Summary
Qui presentiamo un protocollo per descrivere sistemicamente e direttamente l'uso della neurotrofina 4 (NTF4) per rimodellare i muscoli laringei dell'invecchiamento del ratto.
Abstract
La disfunzione della laringe negli anziani è una delle principali cause di disabilità, dai disturbi vocali alla disfagia e dalla perdita di riflessi protettivi delle vie aeree. Pochi, se esistono, esistono terapie che mirano a disfunzione muscolare laringea legata all'età. Le neurotrofine sono coinvolte nell'innervazione muscolare e nella differenziazione delle giunzioni neuromuscolari (NMJs). Si pensa che le neurotrofine aumentino la trasmissione neuromuscolare aumentando il rilascio del neurotrasmettitore. Le giunzioni neuromuscolari (NMJ) diventano più piccole e meno abbondanti nei muscoli laringei del ratto di invecchiamento, con prove di denervazione funzionale. Abbiamo esplorato gli effetti di NTF4 per l'uso clinico futuro come terapeutico per migliorare la funzione nei muscoli laringei umani di invecchiamento. Qui forniamo il protocollo dettagliato per l'applicazione sistemica e l'iniezione diretta di NTF4 per esaminare la capacità del muscolo laringeo ratto di invecchiare di rimodellare in risposta all'applicazione NTF4. In questo metodo, i ratti ricevevano NTF4 sistematicamente via oPompa smotica o mediante iniezione diretta attraverso le pieghe vocali. I muscoli della laringe furono poi disseccati e utilizzati per l'esame istologico della morfologia e della denervazione legata all'età.
Introduction
I muscoli laringei contratti rapidamente e costantemente e sono vulnerabili agli effetti negativi dell'invecchiamento. Questa attività costante è pensata per contribuire a problemi vocali o disfagia osservati in persone di età superiore ai 65 anni 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Molti meccanismi molecolari e patofisiologici contribuiscono a questa disfunzione legata all'età. Questi meccanismi possono includere il rimodellamento della mucosa laringea, l'atrofia muscolare o la perdita, la mancanza di rigenerazione delle fibre muscolari o atrofia che provoca l'arricciamento delle pieghe vocali e l'incapacità della chiusura glottica 8 , 9 , 10 , 11 . Non esiste una sperimentata terapia medica in questo momento che può comPrevenire completamente o riabilitare questi cambiamenti legati all'età in questi muscoli.
La modulazione dell'efficacia della trasmissione neuromuscolare può influenzare notevolmente la prestazione neuromotoria. La famiglia delle neurotrofine comprende il fattore di crescita del nervo (NGF), il fattore di crescita del nervo derivato dal cervello (BDNF), la neurotrofina 3 (NTF3) e la NTF4 12 , 13 . Le neurotrofine hanno dimostrato di modulare l'efficacia sinaptica 1 , 4 . Il fattore di crescita dell'epatocyte, il fattore di crescita trasformante beta e il fattore di crescita dei fibroblasti sono stati recentemente impiegati negli esseri umani per il trattamento delle cicatrici vocali 15 - 17 . NTF4 regola anche l'efficacia della NMJ; I topi che mancano di NTF4 mostrano NMJ disassemblati 11 , 18 , 19 . Questi studi portano ad effetti promettenti dei trattamentiT dei disturbi muscolari linfatici e denervazione con fattori di crescita.
Le terapie di iniezione diretta ai tessuti delle pieghe vocali non sono senza precedenti negli esseri umani. Ad esempio, le iniezioni locali della tossina botulinica sono attualmente utilizzate come un trattamento efficace per i disturbi neurologici che influenzano i muscoli della laringa, come la disfonia spasmodica e la paralisi nervosa laringe ricorrente bilaterale 20 , 21 . L'idrogel acido ialuronico è un altro iniettabile, usato per trattare la scocciatura vocale e l'insufficienza glottale 22 , 23 . La laringoscopia d'iniezione può essere usata per trattare una serie di disturbi della comunicazione 24 . Questi metodi di iniezione diretta sono promettenti per migliorare la funzione vocale e deglutire nelle popolazioni che invecchiano.
