Summary
Her presenterer vi en protokoll for å beskrive bruken av nevrotrofin 4 (NTF4) systematisk og direkte for å remodel rotte aldrende laryngeale muskler.
Abstract
Laryngeal dysfunksjon hos eldre er en viktig årsak til funksjonshemning, fra stemmeforstyrrelser til dysfagi og tap av luftveisbeskyttende reflekser. Få, om noen, finnes terapier som målretter aldersrelatert larynxmuskulær dysfunksjon. Neurotropiner er involvert i muskelinnervering og differensiering av nevromuskulære veikryss (NMJ). Det antas at nevrotrofiner forsterker nevromuskulær overføring ved å øke nevrotransmitterutløsningen. De nevromuskulære veikryssene (NMJs) blir mindre og mindre rik på aldring av rotte laryngeale muskler, med bevis på funksjonell denervering. Vi undersøkte effekten av NTF4 for fremtidig klinisk bruk som terapeutisk for å forbedre funksjonen i aldring av larynxmuskulaturen. Her gir vi den detaljerte protokollen for systemisk bruk og direkte injeksjon av NTF4 for å undersøke evnen til å aldre rotte laryngeal muskel til remodel som svar på NTF4 applikasjon. I denne metoden fikk rotter enten NTF4 enten systematisk via oSmotisk pumpe eller ved direkte injeksjon gjennom vokalfoldene. Laryngeale muskler ble deretter dissekert og brukt for histologisk undersøkelse av morfologi og aldersrelatert denervation.
Introduction
Laryngeal muskler kontrakt raskt og konsekvent, og er sårbare for skadelige effekter av aldring. Denne konstante aktiviteten antas å bidra til taleproblemer eller dysfagi observert hos personer over 65 år 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Flere molekylære og patofysiologiske mekanismer bidrar til denne aldersrelaterte dysfunksjonen. Disse mekanismene kan omfatte remodeling av laryngeal mucosa, muskelfiberatrofi eller tap, mangel på regenerering av muskler eller atrofi som forårsaker bøyning av vokalfoldene og manglende evne til glottis-lukning 8 , 9 , 10 , 11 . Det er ingen bevist medisinsk terapi på dette tidspunktet som kan comForhindre eller rehabilitere disse aldersrelaterte endringene i disse musklene.
Modulering av effektiviteten av nevromuskulær overføring kan i stor grad påvirke nevromotorisk ytelse. Familien til nevrotrofiner inkluderer nervevækstfaktor (NGF), hjerneavledet nervevækstfaktor (BDNF), neurotropin 3 (NTF3) og NTF4 12 , 13 . Neurotropiner har vist seg å modulere synaptisk effekt 1 , 4 . Hepatocyt vekstfaktor, transformerende vekstfaktor beta og fibroblastvekstfaktor, har nylig vært brukt hos mennesker til behandling av vokalfold arrdannelse 15-17. NTF4 regulerer også NMJ effektivitet; Mus mangler NTF4 viser demonterte NMJs 11 , 18 , 19 . Disse studiene fører til lovende effekter av behandlereT av aldring av laryngeale muskelforstyrrelser og denervering med vekstfaktorer.
Direkte injeksjonsterapi til vevene i vokalfoldene er ikke enestående i mennesker. For eksempel brukes lokale injeksjoner av botulinumtoksin for tiden som en effektiv behandling for nevrologiske bevegelsesforstyrrelser som påvirker musklene i strupehodet, for eksempel spasmodisk dysfoni og bilateral tilbakevendende laryngeal nerve lammelse 20 , 21 . Hyaluronsyre hydrogel er en annen injiserbar, som brukes til å behandle vokalfallsskrem og glottesuffisiens 22 , 23 . Injeksjons laryngoplastikk kan brukes til å behandle en rekke kommunikasjonsforstyrrelser 24 . Disse direkte injeksjonsmetodene gir løfte om å forbedre vokalfunksjonen og svelge i aldrende populasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bruk mannlige Fischer 344-Brown Norway-rotter ved 6 og 30 måneder for denne protokollen. Rotter ble oppnådd fra National Institute of Aging gnagere koloni. Vi brukte rotter for denne studien fordi strukturen til råttens strupehode ligner den menneskelige, funksjonelt betjening for luftveisbeskyttelse og artsspesifikke vokaliseringer. Denne studien ble utført i samsvar med PHS-politikken for human omsorg og bruk av laboratoriedyr, NIH-veiledningen for pleie og bruk av laboratoriedyr, og dyrevelferdsloven (7 USC et seq.); Protokollen for bruk av dyr ble godkjent av Institutt for dyrepleie og brukskomité (IACUC) ved University of Kentucky.
