Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para descrever o uso de neurotrofina 4 (NTF4) sistematicamente e diretamente para remodelar os músculos laríngeos do envelhecimento do rato.
Abstract
A disfunção laríngea em idosos é uma das principais causas de incapacidade, de distúrbios de voz à disfagia e perda de reflexos protetores das vias aéreas. Poucas, se houver, existem terapias que visam a disfunção do músculo laríngeo relacionado à idade. As neurotrofinas estão envolvidas na inervação muscular e na diferenciação das junções neuromusculares (NMJs). Pensa-se que as neurotrofinas melhoram a transmissão neuromuscular ao aumentar a liberação do neurotransmissor. As junções neuromusculares (NMJs) tornam-se menores e menos abundantes no envelhecimento dos músculos da laringe do rato, com evidência de desnervação funcional. Nós exploramos os efeitos do NTF4 para o uso clínico futuro como um procedimento terapêutico para melhorar a função no envelhecimento dos músculos da laringe humana. Aqui, fornecemos o protocolo detalhado para aplicação sistêmica e injeção direta de NTF4 para investigar a capacidade do músculo laríngeo do rato em envelhecimento de remodelar em resposta à aplicação NTF4. Neste método, os ratos receberam NTF4 sistematicamente via oBomba smotic ou por injeção direta através das pregas vocais. Os músculos laríngeos foram então dissecados e utilizados para exame histológico de morfologia e denervação relacionada à idade.
Introduction
Os músculos laríngeos se contraem de forma rápida e consistente e são vulneráveis aos efeitos adversos do envelhecimento. Espera-se que essa atividade constante contribua para problemas de voz ou disfagia observados em pessoas com mais de 65 anos de idade 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Vários mecanismos moleculares e fisiopatológicos contribuem para esta disfunção relacionada à idade. Esses mecanismos podem incluir a remodelação da mucosa laríngea, a atrofia ou perda de fibras musculares, a falta de regeneração ou atrofia de fibras musculares que provoca curvatura das pregas vocais e incapacidade de fechamento gloteado 8 , 9 , 10 , 11 . Não há uma terapia médica comprovada neste momento que possa comPrever ou reabilitar essas mudanças relacionadas com a idade desses músculos.
A modulação da eficácia da transmissão neuromuscular pode influenciar significativamente o desempenho neuromotor. A família das neurotrofinas inclui o fator de crescimento nervoso (NGF), o fator de crescimento do nervo derivado do cérebro (BDNF), neurotrofina 3 (NTF3) e NTF4 12 , 13 . Verificou-se que as neurotrofinas modulam a eficácia sináptica 1 , 4 . O fator de crescimento de hepatócitos, o fator de crescimento transformador beta e o fator de crescimento de fibroblastos foram recentemente utilizados em seres humanos para o tratamento de cicatrizes de pregas vocais de 15 a 17 . NTF4 também regula a eficácia NMJ; Ratos com falta de NTF4 mostram NMJs desmontados 11 , 18 , 19 . Esses estudos levam a efeitos promissores do tratamentoT do envelhecimento dos distúrbios do músculo laríngeo e da desnervação com fatores de crescimento.
A terapêutica de injeção direta aos tecidos das pregas vocais não é sem precedentes em seres humanos. Por exemplo, as injeções locais de toxina botulínica são atualmente utilizadas como um tratamento eficaz para distúrbios do movimento neurológico que afetam os músculos da laringe, como a disfonia espasmódica e paralisia bilateral do nervo laríngeo 20 , 21 . O hidrogel de ácido hialurônico é outro injetável, que é usado para tratar a queima de dobras vocais e insuficiência glotal 22 , 23 . A laringoplastia por injeção pode ser usada para tratar uma variedade de distúrbios de comunicação 24 . Esses métodos de injeção direta são promissores para melhorar a função vocal e deglutição no envelhecimento populacional.
