Summary
Abbiamo effettuato l'occlusione unilaterale dell'arteria carotica postnatale giorno 7-10 CD-1 del mouse cuccioli per creare un modello di (HI) hypoxic-ischemica neonatale e studiato gli effetti del trauma cranico HI. Abbiamo studiato le funzioni neurobehavioral in questi topi rispetto ai topi normali non azionato.
Abstract
Abbiamo effettuato l'occlusione unilaterale dell'arteria carotica su topi CD-1 per creare un modello neonatale ipossico-ischemica (HI) ed abbiamo studiato gli effetti della ferita di cervello neonatale HI studiando le funzioni neurobehavioral in questi topi rispetto ai non-funzionati (vale a dire, topi normali). Durante lo studio, metodo di riso-Vannucci è stato usato per indurre il danno di cervello neonatale HI nei topi di postnatale giorno 7-10 (P7-10). L'operazione di HI è stata eseguita su cuccioli di legatura unilaterale dell'arteria carotica e l'esposizione all'ipossia (8% O2 e 92% N2 per 90 min). Una settimana dopo l'operazione, i cervelli danneggiati sono stati valutati con l'occhio nudo attraverso il cranio semi-trasparente e sono stati categorizzati in sottogruppi basati sull'assenza ("nessuna lesione corticale" gruppo) o presenza (gruppo "lesione corticale") di lesioni corticali, ad esempio una lesione nell'emisfero destro. Settimana 6, sono stati eseguiti i seguenti test di neurobehavioral per valutare le funzioni cognitive e motorie: scaletta (PAT), compito di evitare passivo walking test e test di forza di presa. Questi test comportamentali sono utili per determinare gli effetti della ferita di cervello neonatale HI e sono utilizzati in altri modelli murini di malattie neurodegenerative. In questo studio, topi neonatali di lesioni cerebrali HI ha mostrato i deficit del motore che ha corrisposto a danno di giusto emisfero. I risultati dei test comportamentali sono rilevanti per i deficit osservati nei pazienti affetti da HI neonatali, come paralisi cerebrale o pazienti neonatali del colpo. In questo studio, un modello murino di ferita di cervello neonatale HI era stabilito e ha mostrato diversi gradi di deficit motori e danno conoscitivo rispetto ai topi non azionato. Questo lavoro fornisce informazioni di base sul modello del topo di HI. Immagini di risonanza magnetica dimostrano i fenotipi diversi, separati in base alla gravità del danno cerebrale da prove motorie e cognitive.
Introduction
Ferita di cervello HI neonatale si verifica durante la prima infanzia (circa due pazienti per 1.000 bambini)1,2,3,4,5. Studi per quanto riguarda la ferita di cervello neonatale HI sono importanti, e utilizzando HI, un cervello stabilito neonatale ferita modello murino può facilitare la ricerca preclinica in vivo sulla lesione cerebrale HI.
I modelli tradizionali di HI sono utilizzati su ratti adulti6. Per il modello di neonato, il metodo di riso-Vannucci è comunemente usato il P7 ratti7,8. Tuttavia, poiché i ratti e topi sono leggermente diversi9,10, anche se sono entrambi roditori, abbiamo effettuato un metodo modificato di riso-Vannucci su CD-1 cuccioli a P7-10, sulla base di studi precedenti che hanno mostrato che P7-10 è il periodo caratterizzato da oligodendrociti immaturi, corrispondente al termine umano P011,12. Il modello di mouse HI neonatale è stabilito attraverso sia la legatura dell'arteria carotidea unilaterale e l'esposizione dei topi all'ipossia con 8% di ossigeno in P7-10 cuccioli.
I topi sottoposti alla procedura ha mostrata vari gradi di lesioni cerebrali nella zona posterolateral dell'emisfero destro. Per identificare i deficit cognitivi e motori, neurobehavioral valutazioni fondate su PAT, scaletta walking test e test di forza di presa sono stata eseguita. Sono state analizzate le differenze tra non-funzionati (cioè, normale) e topi HI. Questo lavoro presenta informazioni di base sul modello del topo di HI. Le immagini di MRI mostrano i diversi fenotipi, separati secondo la severità di danni di cervello usando le prove motorie e cognitive.