1. Anestesi av rotter
- Forbered bedøvelsen ved å blande ketaminhydroklorid (dissociativ bedøvelse) og xylazinhydroklorid (beroligende og smertestillende) i buffret saltvann. Konsentrasjonene av ketamin og xylazin i sluttoppløsningen er 100 mg / 8 mg pr. KgKroppsvekt henholdsvis.
- Injiser anestetika i rotte ved intraperitoneal administrering ved hjelp av en sprøyte med en 25 G nål.
- Bestem at rotten er tilstrekkelig bedøvet ved å klemme tåen eller foten med tau. Hvis rotten ikke reagerer på klemmen, kan kirurgi begynne. Hvis rotte reagerer på tåpepinnen med refleks eller muskelsammensetninger, vent deretter 1-2 minutter og repeter testen. Hvis rotte reagerer igjen, erstatt rotte med nytt dyr og gjenta prosedyre som begynner fra trinn 1.2.
- Påfør ringenes øye, etter at rotten er immobile, for å forhindre hornhinnen i å tørke ut.
2. Implantasjon av osmotisk pumpe
- Plasser rotteventralet på det aseptiske kirurgiske området. Administrer meloksikam som en preanestetisk medisin. Administrer intraperitonealt i en dose på 1-4 mg / kg kroppsvekt ved hjelp av en sprøyte med en 25 G nål.
- Bruk clippers til å fjerne en approximaTely 1 "x 1" kvadrat pels fra baksiden av nakken, og ca 1 "caudal mellomrom mellom skuldrene. Barber så nær huden som mulig.
- Våt ryggen og nakken med desinfiserende etanol (70%).
- Etter barbering, skrub det dorsale aspektet av nakken med 3 skrubber i etterfølge av jod-alkohol etterbehandling med alkohol.
- Oppretthold kroppstemperaturen på rotte ved å plassere den på en varmepute satt til 34 ° C.
- Fyll aseptisk tilberedte osmotiske pumper med enten 50 μl NTF4 eller saltvann for systemisk NTF4-behandling ( Figur 1 ).
- Bruk en skalpell til å lage et horisontalt snitt ca 2 cm bredt gjennom huden, bare kranial til mellomrom mellom scapulae. Løft den bakre kanten av snittet med pincet med en hånd mens du setter i spissen av hemostatene og skyv forsiktig bakover til snittet.
- Etter tuppen av hemostaten er ca 2 cm cLøpende til snittet, åpne håndtakene på hemostatene, utvide spissene for å danne en hul "lomme" subkutan til snittstedet. Dette blir plasseringsstedet for pumpen.
- Orienter pumpens leveringsportal ende først ved innsetting for å minimere samspillet mellom NTF4 og helingen av lommens snittsted.
- Lever 50 μL NTF4 saltvann for enten 7 14 dager. 7-dagersgruppen mottok 6,72 mg / dag NTF4 for en total dose på 47,04 mg. 14-dagersgruppen fikk 6,72 mg / dag for en total dose på 94,08 mg NTF4 25 .
- Bruk 5-0 nylon sutur tråd, hemostater og tanger for å lukke snittet laget for pumpeplassering.
- Vær oppmerksom på rotter i minst 30 minutter når de gjenoppretter fra bedøvelse. Kriterier for gjennomføring av overvåking inkluderer dyret blir aktivt, beveger seg rundt buret, drikkevann og begynner andre vanlige aktiviteter som grooming.
- Overvåke dyr dagligI den første uken ved å observere heling av kirurgisk område, normalt fôr og vannforbruk og passering av urin / avføring og eventuelle unormale betegnelsestegn på stress, smerte eller andre postoperative komplikasjoner.
- Hvis rotter ser ut til å være i smerte eller nød, gi rotten en 5 mg / kg subkutan injeksjon av karprofen en gang i 24 timer i opptil 5 dager for å lindre smerte.
- Hvis det ser ut til å være en infeksjon, kontakt en veterinær for å sikre at såret heles riktig.