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Protocol
Usa i topi maschi Fischer 344-Brown Norvegia a 6 e 30 mesi di età per questo protocollo. I ratti sono stati ottenuti dall'Istituto Nazionale di Colonia di Roditore di Aging. Abbiamo utilizzato i ratti per questo studio perché la struttura della laringa del ratto è simile a quella dell'uomo, funzionalmente funzionale alla protezione delle vie aeree e alle vocalizzazioni specifiche per specie. Questo studio è stato eseguito in conformità con la politica PHS sulla cura umana e l'uso di animali da laboratorio, La Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e la legge sulla protezione degli animali (7 USC et seq.); Il protocollo sull'utilizzo degli animali è stato approvato dal Comitato Istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università del Kentucky.
1. Anestesia dei ratti
- Preparare l'anestetico mescolando la cloridrato di ketamine (anestetico dissociativo) e cloridrato xilazine (sedativo e analgesico) in soluzione salina tamponata. Le concentrazioni di ketamina e xilazina nella soluzione finale sono 100 mg / 8 mg per kgPeso corporeo rispettivamente.
- Iniettare le anestetiche nel ratto mediante somministrazione intraperitoneale usando una siringa con un ago da 25 G.
- Determinare che il ratto è sufficientemente anestetizzato pinzando la punta o il piede con pinze. Se il topo non reagisce al pizzico, allora la chirurgia può iniziare. Se il topo reagisce al pizzico della punta con riflessi o contrazioni muscolari, attendere 1-2 minuti e ripetere il test di pizzicotto. Se il ratto reagisce di nuovo, sostituire il ratto con una nuova animale e ripetere la procedura a partire dal punto 1.2.
- Applicare unguento oculare agli occhi del ratto, dopo che il ratto è immobile, per evitare che le cornee si asciugano.
2. Impianto osmotico della pompa
- Posizionare il ventrale del ratto sulla zona chirurgica asettica. Amministrare meloxicam come farmaco preanestetico. Amministrare intraperitonealmente ad un dosaggio di 1-4 mg / kg di peso corporeo usando una siringa con un ago da 25 G.
- Utilizzare le taglierine per rimuovere un approssimaCon uno spessore di 1 "x 1" di pelliccia dalla parte posteriore del collo e circa 1 "caudale di spalla tra le spalle. Rasare il più vicino possibile alla pelle.
- Bagnare la schiena e il collo con l'etanolo disinfettante (70%).
- Dopo la rasatura, strofinare l'aspetto dorsale del collo con 3 scrubs in successione di alcool iodio-alcool finitura con alcool.
- Mantenere la temperatura corporea del ratto inserendola su un pannello di riscaldamento impostato a 34 ° C.
- Riempire pompe osmotiche preparate asetticamente con 50 μL di NTF4 o salina per il trattamento sistemico di NTF4 ( Figura 1 ).
- Utilizzare un bisturi per realizzare un'incisione orizzontale di circa 2 cm di larghezza attraverso la pelle, solo cranica nello spazio tra la scapola. Sollevare il bordo posteriore dell'incisione con le pinze con una mano mentre inserisci la punta degli emostatici e spingete delicatamente alla parte posteriore all'incisione.
- Dopo che la punta degli hemostats è di circa 2 cm cRaniale all'incisione, aprire le maniglie sugli emostatici, espandendo le punte per formare una "tasca" vuota sottocutanea al sito di incisione. Questo sarà il sito di posizionamento per la pompa.
- Orientare il portale di erogazione della pompa prima sull'inserimento per ridurre al minimo l'interazione del NTF4 e la guarigione del sito di incisione della tasca.
- Consegnare 50 μL di soluzione salina NTF4 per 7-14 giorni. Il gruppo di 7 giorni ha ricevuto 6,72 mg / die di NTF4 per una dose totale di 47,04 mg. Il gruppo di 14 giorni ha ricevuto 6,72 mg / die per una dose totale di 94,08 mg di NTF4 25 .
- Usare filo di sutura da 5-0 nylon, hemostati e pinze per chiudere l'incisione fatta per il posizionamento della pompa.
- Osservare i ratti per almeno 30 minuti mentre recuperano da anestesia. I criteri per il completamento del monitoraggio includono l'animale che diventa attivo, muove in giro per la gabbia, l'acqua potabile, e inizia altre attività normali come la cura.
- Monitorare gli animali quotidianamentePer la prima settimana osservando la guarigione del sito chirurgico, il consumo normale dell'alimentazione e dell'acqua e il passaggio di urine / feci e qualsiasi segno abnormale comportamentale di stress, dolore o altre complicazioni postoperatorie.