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Protocol
Use ratos machos Fischer 344-Brown Norway com 6 e 30 meses de idade para este protocolo. Os ratos foram obtidos da colônia de roedores do Instituto Nacional do Envelhecimento. Utilizamos ratos para este estudo porque a estrutura da laringe de ratos é semelhante à do ser humano, servindo funcionalmente para a proteção das vias aéreas e vocalizações específicas de espécies. Este estudo foi realizado de acordo com a Política PHS sobre Cuidados Humanos e Uso de Animais de Laboratório, O Guia NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, e a Lei de Bem-estar dos Animais (7 USC et seq.); O protocolo de uso de animais foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal (IACUC) da Universidade do Kentucky.
1. Anestesia de ratos
- Prepare os anestésicos misturando cloridrato de cetamina (anestésico dissociativo) e cloridrato de xilazina (sedativo e analgésico) em solução salina tamponada. As concentrações de ketamina e xilazina na solução final são 100 mg / 8 mg por kgPeso corporal, respectivamente.
- Injete os anestésicos no rato por administração intraperitoneal usando uma seringa com uma agulha de 25 G.
- Determine que o rato está suficientemente anestesiado pressionando o pé ou o pé com fórceps. Se o rato não reagir à pitada, a cirurgia pode começar. Se o rato reage à prega do dedo do pé com contrações reflexas ou musculares, espere 1-2 minutos e repita o teste de pitada. Se o rato reage novamente, substitua o rato por um novo animal e repita o procedimento a partir do passo 1.2.
- Aplique pomada oftálmica aos olhos do rato, depois que o rato estiver imóvel, para evitar que as córneas se sectem.
2. Implantação de bomba osmótica
- Coloque o ventral do rato na área cirúrgica asséptica. Administrar meloxicam como medicamento pré-anestésico. Administrar intraperitonealmente a uma dosagem de 1-4 mg / kg de peso corporal usando uma seringa com uma agulha de 25 G.
- Use cortadores para remover uma aproximação1 "x 1" quadrado de pele da parte de trás do pescoço e aproximadamente 1 "caudal de espaço entre os ombros. Rasgue o mais próximo possível da pele.
- Molhe as costas eo pescoço com etanol desinfetante (70%).
- Após o barbear, esfregue o aspecto dorsal do pescoço com 3 esfrega em sucessão de álcool iodo com o álcool.
- Mantenha a temperatura corporal do rato, colocando-o sobre uma almofada de aquecimento ajustada para 34 ° C.
- Preencha as bombas osmóticas preparadas assepticamente com 50 μL de NTF4 ou solução salina para tratamento NTF4 sistêmico ( Figura 1 ).
- Use um bisturi para fazer uma incisão horizontal de aproximadamente 2 cm de largura através da pele, apenas craniana para o espaço entre a escápula. Levante a extremidade posterior da incisão com fórceps com uma mão ao inserir a ponta dos hemostáticos e empurrando suavemente para posterior a incisão.
- Depois que a ponta dos hemostatos é de aproximadamente 2 cm cRanial para a incisão, abra as alças nos hemostáticos, expandindo as pontas para formar um "bolso" oco subcutâneo para o local da incisão. Este será o site de colocação da bomba.
- Oriente o fim do portal de entrega da bomba primeiro após a inserção para minimizar qualquer interação do NTF4 e a cicatrização do site da incisão de bolso.
- Entregue 50 μL de solução salina NTF4 durante 7 14 dias. O grupo de 7 dias recebeu 6,72 mg / dia de NTF4 para uma dose total de 47,04 mg. O grupo de 14 dias recebeu 6,72 mg / dia para uma dose total de 94,08 mg de NTF4 25 .
- Use uma rosca de sutura de nylon 5-0, hemostáticos e fórceps para fechar a incisão feita para a colocação da bomba.
- Observe os ratos durante um mínimo de 30 min à medida que se recuperam da anestesia. Os critérios para a conclusão do monitoramento incluem o animal se tornando ativo, movendo-se sobre a gaiola, bebendo água e iniciando outras atividades normais, como a preparação.