- Avhengig av hvilken eksperimentell gruppe rotten inn i, fjern 5-0 nylon sutur 7-10 dager etter operasjonen for å forhindre irritasjon fra tråden.
3. Anestesi av rotter for direkte injeksjon
- Hold mat fra rotter natten før prosedyren. Dette sikrer at det ikke er mat for å blokkere endoskopet eller injeksjonsnålen.
- Vekter rotter og lag acepromazin 1-2 mg / kg kroppsvekt. Injiser intramuskulært (IM-stedet erVenstre tyroarytenoid muskel).
- Plasser rotte i induksjonsboksen. Indukser anestesi i induksjonsboksen med 5% isofluran og 1 LO 2 .
- Flytt rotte til en nesekegle med 2% isofluran og 600 ml O2.
- Bestem at rotten er tilstrekkelig bedøvet ved å klemme tåen eller foten med tau. Hvis rotten ikke reagerer på klemmen, kan injeksjonsprotokollen begynne. Hvis rotte reagerer på tåpepinnen med refleks eller muskelsammensetninger, vent deretter 1-2 minutter og repeter testen. Hvis rotte reagerer igjen, skift rotte med nytt dyr og gjenta prosedyre som begynner fra trinn 3.4.
4. Direkte injeksjon og visualisering
- Plasser aseptisk preparerte 50 μl doser som inneholder NTF4 eller saltvann i et H20 bad satt til 25 ° C i 30 minutter før injeksjon.
- Plasser rotte i en liggende og tilbaketrukket stilling på en plexiglassplattform ( figur 2 ). SusPend rotte i tilbakestrukket stilling fra de fremre toppskråtene sine via en ledningstråd spenst over toppen av plattformen.
- Fest en 50 mm, 30 gauge, 100 μL sprøyte til en 1,9 mm, 30 ° sinus endoskop ( figur 3 ).
MERK: Sprøyteaggregatet er festet via en jig som holder kanylen fast til endoskopets yttervegg. Endoskopet muliggjør visualisering av vokalfoldene og styringen av sprøyten intraoralt. Posisjonen til kanylespissen justeres før hvert dyr for å sikre at spissen er fullt og tydelig synlig via endoskopisk visning ( figur 4 ). - Bruk et gummipipet par tapper for å forlenge tungen og bevege den i sideværtt. Deretter setter du inn et plastspekulum for å opprettholde oral patency. Lag spekulumet fra en 5 ml plast sprøyte fat som er kuttet i en lengde på 1,5 til 2 cm, med kutt kantene avbøyd og polert glatt.
- Slå av lysene i rooM og fest en halogen lyskilde til endoskopet. Slå på videobåndopptakeren for å ta opp prosedyren.
- Demp den distale enden av endoskopet i varmt vann i noen få sekunder for å minimere utviklingen av kondens på glasspissen når den settes inn i rottens munn.
- Ved hjelp av visuell tilbakemelding fra skjermen, må du forsiktig lede nålen til området til venstre vokalfold.
- Tid innsprøytningen av løsningen med den inspirerende fasen av dyrets respirasjonssyklus for å få full tilgang til vokalvalsen. Under inspirasjonsfasen av respirasjon er vokalfoldet fullt eksponert.
- Når vokalfoldet er fullt synlig, sett nålen inn i venstre tyroarytenoid, funnet sidelengs til den hvite medialkanten av vokalfoldet. Med nålen på plass, lever injeksjonen gjennom depresjon av sprøyten.
- Slå av halogenkilden på endoskopet og videospilleren, og slå på roOm lys.
- Sett rotten tilbake til hjemmet og plasser på en varmepute.
- La rotten gjenopprette før fjerning fra varmeputen. Bytt mat og vann i buret.
- Overvåk rotter i 7 dager etter injeksjonen og deretter euthanize. Fjern laryngene for kryoseksjonering 24 .
5. Euthanisering av rotter
- Bedøve rotter med ketaminhydroklorid og xylazinhydroklorid (100 mg / 8 mg per kg injeksjon i kroppsvekt intraperitoneal injeksjon).
