Summary
Aquí, presentamos un protocolo para describir el uso de la neurotrofina 4 (NTF4) sistemática y directamente para remodelar los músculos laríngeos envejecidos en ratas.
Abstract
La disfunción laríngea en los ancianos es una causa importante de discapacidad, desde trastornos de voz hasta disfagia y pérdida de los reflejos protectores de las vías respiratorias. Existen pocas terapias, si las hay, que apuntan a la disfunción del músculo laríngeo relacionada con la edad. Las neurotrofinas participan en la inervación muscular y la diferenciación de las uniones neuromusculares (NMJs). Se cree que las neurotrofinas potencian la transmisión neuromuscular aumentando la liberación del neurotransmisor. Las uniones neuromusculares (NMJs) se hacen más pequeñas y menos abundantes en los músculos laríngeos de rata envejecidos, con evidencia de denervación funcional. Exploramos los efectos de NTF4 para uso clínico futuro como un terapéutico para mejorar la función en el envejecimiento de los músculos laríngeos humanos. Aquí, proporcionamos el protocolo detallado para la aplicación sistémica y la inyección directa de NTF4 para investigar la capacidad de envejecimiento de la rata músculo laríngeo para remodelar en respuesta a la aplicación de NTF4. En este método, las ratas recibieron NTF4 ya sea sistemáticamente a través de oSmotic o por inyección directa a través de los pliegues vocales. Luego se diseccionaron los músculos laríngeos y se utilizaron para el examen histológico de morfología y la denervación relacionada con la edad.
Introduction
Los músculos laríngeos se contraen rápida y consistentemente y son vulnerables a los efectos adversos del envejecimiento. Se cree que esta actividad constante contribuye a problemas de voz o disfagia observados en personas mayores de 65 años 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Varios mecanismos moleculares y fisiopatológicos contribuyen a esta disfunción relacionada con la edad. Estos mecanismos pueden incluir la remodelación de la mucosa laríngea, la atrofia o pérdida de las fibras musculares, la falta de regeneración de las fibras musculares o la atrofia que provoca el arqueamiento de los pliegues vocales y la incapacidad del cierre de la glotis 8 , 9 , 10 , 11 . No hay terapia médica comprobada en este momento que pueda comPara prevenir o rehabilitar estos cambios relacionados con la edad en estos músculos.
La modulación de la efectividad de la transmisión neuromuscular puede influir en gran medida en el rendimiento neuromotor. La familia de neurotrofinas incluye el factor de crecimiento nervioso (NGF), el factor de crecimiento nervioso derivado del cerebro (BDNF), la neurotrofina 3 (NTF3) y NTF4 12 , 13 . Se ha demostrado que las neurotrofinas modulan la eficacia sináptica 1 , 4 . El factor de crecimiento de los hepatocitos, el factor de crecimiento transformante beta y el factor de crecimiento de los fibroblastos se han utilizado recientemente en seres humanos para el tratamiento de las cicatrices de los pliegues vocales 15 - 17 . NTF4 también regula la eficacia de NMJ; Los ratones que carecen de NTF4 muestran NMJs desmontados 11 , 18 , 19 . Estos estudios llevan a efectos prometedores de tratamientosT de trastornos del músculo laríngeo envejecido y denervación con factores de crecimiento.
La terapéutica de inyección directa a los tejidos de los pliegues vocales no es sin precedentes en los seres humanos. Por ejemplo, las inyecciones locales de toxina botulínica se utilizan actualmente como un tratamiento eficaz para los trastornos del movimiento neurológico que afectan a los músculos de la laringe, como la disfonía espasmódica y la parálisis bilateral del nervio laríngeo recurrente 20 , 21 . El hidrogel de ácido hialurónico es otro inyectable, que se utiliza para tratar la cicatrización del pliegue vocal y la insuficiencia glotal 22 , 23 . La laringoplastia por inyección se puede utilizar para tratar una variedad de trastornos de la comunicación 24 . Estos métodos de inyección directa prometen mejorar la función vocal y tragar en las poblaciones de envejecimiento.