- Monitore animais diariamenteDurante a primeira semana, observando a cicatrização do local cirúrgico, alimentação normal e consumo de água e passagem de urina / fezes e quaisquer sinais comportamentais anormais de estresse, dor ou outras complicações pós-operatórias.
- Se o rato parece estar com dor ou angústia, forneça ao rato uma injeção subcutânea de 5 mg / kg de carprofeno uma vez a cada 24 h por até 5 dias para aliviar a dor.
- Se parece haver uma infecção, consulte um veterinário para que a ferida se cure adequadamente.
- Dependendo de qual grupo experimental o rato dentro, remova a sutura de nylon 5-0 7-10 dias após a cirurgia para evitar irritação da rosca.
3. Anestesia de ratos para injeção direta
- Retire o alimento dos ratos a noite anterior ao procedimento. Isso garante que não há alimentos para bloquear o endoscópio ou a agulha de injeção.
- Pesar ratos e preparar acepromazina 1-2 mg / kg de peso corporal. Injetar por via intramuscular (a localização IM é aMúsculo tireo-arteronóide esquerdo).
- Coloque o rato na caixa de indução. Induzir anestesia na caixa de indução com 5% de isoflurano e 1 LO 2 .
- Mova o rato para um cone do nariz com 2% de isoflurano e 600 mL de O2.
- Determine que o rato está suficientemente anestesiado pressionando o pé ou o pé com fórceps. Se o rato não reagir à pitada, o protocolo de injeção pode começar. Se o rato reage à prega do dedo do pé com contrações reflexas ou musculares, espere 1-2 minutos e repita o teste de pitada. Se o rato reage de novo, substitua o rato por um novo animal e repita o procedimento a partir do passo 3.4.
4. Injeção direta e visualização
- Coloque doses 50 μL preparadas assepticamente contendo NTF4 ou solução salina em um banho de H 2 O ajustado a 25 ° C durante 30 min antes da injeção.
- Coloque o rato em posição supina e reclinada em uma plataforma de plexiglass ( Figura 2 ). SusColoque o rato na postura reclinada de seus incisivos superiores frontais através de um fio guia empurrado pela parte superior da plataforma.
- Anexe uma seringa de 50 mm, 30 gauge, 100 μL a um endoscópio sinusal de 1,9 mm, 30 ° ( Figura 3 ).
NOTA: A montagem da seringa está presa através de um gabarito que segura a cânula firmemente na parede externa do endoscópio. O endoscópio permite a visualização das pregas vocais e a orientação da seringa intra-oralmente. A posição da ponta da cânula é ajustada antes de cada animal para garantir que a ponta seja totalmente e claramente visível através da visão endoscópica ( Figura 4 ). - Use um par de fórmulas de borracha para estender a língua e movê-la lateralmente. Depois, insira um espéculo de plástico para manter a permeabilidade oral. Faça o espéculo de um tambor de seringa de plástico de 5 mL que é cortado para um comprimento de 1,5 a 2 cm, com as bordas cortadas deburadas e polidas lisas.
- Desligue as luzes no rooM e coloque uma fonte de luz halógena no endoscópio. Ligue o gravador de vídeo para capturar o procedimento.
- Mergulhe a extremidade distal do endoscópio em água morna por alguns segundos para minimizar o desenvolvimento de condensação na ponta de vidro quando inserido na boca do rato.
- Usando feedback visual do monitor, guie cuidadosamente a agulha na área da prega vocal esquerda.
- Tempo de injeção da solução com a fase inspiratória do ciclo de respiração dos animais para acessar completamente a prega vocal. Durante a fase inspiratória da respiração, a prega vocal é totalmente exposta.
- Uma vez que a prega vocal é totalmente visível, insira a agulha no tireoaritenóide esquerdo, encontrado lateral à borda mediana branca da prega vocal. Com a agulha no lugar, entregue o injeção através da depressão da seringa.
- Desligue a fonte de luz halógena no endoscópio e no reprodutor de vídeo e volte-se no roOm luzes.
- Retorne o rato para a sua gaiola de casa e coloque em uma almofada de aquecimento.
