यास है जिसका मतलब है कि मनुष्यों में बुढ़ापे से संबंधित आवाज की समस्याओं के उपचार से संबंधित जैविक तंत्र का अध्ययन करना है। इस पद्धति में अन्य बीमारियों के मॉडल पर भी लागू होने की संभावना है जो मनुष्यों में आवाज, मुखर फ़ंक्शन, संचार और निगलने को प्रभावित करती हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय संस्थान पर बहरेपन और अन्य संचार विकार (R21DC010806 से सीएएम और जेसीएस और आरएडीडीसी 011285 से सीएएम तक) के अनुदान द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neurotrophin 4 Pepro Tech 450-04 200 ng in 50 μL
Alzet Osmotic Pump DURECT Corporation 2001D
30 ° endoscope Stoltz 61029D
50 mm 30 gauge 100-μL syringe Hamilton 84850 and 201812
saline (sodium chloride solution) Sigma-Aldrich S8776
ketamine hydrochloride Henry Schein 56344
xylazine hydrochloride Henry Schein 33198
25 G 5/8 needle Becton-Dickinson 305901
1 mL syringe Becton-Dickinson 309659
ophthalmic ointment Henry Schein 8897
clippers Oster 44-018
ethanol Decon 2716
iodine (Betadine) Purdue Pharma L.P. 606404
heating pad Sunbeam 731-5
5-0 nylon suture thread AD Surgical PMN-518R6
crile hemostat Fine Science Tools 13005-14
delicate suture tying forceps Fine Science Tools 11063-07
meloxicam Henry Schein 49756
carprofen Merritt Veterinary Supplies 148700
antibiotic ointment Henry Schein 57110
acepromizine Aceproject Henry Schein 3845
isoflurane Isothesia Henry Schein 50033
induction box (anesthetizing box) Harvard Apparatus 50-0116
oxygen compressed tank Scott Gross UN1072
plexiglas platform Small Parts Inc (Amazon)
rubber tipped forceps Fine science tools rubber 11075-00
liquid rubber for forceps above Lowe's 42518
plastic spectula (BD syringe cut to length) Becton-Dickinson 309659
halogen light source rhino-laryngeal stroboscope Kay-Pentax RLS 9100 B
video recorder Kay-Pentax
sucrose Sigma-Aldrich S0389-500G
phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P4417-100TAB
cryostat Mictotom HM525 Thermo Scientific HM 525
Gill 1 hematoxylin VWR 10143-142
Shandon eosin-Y alcoholic Thermo Fisher Scientific 6766007
anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit Sigma-Aldrich S0819
Texas red-X phalloidin Sigma-Aldrich T7471
alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate Thermo Fisher Scientific B-13422
Small animal anaesthesia machine Smiths Medical CDS 9000

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Andreatta, R. D., Stemple, J. C., Seward, T. S., McMullen, C. A. Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles. J. Vis. Exp. (124), e55837, doi:10.3791/55837 (2017).

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