- Euthanize ved exsanguination etter en medial thoracotomi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rottene ble euthanisert etter 2 uker med osmotisk pumpeinfusjon eller 1 uke etter direkte injeksjon av NTF4. Larynger ble høstet, plassert i krybeskyttende middel (30% sukrose og 70% fosfatbuffert saltvann) og deretter serielt snittet i 10mm bredder med en kryostat. Aldring av larynxmusklene påvirkes av administrasjon av NTF4 25 . I tillegg til ung og gammel rotte, sammenlignet vi injisert og ikke-injisert side av thyroarytenoidmusklene. Vanligvis ser vi en endring i fiberstørrelse med alderen, som varierer basert på administreringsveien til NTF4 ( figur 5 ). Mindre fibrose er også observert kvalitativt etter behandling. Prosenten av denerverte fibre minker med systemisk og direkte påføring av NTF4 hos alderen rotter ( Figur 6 ). Mengden NMJ øker også ( figur 7 ). Betydningen av denne økningen de Avhenger av lengden på behandlingen eller administreringsmåten.
Figur 1: Representativt bilde av osmotisk pumpe. Etter at pumpen er fylt med NTF4, er strømningsmoderatoren satt inn i hoveddelen for å forsegle pumpen.
Figur 2: Plattform for injeksjonsprosedyre. Rotten er plassert i en bakre stilling på plattformen og suspendert av de fremre øvre snittene via en føringstråd montert på toppen av plattformen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Iles / ftp_upload / 55837 / 55837fig3.jpg "/>
Figur 3: Representativt bilde av sprøyte. Fyll sprøyten med NTF4 og saltoppløsning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Injiseringsprosedyre. ( A ) Sprøyten kobles til et 19,9 mm 30 ° endoskop (vist); (B) Optikklyset kontrolleres for å sikre at det er lys for prosedyren; ( C ) Videoen i sanntid sikrer at nålen styres til riktig sted.
Figur 5: Endringer i fiberstørrelse og morfologi. Representant hanMatoksylin og eosin-fargede seksjoner av systemisk NTF4 7-dagers behandlet (høyre) og ubehandlede (venstre) thyroarytenoidmuskler ved 30 måneders alder 26 , 27 , 28 . Det er en økning i fiberstørrelsen fra kontroll til behandlede dyr. Behandling med NTF4 endrer 30-mo-fiberstørrelsen til en yngre 6 måneder gammel dyr. * P <0,05 mot 30 måneder (bilder ble fanget ved 40X forstørrelse; Skala bar = 25 μm, P <0,001). Piler i toppbildet peker på et område av fibrose. Det er også en kvalitativ reduksjon av fibrose i de behandlede dyrene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Endringer i InnerBehandlinger med NTF4 behandling. Representative Nav1.5-fargede seksjoner fra systemisk NTF4 14-dagers behandlet (høyre) og ubehandlede (venstre) thyroarytenoidmuskler ved 30 måneders alder (bilder ble tatt ved 40X forstørrelse; Skalbjelke = 25 μm) 29 . Detervering med alder er redusert av Na v 1.5 merking (grønn). Venstre panel er representativt Na v 1.5 (grønt) og phalloidin, for å betegne fibrene (røde) fargede seksjoner fra ubehandlede thyroarytenoid muskler, er høyre panel behandlet muskler. Grønn innsats er Na v 1.5 farging alene.
Figur 7: Endringer i NMJ med NTF4 behandling. Representative fluorescensmikroskopiske bilder av NMJs fra systemiske NTF4 14-dagers behandlede tyroarytenoid muskel seksjoner fra forskjellige dyr merket med a-bungarotoxin (grønn) ogPhalloidin (rød) som viser at NMJ-tallet øker med NTF4-behandling etter 30 måneder (Skalbjelke = 25 μm), (P <0,001) 11 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Laryngeal muskler er sårbare for de ugunstige effektene av aldring. Tidligere studier har vist endringer i aldring av strupehalsmuskler som inkluderer endringer i fiberstørrelse, totalt antall fibre, regenerativ evne, NMJ-størrelse og kvantitetsendringer, i tillegg til variasjoner i kontraktil funksjon og myosin isoformskift 4 , 11 , 27 , 30 , 31 . Aging laryngeal muskel kan endres ved bruk av neurotrophins. Disse endringene kan lett måles. Derfor gir rotte laryngeale muskler en nyttig modell for å studere effektene av aldring og vokalsykdommer / lidelser. Studien av disse musklene kan også bidra til å utvikle intervensjoner eller beskyttelsesprosesser i det aldrende mennesket.