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Protocol
Tutti gli animali sono stati alloggiati in una gabbia standard (27 × 22.5 × 14 cm3) in una struttura accreditata dall'associazione per la valutazione e l'accreditamento di laboratorio animale cura (AAALAC) e dato cibo e acqua ad libitum sotto alternando 12-h chiaro/scuro cicli. Gli autori hanno seguito la normativa sulla protezione degli animali, e le procedure sperimentali sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso Comitato di Yonsei University College of Medicine (No. IACUC 2010-0252; 2013-0220).
1. Mouse modello di lesione cerebrale neonatale HI
- Anestetizzare i cuccioli con isoflurano.
- Posizionare i cuccioli (meno di 5) in una scatola anestetizzante e chiudere il coperchio.
- Accendere il sistema anestetizzante per circa 15 min; regolare il gas e isoflurano utilizzando una macchina di anestesia superiore della tabella. Regolare il flussometro ossigeno a 1,5 L/min regolare il vaporizzatore di isoflurane per 3-5% per l'induzione dell'anestesia.
- Dopo 15 min, regolare il vaporizzatore di isoflurane per 1-2% per il mantenimento dell'anestesia.
- Posare un cucciolo completamente anestetizzato sotto un microscopio di dissezione (addome rivolto verso il ricercatore) e fissarlo con nastro adesivo.
- Fare un'incisione di ~0.7-mm nel collo utilizzando forbici sterilizzate.
- Con attenzione rimuovere il tessuto adiposo utilizzando pinze sterili ed esporre l'unilaterale dell'arteria carotica di destra.
- Legare l'arteria carotica di destra unilaterale con una sutura riassorbibile 5-0.
- Sutura l'incisione nel collo con sutura 5-0.
- Posizionare ogni cucciolo in una camera ipossica calda di 37 ° C per 1 h per il recupero. Non chiudere il coperchio della camera.
- 1 h dopo l'intervento chirurgico, quando i cuccioli sono completamente svegli, chiudere il coperchio della camera di ipossia e fanno diminuire i livelli di gas per stabilire condizioni di ipossia (8% O2 e 92% N2).
- Dopo 90 min di ipossia, restituire i cuccioli nelle loro gabbie.
- Una settimana dopo la ferita di cervello di HI, ripetere il passaggio 1.
- Dopo l'anestesia, praticare un'incisione nel cuoio capelluto con forbici sterilizzate e forcipe per identificare la lesione di cervello in zona posterolateral dell'emisfero destro.
Nota: Questo trattamento induce ipossia nei cuccioli. La presenza e l'entità del trauma cranico in tutti i topi è valutata visivamente con l'occhio nudo attraverso il cranio semi-trasparente. Come determinato dalla dimensione o il volume dello sbiadimento (cioè, la lesione di cervello), i cuccioli sono classificati in gruppi. Se non c'è nessuna lesione corticale visibile, il mouse è classificato nel gruppo "nessuna lesione corticale". Se c'è una lesione corticale visibile (cioè, una lesione nell'emisfero destro), il mouse è classificato nel gruppo "lesione corticale". Poiché la classificazione dei topi in gruppi è fatta una settimana dopo l'operazione, i raggruppamenti possono essere modificati quando le morfologie dei campioni del cervello sono chiaramente definite al momento del sacrificio1,2,3, 4.
- Dopo l'anestesia, praticare un'incisione nel cuoio capelluto con forbici sterilizzate e forcipe per identificare la lesione di cervello in zona posterolateral dell'emisfero destro.
Figura 1: Modellazione neonatale cranico HI in topi.
(A) un cucciolo di sette-giorno-vecchio mouse ha subito la chirurgia e l'arteria carotica di destra unilaterale è stata legata. (B) cuccioli sono stati collocati in una camera ipossica per 90 min con 8% O2 e 92% N2. (C, D ed E) I cervelli con lesioni HI neonatale ha mostrato varie gravità dei danni e sono stati categorizzati in base al grado di danno. Alla settimana 14, i cervelli sono stati ottenuti, e le lesioni sono state visualizzate. (C) immagine di un cervello che è classificato come una "nessuna lesione corticale". Sia (D) ed (E) sono state classificate nel gruppo "lesione corticale". (F, G e H) Rappresentante MRI di (C), (D) e (E) topi, rispettivamente. (F) il danno nell'ippocampo è indicato con una freccia gialla, e lesioni nell'emisfero destro sono anche indicate con frecce gialle (G e H). Scala bar = 1 mm Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
2. neonatale test comportamentali
Nota: Qui, i test comportamentali sono stati eseguiti a 6 settimane dell'età.