- Se il ratto sembra essere in dolore o disturbo, fornire al ratto una iniezione sottocutanea di carprofen da 5 mg / kg ogni 24 ore per un massimo di 5 giorni per alleviare il dolore.
- Se sembra che ci sia un'infezione, consultare un veterinario per far sì che la ferita si guari correttamente.
- A seconda di quale gruppo sperimentale il ratto è dentro, rimuove la sutura in nylon da 5-0 7-10 giorni dopo la chirurgia per evitare irritazioni dal filo.
3. Anestesia di ratti per iniezione diretta
- Disattiva il cibo dai ratti la notte prima della procedura. Ciò assicura che non ci sia cibo per bloccare l'endoscopio o l'ago di iniezione.
- Pesare i ratti e preparare acepromazina 1-2 mg / kg di peso corporeo. Iniettare in modo intramuscolare (la posizione IM è laSinistra il muscolo tiroarytenoide).
- Posizionare il ratto nella scatola di induzione. Indurre l'anestesia nella scatola di induzione con 5% isoflurano e 1 LO 2 .
- Spostare il ratto in un cono a naso con 2% isoflurano e 600 ml O 2 .
- Determinare che il ratto è sufficientemente anestetizzato pinzando la punta o il piede con pinze. Se il topo non reagisce al pizzico, il protocollo di iniezione può iniziare. Se il topo reagisce al pizzico della punta con riflessi o contrazioni muscolari, attendere 1-2 minuti e ripetere il test di pizzicotto. Se il ratto reagisce di nuovo, sostituire il ratto con una nuova animale e ripetere la procedura a partire dal punto 3.4.
4. Iniezione diretta e visualizzazione
- Posizionare i dosaggi di 50 μl preparati asetticamente contenenti NTF4 o saline in un bagno di H 2 O impostati a 25 ° C per 30 minuti prima dell'iniezione.
- Posizionare il ratto in posizione supina e reclinata su una piattaforma di plexiglass ( figura 2 ). SusPend il ratto nella posizione reclinata dai loro incisivi frontali superiore attraverso un filo di guida strinse sulla parte superiore della piattaforma.
- Fissare una siringa da 50 μm, 30 gauge, da 100 μL ad un endoscopio sinusale da 1,9 mm, 30 ° ( figura 3 ).
NOTA: L'assieme della siringa è collegato tramite un jig che tiene saldamente la cannula alla parete esterna dell'endoscopio. L'endoscopio consente la visualizzazione delle pieghe vocali e la guida della siringa intraorale. La posizione della punta della cannula viene regolata prima di ogni animale per assicurare che la punta sia completamente visibile attraverso la vista endoscopica ( Figura 4 ). - Utilizzare un paio di pinze in gomma per estendere la linguetta e spostarla lateralmente. Successivamente, inserire un speculum di plastica per mantenere la penetrazione orale. Fai speculum da un barile da 5 ml di siringa in plastica tagliato a una lunghezza di 1,5 a 2 cm, con i bordi tagliati sbiaditi e lucidati lisci.
- Spegnere le luci nel vanoM e collegare una sorgente di luce alogena all'endoscopio. Accendere il videoregistratore per catturare la procedura.
- Immergere l'estremità distale dell'endoscopio in acqua calda per alcuni secondi per ridurre al minimo lo sviluppo della condensa sulla punta di vetro quando viene inserito nella bocca del ratto.
- Usando feedback visivo dal monitor, guidare con cura l'ago nella zona della piega vocale sinistra.
- Tempo l'iniezione della soluzione con la fase inspiratoria del ciclo respiratorio degli animali per accedere completamente alla piega vocale. Durante la fase inspiratoria della respirazione, la piega vocale è completamente esposta.
- Una volta che la piega vocale è completamente visibile, inserire l'ago nel tireoarotenoide sinistro, trovato lateralmente al bordo bianco mediale della piega vocale. Con l'ago posto, trasportare l'iniettore attraverso la depressione della siringa.
- Spegnere la sorgente di luce alogena sull'endoscopio e sul lettore video e tornare indietro sul roLuci om.
- Rimettere il ratto alla sua gabbia di casa e mettere su un tappetino di riscaldamento.