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Protocol
Utilizar las ratas macho Fischer 344-Brown Noruega a los 6 y 30 meses de edad para este protocolo. Las ratas se obtuvieron de la colonia de roedores del Instituto Nacional de Envejecimiento. Utilizamos las ratas para este estudio debido a que la estructura de la laringe de rata es similar a la del ser humano, sirviendo funcionalmente para la protección de las vías respiratorias y las vocalizaciones específicas de cada especie. Este estudio se realizó de acuerdo con la Política PHS sobre Cuidado Humano y Uso de Animales de Laboratorio, La Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y la Ley de Bienestar Animal (7 USC et seq.); El protocolo de uso animal fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Kentucky.
1. Anestesia de Ratas
- Prepare los anestésicos mezclando clorhidrato de ketamina (anestésico disociativo) e hidrocloruro de xilazina (sedante y analgésico) en solución salina tamponada. Las concentraciones de ketamina y xilazina en la solución final son 100 mg / 8 mg por kgPeso corporal respectivamente.
- Inyectar los anestésicos en la rata por administración intraperitoneal usando una jeringa con una aguja de 25 G.
- Determine que la rata está suficientemente anestesiada pinchando el dedo del pie o el pie con fórceps. Si la rata no reacciona al pellizco, entonces la cirugía puede comenzar. Si la rata reacciona a la pinza del dedo del pie con contracciones reflejas o musculares, espere 1-2 min y repita la prueba de pellizco. Si la rata reacciona de nuevo, sustituir la rata con un nuevo animal y repetir el procedimiento a partir de la etapa 1.2.
- Aplique un ungüento oftálmico a los ojos de la rata, después de que la rata esté inmóvil, para evitar que las córneas se sequen.
2. Implantación de la bomba osmótica
- Coloque la rata ventral en el área quirúrgica aséptica. Administrar meloxicam como medicamento preanestésico. Administrar intraperitonealmente a una dosis de 1-4 mg / kg de peso corporal usando una jeringa con una aguja de 25 G.
- Utilice las podadoras para quitar una aproximaTely 1 "x 1" cuadrado de piel de la parte posterior del cuello, y aproximadamente 1 "caudal de espacio entre los hombros.Afeitar tan cerca de la piel como sea posible.
- Moje la espalda y el cuello con etanol desinfectante (70%).
- Después del afeitado, frote el aspecto dorsal del cuello con 3 matorrales en sucesión de alcohol yodado con alcohol.
- Mantenga la temperatura corporal de la rata colocándola sobre una almohadilla calentadora ajustada a 34 ° C.
- Llenar las bombas osmóticas preparadas asépticamente con 50 μL de NTF4 o solución salina para el tratamiento sistémico con NTF4 ( Figura 1 ).
- Utilice un bisturí para hacer una incisión horizontal de aproximadamente 2 cm de ancho a través de la piel, sólo craneal al espacio entre las escápulas. Levantar el borde posterior de la incisión con una pinza con una mano mientras se inserta la punta de los hemostatos y empujar suavemente posterior a la incisión.
- Después de la punta de los hemostatos es de aproximadamente 2 cm cRanial a la incisión, abrir las manijas en los hemostatos, la expansión de las puntas para formar un hueco "bolsillo" subcutánea a la incisión sitio. Este será el sitio de colocación de la bomba.
- Oriente el extremo del portal de suministro de la bomba primero al insertarlo para minimizar cualquier interacción del NTF4 y la cicatrización del sitio de la incisión del bolsillo.
- Entregar 50 μL de solución salina NTF4 durante 7 14 días. El grupo de 7 días recibió 6,72 mg / día de NTF4 para una dosis total de 47,04 mg. El grupo de 14 días recibió 6,72 mg / día para una dosis total de 94,08 mg de NTF4 [ 25] .
- Utilice hilo de sutura de nylon 5-0, hemostatos y fórceps para cerrar la incisión para la colocación de la bomba.
- Observar las ratas durante un mínimo de 30 min como se recuperan de la anestesia. Los criterios para completar el monitoreo incluyen el animal que se hace activo, moviéndose alrededor de la jaula, bebiendo agua, y comenzando otras actividades normales tales como aseo.