- Permita que o rato se recupere antes da remoção da almofada de aquecimento. Substitua alimentos e água na gaiola.
- Monitorar ratos durante 7 dias após a injeção e, em seguida, eutanizar. Remova as laringes para crioesecção 24 .
5. Eutanização de ratos
- Anestesiar ratos com cloridrato de cetamina e cloridrato de xilazina (100 mg / 8 mg por kg de injeção intraperitoneal injetada no peso corporal).
- Eutanizar por exsanguinação após uma toracotomia mediana.
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Representative Results
Os ratos foram eutanásicos após 2 semanas de infusão de bomba osmótica ou 1 semana após a injeção direta de NTF4. Larynges foram colhidos, colocados em crioprotectores (30% de sacarose e 70% de solução salina tamponada com fosfato) e depois seccionados em série em 10 μm de largura com um criostato. O envelhecimento dos músculos laríngeos é afetado pela administração de NTF4 25 . Além de ratos jovens e velhos, comparamos o lado injetado e não injetado dos músculos tireotomielitanos. Normalmente, vemos uma alteração no tamanho da fibra com a idade, que varia com base na via de administração de NTF4 ( Figura 5 ). Menos fibrose também é observada qualitativamente após o tratamento. A porcentagem de fibras denervadas diminui com a aplicação sistêmica e direta de NTF4 em ratos idosos ( Figura 6 ). A quantidade de NMJs também aumenta ( Figura 7 ). O significado desse aumento de Depende do tempo de tratamento ou via de administração.
Figura 1: Imagem representativa da bomba osmótica. Após o enchimento da bomba com NTF4, o moderador de fluxo é inserido no corpo principal para selar a bomba.
Figura 2: Plataforma para Procedimento de Injeção. O rato é colocado em uma postura supina na plataforma e suspenso pelos incisivos superiores frontais através de um fio guia montado no topo da plataforma. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3: Imagem representativa da seringa. Encha a seringa com NTF4 e solução salina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Procedimento de Injeção. ( A ) A seringa é acoplada a um endoscópio de 19,9 mm 30 ° (mostrado); (B) A luz óptica é verificada para se certificar de que há luz para o procedimento; ( C ) O vídeo em tempo real garante que a agulha seja guiada para o local certo.
Figura 5: Mudanças no tamanho da fibra e na morfologia. Representante eleSeções de coloração com matoxilina e eosina de NTF4 sistêmico tratados com 7 dias de tratamento (à direita) e músculos tireoaritenóides não tratados (à esquerda) aos 30 meses de idade 26 , 27 , 28 . Existe um aumento no tamanho da fibra do controle para os animais tratados. O tratamento com NTF4 altera o tamanho da fibra de 30 m para o de um animal mais novo de 6 meses de idade. * P <0,05 versus 30 meses (as imagens foram capturadas com uma ampliação de 40X; barra de escala = 25 μm, P <0,001). As setas no ponto de imagem superior a uma área de fibrose. Há também uma diminuição qualitativa da fibrose nos animais tratados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Mudanças no interiorCom tratamento NTF4. Seções manchadas de Nav1.5 representativas dos músculos tiroteroenceóides sistematicamente NTF4 de 14 dias tratados (à direita) e não tratados (à esquerda) aos 30 meses de idade (as imagens foram capturadas a uma ampliação de 40X, barra de escala = 25 μm) 29 . Existe uma redução da denervação com a idade pela rotulagem Na v 1.5 (verde). O painel esquerdo é representativo Na v 1.5 (verde) e faloidina, para denotar fibras (vermelhas) secções coradas de músculos tireoaritenóides não tratados, o painel direito é tratado com músculos. A inserção verde é a coloração de Na v 1.5 sozinha.
Figura 7: Mudanças nos NMJs com tratamento NTF4. Imagens de microscopia de fluorescência representativas de NMJs de seções musculares tratadas com NTF4 sistêmicas de 14 dias de diferentes animais marcados com a-bungarotoxina (verde) ePhalloidin (vermelho) mostrando que o número NMJ aumenta com o tratamento com NTF4 a 30 meses (Scale bar = 25 μm), (P <0,001) 11 .