- Lasciare recuperare il ratto prima di rimuovere dal tampone di riscaldamento. Sostituire il cibo e l'acqua nella gabbia.
- Monitorare i ratti per 7 giorni dopo l'iniezione e poi eutanizzare. Rimuovere le laringe per la criocondutturazione 24 .
5. Eutanizzazione dei ratti
- Anestetizzare i ratti con cloridrato di ketamina e cloridrato di xilazina (100 mg / 8 mg per kg di iniezione intraperitoneale iniettabile).
- Eutanizzare da exsanguination dopo una toracotomia mediale.
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Representative Results
I ratti sono stati eutanizzati dopo 2 settimane di infusione osmotica o una settimana dopo l'iniezione diretta di NTF4. Le laringe sono state raccolte, poste in cryoprotectant (30% saccarosio e 70% saline fosfato tamponato) e poi sezionate in serie in larghezza 10 μm con un criostato. L'invecchiamento dei muscoli laringei è influenzato dalla somministrazione di NTF4 25 . Oltre al ratto giovane e vecchio, abbiamo confrontato il lato iniettato e non iniettato dei muscoli tireoarytenoidi. Tipicamente vediamo un cambiamento nella dimensione della fibra con l'età, che varia in base alla via di somministrazione di NTF4 ( Figura 5 ). La minore fibrosi è osservata anche qualitativamente dopo il trattamento. Il percentuale di fibre denervate diminuisce con l'applicazione sistemica e diretta di NTF4 nei ratti invecchiati ( Figura 6 ). Anche la quantità di NMJ aumenta ( Figura 7 ). Il significato di questo aumento de Pesa sulla durata del trattamento o sul percorso di somministrazione.
Figura 1: Immagine rappresentativa della pompa osmotica. Dopo aver riempito la pompa con NTF4, il moderatore di flusso viene inserito nel corpo principale per sigillare la pompa.
Figura 2: Piattaforma per la procedura di iniezione. Il ratto viene posizionato in posizione supina sulla piattaforma e sospeso dagli incisivi superiori frontali attraverso un filo di guida montato sulla parte superiore della piattaforma. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Figura 3: Immagine rappresentativa della siringa. Riempire la siringa con NTF4 e miscela salina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Procedura di iniezione. ( A ) La siringa è accoppiata ad un endoscopio da 30 ° a 19,9 mm (in figura); (B) La luce ottica viene controllata per accertarsi che sia presente la luce; ( C ) Il video in tempo reale assicura che l'ago sia guidato nella posizione giusta.
Figura 5: Cambiamenti nella dimensione della fibra e nella morfologia. Rappresentante luiMatoxilina e eosina trattati con tessuto NTF4 sistemico a 7 giorni (destro) e non trattati (a sinistra) i muscoli tireoarytenoidi a 30 mesi di età 26 , 27 , 28 . C'è un aumento della dimensione della fibra dal controllo agli animali trattati. Il trattamento con NTF4 modifica la dimensione della fibra 30-mo a quella di un animale di 6 mesi. * P <0,05 rispetto a 30 mesi (le immagini sono state catturate a 40X ingrandimento; barra di scala = 25 μm, P <0,001). Le frecce nell'immagine superiore mostrano una zona di fibrosi. C'è anche una riduzione qualitativa della fibrosi negli animali trattati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Cambiamenti nell'internoCon NTF4 Trattamento. Rappresentative Nav1.5 sezionate tratti da NTF4 sistemico 14 giorni trattati (destro) e non trattati (sinistro) tiroarytenoid muscoli a 30 mesi di età (le immagini sono state catturate a 40X ingrandimento, barra di scala = 25 μm) 29 . C'è una riduzione della denervazione con l'età da Na v 1.5 etichettatura (verde). Il pannello a sinistra è rappresentativo di Na v 1.5 (verde) e falloidina, per indicare le sezioni di fibre (rosse) macchiate dai muscoli tireoarytenoidi non trattati, il pannello destro viene trattato con i muscoli. L'inserto verde è Na v 1.5 colorazione da solo.
Figura 7: Cambiamenti in NMJ con trattamento NTF4. Immagini rappresentative di microscopia a fluorescenza di NMJ provenienti da tratti muscolari tiroarytenoidi trattati per 14 giorni da NTF4 sistemici da animali diversi etichettati con α-bungarotossina (verde) ePhalloidin (rosso) che mostra che il numero di NMJ aumenta con il trattamento NTF4 a 30 mesi (barra di scala = 25 μm), (P <0.001) 11 .