-
Compito passivo dell'evitare.
Nota: Per valutare la funzione di memoria basato sull'apprendimento e l'evitare di uno stimolo avversivo, un due-vano passaggio-attraverso PAT dovrebbe essere condotto13,14,15,16.- Inserire un mouse nel vano luminoso della casella di navetta di Plexiglas (41,5 × 21 × 35 cm3) di un apparato PAT.
- Dopo 30 s, aprire la porta a ghigliottina e registrare il tempo di latenza per il mouse per spostare nel vano scuro (fino a 300 s).
- Chiudere la porta a ghigliottina quando tutte e quattro le membra del mouse sono completamente all'interno del vano scuro.
- Somministrare shock elettrici del piede (0.5 mA) 2 s e ritorno il mouse alla sua gabbia.
- Sostituire il mouse nel vano luminoso 24 h dopo lo shock elettrici del piede.
- Aprire la ghigliottina porta 10 s dopo il mouse è completamente inserito nel vano luminoso e registrare il tempo di latenza per il mouse per spostare nel vano scuro (fino a 300 s).
-
Test di camminata di scaletta.
Nota: L'attività di ambulante del gradino scala consente per la discriminazione tra sottili disturbi della funzione motoria combinando qualitativa e analisi quantitative di qualificati a piedi17,18.- Attivare una videocamera.
- Posizionare un mouse sul pannello di inizio della scala e iniziare immediatamente la registrazione.
- Registrare i video, concentrandosi sugli arti del mouse.
- Interrompere la registrazione quando il mouse tocca l'ultimo pannello della scala. Ripetere il viaggio avanti e indietro quattro volte.
- Analizzare la registrazione video e manualmente contare il numero di foglietti di ogni zampa anteriore, come segue:
- Giocare la registrazione del video su un computer a una velocità lenta (0,1 x) e contare i passi manualmente.
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Prova di resistenza di aderenza.
Nota: La prova di forza di presa viene eseguita utilizzando un misuratore di forza di presa, che comprende un estensimetro push-pull.- Difficoltà l'apparato di forza di presa su un pannello di acrilico.
- Posizionare il mouse sul pannello acrilico e tenere la coda.
- Spostare la mano che tiene la coda così che possa raggiungere il mouse e il grip il filo metallico dell'apparato.
- Consentire prove multiple, fino a quando il mouse afferra un pezzo triangolare di filo metallico (2 mm di diametro); la forza massima viene automaticamente registrata in grammi dall'apparato.
Nota: Utilizzare la forza di picco media di tre prove per analisi19,20,21.
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Representative Results
Tutti i dati sono espressi come media ± errore standard della media (SEM). Il confronto di variabili fra i due gruppi è stata condotta utilizzando un indipendente o la coppia t-prova il software statistico SPSS. Un p-valore < 0.05 è stato considerato statisticamente significativo.
I cervelli con lesioni HI neonatale ha mostrato diverse gravità del danno e sono stati categorizzati in conseguenza (Figura 1- E). I cervelli sono stati ottenuti alla settimana 14, e le lesioni sono state visualizzate. Figura 1 Mostra un cervello che è classificato come un cervello "nessuna lesione corticale", Figura 1 Mostra un cervello Classificato come una lesione lieve, e Figura 1E Mostra un cervello gravemente danneggiato. Sia lieve (D) e (E) le lesioni severe sono state classificate nel gruppo "lesione corticale". Dopo l'operazione di HI, 13-settimana-vecchi topi erano imaged usando MRI, e i risultati (Figura 1F-H) sono immagini rappresentative di (C), (D) e le lesioni (E), rispettivamente. Anche se non c'era nessuna lesione significativa sulla morfologia del cervello, l'immagine di MRI ha mostrato lesioni hippocampal (Figura 1F). Danni all'ippocampo (Figura 1F, indicato con una freccia gialla) sono leggermente apparenti nel cervello leggermente ferito. In un cervello gravemente danneggiato, il mouse ha perso gran parte dell'emisfero destro (Figura 1 e H, indicato con una freccia gialla).