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Discussion
Os músculos laríngeos são vulneráveis aos efeitos desfavoráveis do envelhecimento. Estudos anteriores demonstraram alterações nos músculos da laringe envelhecidos que incluem mudanças no tamanho da fibra, número total de fibras, capacidade regenerativa, tamanho NMJ e alterações quantitativas, além de variações na função contrátil e mudanças da isoforma da miosina 4 , 11 , 27 , 30 , 31 . O envelhecimento do músculo laríngeo pode ser alterado pela aplicação de neurotrofinas. Essas mudanças podem ser prontamente medidas. Portanto, os músculos laríngeos do rato fornecem um modelo útil para estudar os efeitos do envelhecimento e doenças / distúrbios vocais. O estudo desses músculos também pode ajudar a desenvolver intervenções ou processos de proteção no envelhecimento humano.
Nosso método de aplicação sistemática ou direta de NTF4 produz uma resposta de remodelação no envelhecimento da laringe do ratoMúsculos. Isso demonstra que as neurotrofinas podem ter potencial terapêutico na disfunção muscular relacionada ao envelhecimento. A aplicação direta de neurotrofinas pode ser facilmente traduzida para o modelo humano de envelhecimento vocal através de vetores de injeção 25 .
Existem muitos fatores a serem considerados ao usar o protocolo de injeção. Em primeiro lugar, deve-se ter cuidado para evitar riscos e lesões nos tecidos moles ao redor do vestíbulo laríngeo, considerando que a ponta do endoscópio possui uma agulha afiada. Em segundo lugar, o sincronismo do movimento da ponta da agulha na laringe durante a fase inspiratória do ciclo respiratório dos animais leva a prática para medir com precisão a injeção. Em terceiro lugar, assegure-se de que a ponta da agulha seja claramente visível antes de tentar o procedimento, observando visualmente o aparelho no monitor do computador de antemão. Em quarto lugar, o aquecimento da ponta do endoscópio em água quente por alguns segundos é um passo importante para garantir que o embaçamento do endoA ponta do escopo é evitada. Finalmente, também é importante acelerar o rato na noite anterior a qualquer procedimento de escopo. Se o alimento não for retido, é altamente provável que eles ainda tenham resíduos de comida na faringe, o que torna o procedimento de injeção praticamente impossível de realizar. Os ratos devem ser inspecionados por sinais de desidratação diariamente e pesados para garantir que não haja perda de peso significativa (maior que 10% do peso corporal).
Dois passos críticos no desenvolvimento do protocolo foram a anexação da seringa ao endoscópio e o uso de um espéculo oral. A ancoragem firme da montagem da seringa era necessária para facilitar a operação de uma só mão para inserção e injeção do escopo. Considerando os objetivos do estudo, na ausência de visualização direta para orientar a injeção da prega vocal, o experimento não poderia ter sido realizado. Além disso, a criação de um espéculo oral foi considerada importante para impedir que a língua se movesse e para manterE epiglote aberta ao longo do procedimento.
O método de injeção guiada visualmente foi várias rodadas de modificação principalmente relacionadas à busca do melhor meio de ancoragem segura da seringa e da agulha no endoscópio. Depois de testar várias formas diferentes de adesivos de fita, verificou-se que a fita elástica comercialmente disponível era o melhor meio de ancorar a seringa no corpo do endoscópio.
A maior limitação do método de injeção guiada visualmente não estava relacionada à instrumentação, mas sim à necessidade de ter uma patente de faringe e via aérea. Apesar de restringir os alimentos durante 24 horas antes do procedimento resolvido a maior parte desta questão, os ratos vão ingerir qualquer coisa em suas gaiolas, incluindo cama e fezes. Quando isso ocorreu, houve duas soluções: (1) adiar a injeção até que o animal limpe a faringe naturalmente, ou (2) tentar remover o bloqueio manualmente usando fórceps. Foi nossa experiênciaE, que o primeiro foi a melhor opção porque reduziu o risco de lesões potenciais na região faríngea do animal.