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Discussion
I muscoli della laringe sono vulnerabili agli effetti sfavorevoli dell'invecchiamento. Studi precedenti hanno dimostrato variazioni nei muscoli linfari che prevedono cambiamenti nella dimensione della fibra, nel numero totale di fibre, nella capacità rigenerativa, nella dimensione e nella modifica della quantità di NMJ, oltre alle variazioni della funzione contrattile e dei cambi di isoenzima di miosina 4 , 11 , 27 , 30 , 31 . L'invecchiamento del muscolo laringeo può essere alterato mediante l'applicazione delle neurotrofine. Questi cambiamenti possono essere facilmente misurati. Pertanto, i muscoli laringei ratto forniscono un modello utile per studiare gli effetti dell'invecchiamento e delle malattie / disturbi vocali. Lo studio di questi muscoli può anche aiutare a sviluppare interventi o processi protettivi nell'invecchiamento umano.
Il nostro metodo di applicazione sistemica o diretta di NTF4 produce una risposta di rimodellamento nella laringe del ratto di invecchiamentomuscoli. Ciò dimostra che le neurotrofine possono avere potere terapeutico sulla disfunzione muscolare legata all'invecchiamento. L'applicazione diretta delle neurotrofine può essere facilmente tradotta nel modello umano dell'invecchiamento vocale, sebbene i vettori di iniezione 25 .
Ci sono molti fattori da considerare quando si utilizza il protocollo di iniezione. Innanzitutto occorre prestare attenzione a prevenire graffi e lesioni ai tessuti molli intorno al vestibolo laringe, considerando che la punta dell'endoscopio ha un ago affilato. In secondo luogo, la temporizzazione del movimento della punta dell'ago nella laringe durante la fase inspiratoria del ciclo di respirazione degli animali prende la prassi per tempo di precisione dell'iniezione. In terzo luogo, assicurarsi che la punta dell'ago sia chiaramente visibile prima di tentare la procedura visualizzando visivamente l'apparecchio sul monitor del computer in anticipo. Quarto, riscaldando la punta dell'endoscopio in acqua calda per alcuni secondi è un passo importante per fare in modo che la nebbia dell'endoLa punta di campo è evitata. Infine, è anche importante veloce il ratto la notte prima di qualsiasi procedura di scoping. Se il cibo non viene trattenuto, è altamente probabile che avranno ancora residui alimentari nella faringe, il che rende praticamente impossibile eseguire la procedura di iniezione. I ratti devono essere controllati ogni giorno per segni di disidratazione e pesati per assicurarsi che non vi sia una perdita di peso significativa (superiore al 10% del peso corporeo).
Due passi critici nello sviluppo del protocollo erano l'attaccamento della siringa all'endoscopio e l'uso di uno speculum orale. L'ancoraggio fisso dell'assemblaggio della siringa è stato necessario per facilitare l'azionamento a mano singola per l'inserimento e l'iniezione della portata. Considerando gli obiettivi dello studio, in assenza di visualizzazione diretta per guidare l'iniezione della piega vocale, l'esperimento non avrebbe potuto essere realizzato. Inoltre, la creazione di uno speculum orale è stata considerata importante per impedire la lingua di muoversi e di mantenereL'epiglotta è aperta durante la procedura.
Il metodo di iniezione visivamente guidato è andato diversi cicli di modifica principalmente legati alla ricerca dei mezzi ottimali per fissare saldamente la siringa e l'ago all'endoscopio. Dopo aver sperimentato diverse forme di adesivi a nastro, è stato trovato che il nastro atletico elastico disponibile in commercio era il mezzo migliore per ancorare la siringa al corpo dell'endoscopio.
La più grande limitazione del metodo di iniezione guidata visivamente non era correlata alla strumentazione, ma alla necessità di avere un faringe brevettato e vie aeree. Anche se, limitando il cibo per 24 ore prima della procedura ha risolto la maggior parte di questo problema, i ratti potranno ingerire qualsiasi cosa nelle loro gabbie, tra cui lenzuola e feci. Quando si è verificato, sono state due soluzioni: (1) posticipare l'iniezione fino a quando l'animale non depilasse la faringe in modo naturale, o (2) tentare di rimuovere il blocco manualmente mediante pinze. Era la nostra esperienzaE, che la prima era l'opzione migliore perché riduceva il rischio di lesioni potenziali alla regione faringea dell'animale.