Poiché il cervello con la ferita di HI ha mostrato lesioni hippocampal (Figura 1F-H), i topi con lesioni HI ha esibito memoria deficit rispetto ai topi normali. Prestazioni di PAT sono strettamente correlati al hippocampal danno13,15,16,19. La figura 2 Mostra che i topi con lesioni HI hanno avuti più deficit cognitivi rispetto i topi normali13, come valutato nel PAT (normale n = 10; HI n = 9). Una differenza statisticamente significativa è stata osservata tra il basale e il test della memoria di 24 h in topi normali, come mostrato nella Figura 2A (*p = 0,003 basato su una coppia t-test). Figura 2B Mostra i cambiamenti cognitivi funziona nei topi HI lesioni rispetto ai normali topi (delta (Δ) è la differenza tra il basale e il test 24-h)13.
Perché solo l'emisfero destro è stato danneggiato, i topi di ferita di cervello HI neonatali ha mostrato emiplegica funzioni motorie. La differenza nella percentuale di scivola sui pioli della scala rispetto al numero totale di passi compiuti da ogni arto anteriore trasversali è stata utilizzata per confrontare i topi normali con la ferita di cervello neonatale HI topi17,19. La figura 3 Mostra che il tasso di slittamento dell'arto anteriore controlaterale nei topi di ferita di cervello HI era significativamente superiore a quello in topi normali (normale n = 19; Ciao n = 18; *p = 0,010 basato su un indipendente t-test)22, ma nessuna differenza è stata osservata nell'arto anteriore ipsilateral(p = 0.798 basato su un indipendente t-test).
Inoltre, poiché la forza prensile coinvolge la corteccia motoria nel cervello, i gruppi di lesioni corticali e normale hanno mostrato differenze in power grip. Anche se i risultati dalla forza di presa della prova ha mostrato alcuna differenza tra il normale e nessun topo lesione corticale (Figura 4A; normale n = 4; Nessuna lesione corticale n = 12), il grafico mostra che il potere di presa dell'arto anteriore controlaterale era significativamente più debole nei topi lesione corticale che nei topi normali (Figura 4B; normale n = 4; lesione corticale n = 36; *p = 0,036 basato su un indipendenti t-test)21,22,23.
Figura 2: PAT nella ferita di cervello neonatale HI e dei topi normali.
(A) il tempo di latenza nel vano luminoso è stato misurato e confrontato fra la ferita di cervello neonatale HI e topi normali (n = 9 e n = 10, rispettivamente). (B) la misura al momento della scossa elettronica è stata considerata la linea di base, e memoria a lungo termine è stata valutata 24 h dopo la scossa elettrica. Latenza di 24-h Delta (Δ) era la differenza tra la funzione calcolata a 24 h e alla linea di base. p< 0,05; tutti i dati sono espressi come la media ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Tasso di slittamento Forelimb nella scala a piedi di prova.
Le tariffe di slittamento di zampa anteriore controlaterale ed ipsilateral sono state valutate tra il normale e HI cervello lesioni topi (n = 19 e n = 18, rispettivamente). p< 0,05; tutti i dati sono espressi come la media ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Prova di resistenza di aderenza nella ferita di cervello neonatale HI e dei topi normali.
Power grip dell'arto anteriore controlaterale è stato valutato e confrontato tra lesioni normale, no corticale (A) e (B) corticale lesione topi (n = 4, n = 12, n = 36). * p< 0,05; tutti i dati sono espressi come la media ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo studio, abbiamo indotto HI trauma cranico in un mouse P7-10 CD-1 neonatale ed abbiamo identificato la lesione di cervello con rilevanti deficit cognitivi e motori. Durante questa procedura, l'occlusione dell'arteria carotica di destra unilaterale era critica. In questo passaggio, l'arteria potrebbe essere danneggiato e strappato. Maggior parte dei cuccioli che ha avvertito una rottura dell'arteria è morto. Al contrario, se i ricercatori legato un'altra vena di sangue invece l'arteria carotica di destra unilaterale, il cervello del cucciolo è stato solo lievemente danneggiato e nessun fenotipo significativo hanno potuto essere osservato24.