- Monitoree los animales diariamenteDurante la primera semana observando la curación del sitio quirúrgico, el consumo normal de alimento y agua y el paso de orina / heces, y cualquier signo de comportamiento anormal de estrés, dolor u otras complicaciones postoperatorias.
- Si la rata parece tener dolor o angustia, proporcione a la rata una inyección subcutánea de 5 mg / kg de carprofeno una vez cada 24 h durante hasta 5 días para aliviar el dolor.
- Si parece haber una infección, consulte a un veterinario para asegurarse de que la herida cicatriza correctamente.
- Dependiendo de qué grupo experimental de la rata adentro, quite la sutura de nylon 5-0 7-10 días después de la cirugía para prevenir la irritación del hilo.
3. Anestesia de Ratas para Inyección Directa
- Retirar los alimentos de las ratas la noche antes del procedimiento. Esto asegura que no hay alimento para bloquear el endoscopio o la aguja de inyección.
- Pesar las ratas y preparar acepromazina 1-2 mg / kg de peso corporal. Inyectar por vía intramuscular (la localización IM es laMúsculo tireoaritenoideo izquierdo).
- Coloque la rata en la caja de inducción. Inducir la anestesia en la caja de inducción con 5% de isoflurano y 1 LO2.
- Mueva la rata a un cono de la nariz con isoflurano al 2% y 600 ml de O 2 .
- Determine que la rata está suficientemente anestesiada pinchando el dedo del pie o el pie con fórceps. Si la rata no reacciona al pellizco, entonces el protocolo de inyección puede comenzar. Si la rata reacciona a la pinza del dedo del pie con contracciones reflejas o musculares, espere 1-2 min y repita la prueba de pellizco. Si la rata reacciona de nuevo, reemplace la rata con un nuevo animal y repita el procedimiento comenzando desde el paso 3.4.
4. Inyección directa y visualización
- Colocar las dosis preparadas asépticamente de 50 μl que contengan NTF4 o solución salina en un baño de H 2 O fijado a 25 ° C durante 30 minutos antes de la inyección.
- Coloque la rata en posición supina y reclinada sobre una plataforma de plexiglás ( Figura 2 ). SusPend la rata en la postura reclinada de sus incisivos superiores frontales a través de un alambre guía amarrado a través de la parte superior de la plataforma.
- Conecte una jeringa de 50 mm, calibre 30, de 100 μL a un endoscopio sinusal de 1,9 mm, 30 ° ( Figura 3 ).
NOTA: El conjunto de la jeringa está unido a través de una plantilla que sujeta la cánula firmemente a la pared externa del endoscopio. El endoscopio permite la visualización de los pliegues vocales y la guía de la jeringuilla por vía intraoral. La posición de la punta de la cánula se ajusta antes de cada animal para asegurar que la punta sea totalmente y claramente visible a través de la vista endoscópica ( Figura 4 ). - Use un par de pinzas con punta de goma para extender la lengua y moverla lateralmente. Después, insertar un espéculo de plástico para mantener la permeabilidad oral. Hacer el espéculo de un barril de 5 ml de plástico de la jeringa que se corta a una longitud de 1,5 a 2 cm, con los bordes de corte desbarbado y pulido suave.
- Apagar las luces en el rooM y conecte una fuente de luz halógena al endoscopio. Encienda la videograbadora para capturar el procedimiento.
- Sumerja el extremo distal del endoscopio en agua tibia durante unos segundos para minimizar el desarrollo de condensación en la punta de vidrio cuando se inserta en la boca de la rata.
- Utilizando la retroalimentación visual desde el monitor, guíe cuidadosamente la aguja hasta el área del pliegue vocal izquierdo.
- Tiempo de la inyección de la solución con la fase inspiratoria del ciclo de la respiración de los animales para acceder plenamente el pliegue vocal. Durante la fase inspiratoria de la respiración, el pliegue vocal está completamente expuesto.
- Una vez que el pliegue vocal es totalmente visible, insertar la aguja en el tiroiritenoideo izquierdo, que se encuentra lateral al borde mediano blanco del pliegue vocal. Con la aguja en su lugar, entregar el inyectado a través de la depresión de la jeringa.