Data la novità di questo protocollo e la necessità di iniettare direttamente la piega vocale con il composto, non esistono altri metodi affidabili. Data la piccola dimensione del sistema laringe degli animali, l'iniezione visiva guidata attraverso la regione orale e faringeo, nell'unico modo per garantire il posizionamento corretto e coerente del composto nell'animale vivente. L'unico altro modo per iniettare direttamente la piega vocale era tentare di farlo da una posizione esterna attraverso la pelle e la cartilagine della laringe. Anche se questo metodo è stato eseguito con successo negli esseri umani sottoposti a terapie tossiniche botuliniche per alleviare le distonie laringeche, i metodi di iniezione transcutanei non sono fattibili nei piccoli animali.
La tecnica è robusta e può essere utilizzata per non solo l'iniezione della piega vocale, ma per i siti di iniezione all'internoLe regioni faringee e orali. Inoltre, il metodo può essere adattato per un semplice monitoraggio visivo delle zone faringeo e laringe animali rimuovendo la siringa.
In sintesi, questo metodo di iniezione è un nuovo strumento per studiare meccanismi biologici legati al trattamento delle disfunzioni vocali associate all'invecchiamento negli esseri umani. Questo metodo ha anche il potenziale per essere applicato ad altri modelli di malattia che influenzano la voce, la funzione vocale, la comunicazione e la deglutizione negli esseri umani.
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Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'Istituto Nazionale sulla Sordità e altri disturbi della comunicazione (R21DC010806 per CAM e JCS e R01DC011285 a CAM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurotrophin 4 | Pepro Tech | 450-04 | 200 ng in 50 μL |
| Alzet Osmotic Pump | DURECT Corporation | 2001D | |
| 30 ° endoscope | Stoltz | 61029D | |
| 50 mm 30 gauge 100-μL syringe | Hamilton | 84850 and 201812 | |
| saline (sodium chloride solution) | Sigma-Aldrich | S8776 | |
| ketamine hydrochloride | Henry Schein | 56344 | |
| xylazine hydrochloride | Henry Schein | 33198 | |
| 25 G 5/8 needle | Becton-Dickinson | 305901 | |
| 1 mL syringe | Becton-Dickinson | 309659 | |
| ophthalmic ointment | Henry Schein | 8897 | |
| clippers | Oster | 44-018 | |
| ethanol | Decon | 2716 | |
| iodine (Betadine) | Purdue Pharma L.P. | 606404 | |
| heating pad | Sunbeam | 731-5 | |
| 5-0 nylon suture thread | AD Surgical | PMN-518R6 | |
| crile hemostat | Fine Science Tools | 13005-14 | |
| delicate suture tying forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| meloxicam | Henry Schein | 49756 | |
| carprofen | Merritt Veterinary Supplies | 148700 | |
| antibiotic ointment | Henry Schein | 57110 | |
| acepromizine Aceproject | Henry Schein | 3845 | |
| isoflurane Isothesia | Henry Schein | 50033 | |
| induction box (anesthetizing box) | Harvard Apparatus | 50-0116 | |
| oxygen compressed tank | Scott Gross | UN1072 | |
| plexiglas platform | Small Parts Inc (Amazon) | ||
| rubber tipped forceps | Fine science tools rubber | 11075-00 | |
| liquid rubber for forceps above | Lowe's | 42518 | |
| plastic spectula (BD syringe cut to length) | Becton-Dickinson | 309659 | |
| halogen light source rhino-laryngeal stroboscope | Kay-Pentax | RLS 9100 B | |
| video recorder | Kay-Pentax | ||
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-500G | |
| phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| cryostat Mictotom HM525 | Thermo Scientific | HM 525 | |
| Gill 1 hematoxylin | VWR | 10143-142 | |
| Shandon eosin-Y alcoholic | Thermo Fisher Scientific | 6766007 | |
| anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | S0819 | |
| Texas red-X phalloidin | Sigma-Aldrich | T7471 | |
| alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | B-13422 | |
| Small animal anaesthesia machine | Smiths Medical | CDS 9000 |
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