Dada a novidade deste protocolo e a necessidade de injetar diretamente a prega vocal com o composto, não existem outros métodos confiáveis. Dado o pequeno tamanho do sistema laríngeo dos animais, a injeção guiada visualmente através da região oral e faríngea da única maneira de garantir a colocação correta e consistente do composto no animal vivo. O único outro meio de injeção direta da prega vocal foi tentar fazê-lo a partir de uma posição externa através da pele e da cartilagem da laringe. Embora este método seja realizado com sucesso nos seres humanos submetidos a terapias de toxina botulínica para aliviar as distonias laríngeas, os métodos de injeção transcutânea não são viáveis em animais pequenos.
A técnica é robusta e pode ser usada não só para injeção da prega vocal, mas também para locais de injeção dentroAs regiões faríngea e oral. Além disso, o método pode ser adaptado para o monitoramento visual simples da região faríngea e laríngea dos animais, removendo a seringa.
Em resumo, este método de injeção é um novo meio para estudar mecanismos biológicos relacionados ao tratamento de disfunções de voz relacionadas ao envelhecimento em seres humanos. Este método também tem o potencial de ser aplicado a outros modelos de doenças que afetam a voz, a função vocal, a comunicação e a deglutição em seres humanos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por bolsas do Instituto Nacional de Surdez e Outros Transtornos de Comunicação (R21DC010806 para CAM e JCS e R01DC011285 para CAM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurotrophin 4 | Pepro Tech | 450-04 | 200 ng in 50 μL |
| Alzet Osmotic Pump | DURECT Corporation | 2001D | |
| 30 ° endoscope | Stoltz | 61029D | |
| 50 mm 30 gauge 100-μL syringe | Hamilton | 84850 and 201812 | |
| saline (sodium chloride solution) | Sigma-Aldrich | S8776 | |
| ketamine hydrochloride | Henry Schein | 56344 | |
| xylazine hydrochloride | Henry Schein | 33198 | |
| 25 G 5/8 needle | Becton-Dickinson | 305901 | |
| 1 mL syringe | Becton-Dickinson | 309659 | |
| ophthalmic ointment | Henry Schein | 8897 | |
| clippers | Oster | 44-018 | |
| ethanol | Decon | 2716 | |
| iodine (Betadine) | Purdue Pharma L.P. | 606404 | |
| heating pad | Sunbeam | 731-5 | |
| 5-0 nylon suture thread | AD Surgical | PMN-518R6 | |
| crile hemostat | Fine Science Tools | 13005-14 | |
| delicate suture tying forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| meloxicam | Henry Schein | 49756 | |
| carprofen | Merritt Veterinary Supplies | 148700 | |
| antibiotic ointment | Henry Schein | 57110 | |
| acepromizine Aceproject | Henry Schein | 3845 | |
| isoflurane Isothesia | Henry Schein | 50033 | |
| induction box (anesthetizing box) | Harvard Apparatus | 50-0116 | |
| oxygen compressed tank | Scott Gross | UN1072 | |
| plexiglas platform | Small Parts Inc (Amazon) | ||
| rubber tipped forceps | Fine science tools rubber | 11075-00 | |
| liquid rubber for forceps above | Lowe's | 42518 | |
| plastic spectula (BD syringe cut to length) | Becton-Dickinson | 309659 | |
| halogen light source rhino-laryngeal stroboscope | Kay-Pentax | RLS 9100 B | |
| video recorder | Kay-Pentax | ||
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-500G | |
| phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| cryostat Mictotom HM525 | Thermo Scientific | HM 525 | |
| Gill 1 hematoxylin | VWR | 10143-142 | |
| Shandon eosin-Y alcoholic | Thermo Fisher Scientific | 6766007 | |
| anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | S0819 | |
| Texas red-X phalloidin | Sigma-Aldrich | T7471 | |
| alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | B-13422 | |
| Small animal anaesthesia machine | Smiths Medical | CDS 9000 |
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