Vår metode for systemisk eller direkte bruk av NTF4 gir et remodelingrespons ved aldring av rotte laryngealmuskler. Dette demonstrerer at nevrotrofiner kan ha terapeutisk potensial på aldringsrelatert muskel dysfunksjon. Den direkte påføring av nevrotrofiner kan lett oversettes til den menneskelige modellen av vokal aldring selv om injeksjonsvektorer 25 .
Det er mange faktorer å vurdere når du bruker injeksjonsprotokollen. Først må man passe på å forhindre riper og skade på bløtvev rundt laryngealvestibulen med tanke på endoskopets spiss har en skarp nål festet. For det andre, når timing av nålespissen beveger seg inn i strupehodet under inspirasjonsfasen av dyrets pustesyklus, blir det nødvendig å nøye injiseringen. For det tredje, sørg for at nålespissen er tydelig synlig før du forsøker prosedyren ved å visuelt inspisere apparatet på dataskjermen på forhånd. For det fjerde oppvarmer spissen av endoskopet i varmt vann i noen sekunder et viktig skritt for å sikre at tåke av endoenOmfangstips unngås. Endelig er det også viktig å feste rotten natten før en scopingprosedyre. Hvis maten ikke holdes, er det høyst sannsynlig at de fortsatt vil ha matrester i svelget, noe som gjør injeksjonen praktisk talt umulig å utføre. Rotter skal inspiseres for tegn på dehydrering daglig og veies for å sikre at det ikke er noe signifikant vekttap (større enn 10% kroppsvekt).
To kritiske skritt i utviklingen av protokollen var festet til sprøyten til endoskopet, og bruken av et oralt spekulum. Fast forankring av sprøytekonstruksjonen var nødvendig for å lette enkelthåndsoperasjon for innføring og injeksjon. Tatt i betraktning målene med studien, i fravær av direkte visualisering for å lede injeksjon av vokalfold, kunne eksperimentet ikke ha blitt realisert. I tillegg ble opprettelsen av et muntlig spekulum ansett som viktig for å forhindre tungen i å bevege seg og for å opprettholde denE epiglottis åpen gjennom hele prosedyren.
Den visuelt styrte injeksjonsmetoden under gikk flere modifikasjonsrunder hovedsakelig relatert til å finne den optimale måten å sikkert forankre sprøyten og nålen til endoskopet. Etter testing av flere forskjellige former for tape-klebemidler ble det funnet at kommersielt tilgjengelig elastisk atletisk tape var det beste middel for å forankre sprøyten til endoskopkroppen.
Den største begrensningen av den visuelt styrte injeksjonsmetoden var ikke relatert til instrumentering, men heller til behovet for å ha et patentfarynks og luftvei. Selv om begrensning av mat i 24 timer før prosedyren løste det meste av dette problemet, vil rotter innta noe i sine bur, inkludert sengetøy og avføring. Når dette skjedde, var det to løsninger: (1) utsette injeksjonen inntil dyret rydder sin svælg naturlig, eller (2) forsøk på å fjerne blokkering manuelt ved bruk av tanger. Det var vår erfaringE, at den tidligere var det bedre alternativet fordi det reduserte risikoen for potensiell skade på dyrets faryngeal region.
Gitt nyheten til denne protokollen og behovet for å direkte injisere vokalvalsen med forbindelsen, finnes det ingen andre pålitelige metoder. Gitt den lille størrelsen på dyrene larynx-systemet, visuelt styrt injeksjon gjennom munn- og pharyngeal regionen på den eneste måten å sikre korrekt og konsekvent plassering av forbindelsen i levende dyr. Den eneste andre måten å injisere vokalfoldet direkte var å forsøke å gjøre det fra en ekstern posisjon gjennom strupehinnen og brusk i strupehodet. Selv om denne metoden er vellykket utført hos mennesker som gjennomgår botulinumtoksinterapier for å lindre larynxdystonier, er transkutane injeksjonsmetoder ikke mulige hos små dyr.
Teknikken er robust og kan brukes til ikke bare injeksjon av vokalfold, men for injeksjonssteder innenforDen pharyngeal og orale regioner. I tillegg kan metoden tilpasses for enkel visuell overvåkning av dyrene i strupehulen og larynxområdet ved å fjerne sprøyten.