- Apague la fuente de luz halógena en el endoscopio y el reproductor de vídeo, yLuces om
- Vuelva la rata a su jaula de casa y coloque en una almohadilla de calefacción.
- Deje que la rata se recupere antes de retirarla de la almohadilla de calentamiento. Reemplace los alimentos y el agua en la jaula.
- Monitor de ratas durante 7 días después de la inyección y luego euthanize. Quitar las laringes para la criosección 24 .
5. Eutanasia de Ratas
- Anestesiar las ratas con hidrocloruro de ketamina y clorhidrato de xilazina (100 mg / 8 mg por kg de peso corporal inyectado inyección intraperitoneal).
- Euthanize por exsanguination después de una toracotomía medial.
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Representative Results
Las ratas se sacrificaron después de 2 semanas de infusión de bomba osmótica o 1 semana después de la inyección directa de NTF4. Las laringes se cosecharon, se colocaron en crioprotector (sacarosa al 30% y solución salina tamponada con fosfato al 70%) y luego se seccionaron en serie en anchos de 10 μm con un criostato. El envejecimiento de los músculos laríngeos se ven afectados por la administración de NTF4 [ 25] . Además de rata joven y vieja, comparamos el lado inyectado y no inyectado de los músculos tiroaritenoideos. Normalmente vemos un cambio en el tamaño de la fibra con la edad, que varía en función de la vía de administración de NTF4 ( Figura 5 ]. Menos fibrosis también se observa cualitativamente después del tratamiento. El porcentaje de fibras desnervadas disminuye con la aplicación sistémica y directa de NTF4 en ratas envejecidas ( Figura 6 ). La cantidad de NMJs también aumenta ( Figura 7 ). El significado de este aumento Pendiente de la duración del tratamiento o vía de administración.
Figura 1: Imagen representativa de la bomba osmótica. Después de llenar la bomba con NTF4, el moderador de flujo se inserta en el cuerpo principal para sellar la bomba.
Figura 2: Plataforma para el procedimiento de inyección. La rata se coloca en una posición supina en la plataforma y se suspende por los incisivos superiores frontales a través de un cable guía montado en la parte superior de la plataforma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3: Imagen representativa de la jeringa. Llene la jeringa con NTF4 y la mezcla salina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Procedimiento de inyección. ( A ) La jeringa está acoplada a un endoscopio de 19,9 mm de 30 ° (mostrado); (B) Se comprueba la luz óptica para asegurarse de que hay luz para el procedimiento; ( C ) El video en tiempo real asegura que la aguja se guíe a la ubicación correcta.
Figura 5: Cambios en el tamaño de las fibras y la morfología. RepresentanteMatoxilina y eosina de NTF4 sistémico Tratados 7 días (derecha) y no tratados (izquierda) tiroaritenoides a los 30 meses de edad 26 , 27 , 28 . Hay un aumento en el tamaño de la fibra desde el control a los animales tratados. El tratamiento con NTF4 cambia el tamaño de la fibra de 30 meses a la de un animal de 6 meses de edad más joven. * P <0,05 frente a 30 meses (las imágenes se capturaron con una ampliación de 40X, escala = 25 μm, P <0,001). Las flechas en la imagen superior señalan un área de fibrosis. También hay una disminución cualitativa de la fibrosis en los animales tratados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Cambios en el interiorTratamiento con NTF4. Las secciones representativas de Nav1.5 teñidas de NTF4 sistémico de 14 días tratados (derecha) y no tratados (izquierda) tiroaritenoides a los 30 meses de edad (las imágenes se capturaron a una ampliación de 40X, barra de escala = 25 μm) 29 . Hay una reducción de la denervación con la edad por Na v 1,5 etiquetado (verde). El panel izquierdo es representativo de Na v 1,5 (verde) y faloidina, para denotar las secciones teñidas de fibras (rojas) de los músculos tiroaritenoideos no tratados, en el panel derecho se tratan los músculos. El inserto verde es la tinción con Na v 1,5 solo.
Figura 7: Cambios en NMJs con tratamiento con NTF4. Las imágenes de microscopía de fluorescencia representativas de NMJs de cortes sistémicos de NTF4 de 14 días de músculos tiroaritenoide tratados de diferentes animales marcados con α-bungarotoxina (verde) yPhalloidin (rojo) que muestra que el número de NMJ aumenta con el tratamiento con NTF4 a los 30 meses (escala bar = 25 μm), (P <0,001) 11 .