In questo studio, a causa delle variazioni in topi e volume della lesione, i cervelli sono stati suddivisi in diversi gruppi (Figura 1 C-H). Molti topi con cervelli lievemente feriti ha avuto danni solo nell'ippocampo e non nella regione corticale (Figura 1F)13. Al contrario, molti topi con cervello gravemente danneggiato, perso la maggior parte dell'emisfero destro e le cortecce sono stata gravemente danneggiati (Figura 1 e H). Pertanto, i ricercatori dovrebbero identificare le dimensioni della lesione una settimana dopo la procedura19,25. Dal momento che i cervelli sono stati valutati usando le esplorazioni di MRI, la determinazione del volume e le dimensioni di una lesione era più affidabile. Si consiglia, pertanto, che i ricercatori valutano il cervello con la risonanza magnetica, anche se l'ispezione visiva con l'occhio nudo è anche fattibile.
Paralisi cerebrale si verifica comunemente durante la prima infanzia, con un tasso di incidenza di circa due pazienti per 1.000 bambini5. Poiché il modello di mouse HI neonatale potrebbe essere un modello rappresentativo di paralisi cerebrale o ictus neonatale4,11,26, le informazioni di base da questo studio possono essere utilizzate nella ricerca preclinica su paralisi cerebrale o stroke neonatale.
Le valutazioni neurocomportamentali sono utili per identificare i fenotipi dei deficit cognitivi e motori13. Le valutazioni di neurobehavioral introdotte in questo studio inoltre sono adattabili e sono comunemente usate per altre malattie neurodegenerative, come Huntington, morbo di Parkinson e così via. I ricercatori dovrebbero essere informati che, durante il PAT, soggetti ricevano una scossa elettrica. Pertanto, deve essere eseguito PAT Ultima, così la scossa elettrica non pregiudica le altre valutazioni comportamentali.
Per ulteriori approfondimenti, i ricercatori hanno bisogno di studiare un gruppo sham-operated in confronto al gruppo di HI. Per un gruppo di controllo specifico, i ricercatori possono fare un'incisione sul collo e chiudere l'incisione senza qualsiasi legatura dell'arteria. Per simulare il funzionamento di HI, questi cuccioli dovrebbero essere messo nella camera ipossica, ma senza ipossia, per la stessa quantità di tempo come un gruppo HI prima di tornare nelle loro gabbie.
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Disclosures
Gli autori non hanno concorrenti interessi.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto da borse di studio dal National Research Foundation (NRF-2014R1A2A1A11052042; 2015M3A9B4067068), il Ministero della scienza e tecnologia, Repubblica di Corea, coreano Health Technology R & D Project (HI16C1012), Ministero della salute & Benessere, Repubblica di Corea e il programma di assistenza "Dongwha" ricerca Facoltà di Yonsei University College of Medicine (6-2016-0126).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hypoxic chamber | Jeung Do Bio & Plant Co | Experimental Builder | |
| PAT apparatus | Jeung Do Bio & Plant Co | Experimental Builder | |
| The ladder rung walking | Jeung Do Bio & Plant Co | Experimental Builder | |
| SDI Grip Strength System | San Diego Instruments Inc. | ||
| Grip-Strength Meter | Ugo Basile | 47200 | |
| Harvard Apparatus Fluovac anesthetizing system | Harvard Apparatus | ||
| Anesthetizing box | acryl box | ||
| I-Fran Liquid (Isofluorane) | Hana Pharm. Co., Ltd. | General Anesthetics ( isoflurane 100ml) | |
| CD-1 mice | Orient Co., Ltd. | ||
| Blue Nylon Mono Non-Absorbbable suture 5-0 50cm | Ailee Co., Ltd. | NB 521 | |
| IBM SPSS Statistics | IBM | Ver. 23 |
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