Oppsummert er denne injeksjonsmetoden et nytt middel for å studere biologiske mekanismer relatert til behandling av aldringsrelaterte stemmedysfunksjoner hos mennesker. Denne metoden har også potensial til å brukes på andre sykdomsmodeller som påvirker voicing, vokalfunksjon, kommunikasjon og svelging hos mennesker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Nasjonalt institutt for døvhet og andre kommunikasjonsforstyrrelser (R21DC010806 til CAM og JCS og R01DC011285 til CAM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurotrophin 4 | Pepro Tech | 450-04 | 200 ng in 50 μL |
| Alzet Osmotic Pump | DURECT Corporation | 2001D | |
| 30 ° endoscope | Stoltz | 61029D | |
| 50 mm 30 gauge 100-μL syringe | Hamilton | 84850 and 201812 | |
| saline (sodium chloride solution) | Sigma-Aldrich | S8776 | |
| ketamine hydrochloride | Henry Schein | 56344 | |
| xylazine hydrochloride | Henry Schein | 33198 | |
| 25 G 5/8 needle | Becton-Dickinson | 305901 | |
| 1 mL syringe | Becton-Dickinson | 309659 | |
| ophthalmic ointment | Henry Schein | 8897 | |
| clippers | Oster | 44-018 | |
| ethanol | Decon | 2716 | |
| iodine (Betadine) | Purdue Pharma L.P. | 606404 | |
| heating pad | Sunbeam | 731-5 | |
| 5-0 nylon suture thread | AD Surgical | PMN-518R6 | |
| crile hemostat | Fine Science Tools | 13005-14 | |
| delicate suture tying forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| meloxicam | Henry Schein | 49756 | |
| carprofen | Merritt Veterinary Supplies | 148700 | |
| antibiotic ointment | Henry Schein | 57110 | |
| acepromizine Aceproject | Henry Schein | 3845 | |
| isoflurane Isothesia | Henry Schein | 50033 | |
| induction box (anesthetizing box) | Harvard Apparatus | 50-0116 | |
| oxygen compressed tank | Scott Gross | UN1072 | |
| plexiglas platform | Small Parts Inc (Amazon) | ||
| rubber tipped forceps | Fine science tools rubber | 11075-00 | |
| liquid rubber for forceps above | Lowe's | 42518 | |
| plastic spectula (BD syringe cut to length) | Becton-Dickinson | 309659 | |
| halogen light source rhino-laryngeal stroboscope | Kay-Pentax | RLS 9100 B | |
| video recorder | Kay-Pentax | ||
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-500G | |
| phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| cryostat Mictotom HM525 | Thermo Scientific | HM 525 | |
| Gill 1 hematoxylin | VWR | 10143-142 | |
| Shandon eosin-Y alcoholic | Thermo Fisher Scientific | 6766007 | |
| anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | S0819 | |
| Texas red-X phalloidin | Sigma-Aldrich | T7471 | |
| alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | B-13422 | |
| Small animal anaesthesia machine | Smiths Medical | CDS 9000 |
References
- Trupe, E. H., et al. Correlates and consequences of eating dependency in institutionalized elderly. J. Am. Geriatrics Society. 34 (3), 192-198 (1986).
- Ward, P. H., Colton, R., McConnell, F., Malmgren, L., Kashima, H., Woodson, G. Aging of the voice and swallowing. Otolaryngol. Head Neck Surg. 100 (4), 283-286 (1989).
- Gay, E. G., Kronenfeld, J. J., Dettmann, F. G. A comparison on the effect of regulation on health care for the older American: a tale of two states. Gerontologist. 34 (6), 787-796 (1994).
- Hagen, P., Lyons, G. D., Nuss, D. W. Dysphonia in the elderly:diagnosis and management of age-related voice changes. South. Med. J. 89 (2), 204-207 (1996).
- Broniatowski, M., et al. Current evaluation and treatment of patients with swallowing disorders. Otolaryngol. Head Neck Surgery. 120 (4), 464-473 (1999).
- Lundy, D. S., et al. Aspiration: cause and implications. Otolaryngol. Head Neck Surg. 120 (4), 474-478 (1999).
- Schindler, J. S., Kelly, J. H. Swallowing disorders in the elderly. Laryngoscope. 112 (4), 589-602 (2002).