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Discussion
Los músculos laríngeos son vulnerables a los efectos desfavorables del envejecimiento. Estudios previos han demostrado cambios en el envejecimiento de los músculos laríngeos que incluyen cambios en el tamaño de las fibras, el número total de fibras, la capacidad regenerativa, el tamaño NMJ y los cambios de cantidad, además de las variaciones en la función contráctil y la isoforma de la miosina 4 , 11 , 27 , 30 , 31 . El envejecimiento del músculo laríngeo puede ser alterado por la aplicación de neurotrofinas. Estos cambios pueden ser fácilmente medidos. Por lo tanto, los músculos laríngeos de rata proporcionan un modelo útil para estudiar los efectos del envejecimiento y las enfermedades / trastornos vocales. El estudio de estos músculos también puede ayudar a desarrollar intervenciones o procesos protectores en el envejecimiento humano.
Nuestro método de aplicación sistémica o directa de NTF4 produce una respuesta de remodelación en el envejecimiento de la rata de la laringemúsculos. Esto demuestra que las neurotrofinas pueden tener potencial terapéutico sobre la disfunción muscular relacionada con el envejecimiento. La aplicación directa de neurotrofinas puede traducirse fácilmente al modelo humano de envejecimiento vocal a través de vectores de inyección 25 .
Hay muchos factores a considerar cuando se utiliza el protocolo de inyección. En primer lugar, se debe tener cuidado para evitar arañazos y lesiones en los tejidos blandos alrededor del vestíbulo laríngeo, teniendo en cuenta que la punta del endoscopio tiene una aguja afilada. En segundo lugar, la sincronización del movimiento de la punta de la aguja en la laringe durante la fase inspiratoria del ciclo del aliento de los animales requiere práctica para medir con precisión la inyección. En tercer lugar, asegúrese de que la punta de la aguja es claramente visible antes de intentar el procedimiento mediante la inspección visual del aparato en el monitor de la computadora de antemano. En cuarto lugar, el calentamiento de la punta del endoscopio en agua caliente durante unos segundos es un paso importante para asegurarse de que la niebla del endoLa extremidad del alcance se evita. Finalmente, también es importante ayunar la rata la noche antes de cualquier procedimiento de determinación del alcance. Si no se retiene el alimento, es muy probable que todavía tengan residuos de alimentos en la faringe, lo que hace prácticamente imposible el procedimiento de inyección. Las ratas deben ser inspeccionadas diariamente por signos de deshidratación y pesadas para asegurarse de que no hay pérdida significativa de peso (mayor que el 10% del peso corporal).
Dos pasos críticos en el desarrollo del protocolo fueron la fijación de la jeringa al endoscopio y el uso de un espéculo oral. El anclaje firme del conjunto de la jeringa era necesario para facilitar la operación de una sola mano para la inserción e inyección del alcance. Considerando los objetivos del estudio, en ausencia de visualización directa para guiar la inyección del pliegue vocal, el experimento no pudo realizarse. Además, se consideró importante la creación de un espéculo oral para evitar que la lengua se moviera yE epiglotis abierta durante todo el procedimiento.
El método de inyección guiado visualmente fue varias rondas de modificación relacionadas principalmente con la búsqueda de los medios óptimos para anclar con seguridad la jeringa y la aguja al endoscopio. Después de probar varias formas diferentes de adhesivos de cinta, se encontró que la cinta atlética elástica comercialmente disponible era el mejor medio de anclar la jeringa al cuerpo del endoscopio.
La mayor limitación del método de inyección guiada visualmente no estaba relacionada con la instrumentación, sino más bien con la necesidad de tener una faringe patentada y una vía aérea. Aunque, restringiendo la comida durante 24 horas antes del procedimiento resolvió la mayor parte de este problema, las ratas ingerirán cualquier cosa en sus jaulas, incluyendo ropa de cama y heces. Cuando esto ocurrió, hubo dos soluciones: (1) posponer la inyección hasta que el animal borra su faringe naturalmente, o (2) tratar de eliminar el bloqueo manualmente con fórceps. Fue nuestra experienciaE, que el primero era la mejor opción porque reducía el riesgo de lesión potencial a la región faríngea del animal.