- Gambino, D. R., Malmgren, L. T., Gacek, R. R. Age-related changes in the neuromuscular junctions in the human posterior cricoarytenoid muscles: a quantitative study. Laryngoscope. 100 (3), 262-268 (1990).
- Sinard, R. J. The aging voice: how to differentiate disease from normal changes. Geriatrics. 53 (7), 76-79 (1998).
- Baker, K. K., Olson-Raming, L., Sapir, S., Luschei, E. S., Smith, M. E. Control of vocal loudness in young and old adults. J. Speech Lang. Hear Res. 44 (2), 297-305 (2001).
- McMullen, C. A., Andrade, F. H. Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 64 (4), 435-442 (2009).
- Lai, K., Ip, N. Y. Postsynaptic signaling of new players at the neuromuscular junction. J. Neurocytol. 32 (5-8), 727-741 (2003).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24 (1), 677-736 (2012).
- Gonzalez, M., et al. Disruption of Trkb mediated signaling induces disassembly of postsynaptic receptor clusters at neuromuscular junctions. Neuron. 24 (3), 567-583 (1999).
- Hirano, S., Kishimoto, Y., Suehiro, A., Kanemaru, S., Ito, J. Regeneration of aged vocal folds: first human case treated with fibroblast growth factor. Laryngoscope. 118 (12), 2254-2259 (2008).
- Branski, R. C., et al. Effects of transforming growth factor-beta 1 on human vocal fold fibroblasts. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 118 (3), 218-226 (2009).
- Kishimoto, Y., et al. Effects of exogenous hepatocyte growth factor on vocal fold fibroblasts. Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 118 (8), 606-611 (2009).
- Belluardo, N., et al. Neuromuscular junction disassembly and muscle fatigue in mice lacking neurotrophin-4. Mol. Cell. Neurosci. 18 (1), 56-57 (2001).
- Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanisms in the old rat. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68 (12), 1458-1468 (2013).
- Roscow, D. E., Parikh, P., Vivero, R. J., Casiano, R. R., Lundy, D. S. Considerations for initial dosing of botulinum toxin in treatment of adductor spasmodic dysphonia. Oto. HeadNeck Surg. 148 (6), 1003-1006 (2013).
- Benninger, M. S., Hanick, A., Hicks, D. M. Cricothyroid muscle botulinum toxin injection to improve airway for bilateral recurrent laryngeal nerve paralysis, A case series. J. Voice. 30 (1), 96-99 (2016).
- Coppoolse, J. M. S., et al. An in vivo study of composite microgels based on hyaluronic acid and gelatin for the reconstruction of surgically injured rat vocal folds. J. Speech Lang Hear Res. 57 (2), S658-S673 (2014).
- Hertegård, S., et al. Cross-linked hyaluronan used as augmentation substance for treatment of glottal insufficiency: Safety aspects and vocal fold function. Laryngoscope. 112 (12), 2211-2219 (2002).
- Walker, W. F. Jr, Homberger, D. G. Anatomy and dissection of the rat. , Third Edition, W.H. Freeman and Company. New York. (1997).
- Ohno, T., Hirano, S., Rousseau, B. Age-associated changes in the expression and deposition of vocal fold collagen and hyaluronan. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 25 (1), 192-197 (2009).
- Stemple, J. C., et al. Enhancement of aging rat laryngeal muscles with endogenous growth factor treatment. Physiol. Rep. 4 (10), e12798 (2016).
- McMullen, C. A., Andrade, F. H. Contractile dysfunction and altered metabolic profile of the aging rat thyroarytenoid muscle. J. Appl. Phys. 100 (2), 602-608 (2006).
- Engle, W. K., Cunningham, G. C. Rapid examination of muscle tissue. An improved trichrome method for fresh-frozen biopsy section. Neurology. (13), 919-923 (1963).
- Sheehan, D. C., Hrapchack, B. B. Theory and practice of histotechnology. Battelle. , Columbus, OH. (1980).
- Kulakowski, S. A., Parker, S. D., Personius, K. E. Reduced TrkB expression results in precocious age-like changes in neuromuscular structure, neurotransmission, and muscle function. J. Appl. Phys. 111 (3), 844-852 (2011).
- Nishida, N., et al. Age-related change in rat intrinsic laryngeal muscles: analysis of muscle fibers, muscle fiber proteins and subneural apparatuses. Eur Arch Otorhinolaryngol. 270 (3), 975-984 (2013).