Dada la novedad de este protocolo y la necesidad de inyectar directamente el pliegue vocal con el compuesto, no existen otros métodos fiables. Dado el pequeño tamaño del sistema laríngeo de los animales, la inyección guiada visualmente a través de la región oral y faríngea de la única manera de asegurar la colocación correcta y consistente del compuesto en el animal vivo. El único otro medio para inyectar directamente el pliegue vocal era intentar hacerlo desde una posición externa a través de la piel y el cartílago de la laringe. Aunque este método se lleva a cabo con éxito en los seres humanos sometidos a terapias con toxina botulínica para aliviar las distonías laríngeas, los métodos de inyección transcutánea no son factibles en animales pequeños.
La técnica es robusta y puede utilizarse no sólo para la inyección del pliegue vocal, sino también para los sitios de inyección enLas regiones faríngea y oral. Adicionalmente, el método puede ser adaptado para monitorización visual simple de la región faríngea y laríngea de los animales retirando la jeringa.
En resumen, este método de inyección es un nuevo medio para estudiar los mecanismos biológicos relacionados con el tratamiento de las disfunciones de voz relacionadas con el envejecimiento en los seres humanos. Este método también tiene el potencial de ser aplicado a otros modelos de enfermedades que afectan la expresión, la función vocal, la comunicación y la deglución en los seres humanos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional sobre la Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación (R21DC010806 a CAM y JCS y R01DC011285 a CAM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurotrophin 4 | Pepro Tech | 450-04 | 200 ng in 50 μL |
| Alzet Osmotic Pump | DURECT Corporation | 2001D | |
| 30 ° endoscope | Stoltz | 61029D | |
| 50 mm 30 gauge 100-μL syringe | Hamilton | 84850 and 201812 | |
| saline (sodium chloride solution) | Sigma-Aldrich | S8776 | |
| ketamine hydrochloride | Henry Schein | 56344 | |
| xylazine hydrochloride | Henry Schein | 33198 | |
| 25 G 5/8 needle | Becton-Dickinson | 305901 | |
| 1 mL syringe | Becton-Dickinson | 309659 | |
| ophthalmic ointment | Henry Schein | 8897 | |
| clippers | Oster | 44-018 | |
| ethanol | Decon | 2716 | |
| iodine (Betadine) | Purdue Pharma L.P. | 606404 | |
| heating pad | Sunbeam | 731-5 | |
| 5-0 nylon suture thread | AD Surgical | PMN-518R6 | |
| crile hemostat | Fine Science Tools | 13005-14 | |
| delicate suture tying forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| meloxicam | Henry Schein | 49756 | |
| carprofen | Merritt Veterinary Supplies | 148700 | |
| antibiotic ointment | Henry Schein | 57110 | |
| acepromizine Aceproject | Henry Schein | 3845 | |
| isoflurane Isothesia | Henry Schein | 50033 | |
| induction box (anesthetizing box) | Harvard Apparatus | 50-0116 | |
| oxygen compressed tank | Scott Gross | UN1072 | |
| plexiglas platform | Small Parts Inc (Amazon) | ||
| rubber tipped forceps | Fine science tools rubber | 11075-00 | |
| liquid rubber for forceps above | Lowe's | 42518 | |
| plastic spectula (BD syringe cut to length) | Becton-Dickinson | 309659 | |
| halogen light source rhino-laryngeal stroboscope | Kay-Pentax | RLS 9100 B | |
| video recorder | Kay-Pentax | ||
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-500G | |
| phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| cryostat Mictotom HM525 | Thermo Scientific | HM 525 | |
| Gill 1 hematoxylin | VWR | 10143-142 | |
| Shandon eosin-Y alcoholic | Thermo Fisher Scientific | 6766007 | |
| anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | S0819 | |
| Texas red-X phalloidin | Sigma-Aldrich | T7471 | |
| alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | B-13422 | |
| Small animal anaesthesia machine | Smiths Medical | CDS 9000 |
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