Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Modeling Neuronal død og Degeneration i musen primære cerebellare granulet neuroner

Published: November 6, 2017 doi: 10.3791/55871
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,2,4
1Lady Davis Institute for Medical Research, Jewish General Hospital, 2Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 3Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa, 4Department of Oncology, Faculty of Medicine, McGill University

Summary

Denne protokol beskriver en simpel metode til isolering og dyrkning af primære mus cerebral granulet neuroner (CGNs) fra 6-7 dage gamle hvalpe, effektiv transduktion af CGNs for tab og gevinst på funktion undersøgelser, og modellering NMDA-induceret neuronal excitotoxicity, lav-kalium-induceret celledød, DNA-skader og oxidativt stress ved hjælp af den samme kultur model.

Abstract

Cerebellare granulet neuroner (CGNs) er et almindeligt anvendte neuronal model, danner en rigelige homogen befolkning i lillehjernen. I lyset af deres postnatal udvikling, overflod, og adgangen er CGNs en ideel model til at studere neuronal processer, herunder neuronal udvikling, neuronal migration og fysiologiske neuronal aktivitet stimulation. Derudover giver CGN kulturer en fremragende model for at studere forskellige former for celledød, herunder excitotoxicity og apoptose. Inden for en uge i kultur express CGNs N-methyl-D-aspartat (NMDA) receptorer, en bestemt ionotropic glutamat receptor med mange kritiske funktioner i neuronal sundhed og sygdom. Tilsætning af lave koncentrationer af NMDA sammenholdt med membran depolarisering til gnaver primære CGN kulturer har været brugt til at modellere fysiologiske neuronal aktivitet stimulation, mens tilsætning af høje koncentrationer af NMDA kan være ansat til at modellere excitotoxic neuronal skade. Her beskrives en metode til isolering og dyrkning af CGNs fra 6 dage gamle hvalpe samt genetisk manipulation af CGNs af adenovirus og lentiviruses. Vi også nuværende optimerede protokoller om, hvordan man stimulerer NMDA-induceret excitotoxicity, lav-kalium-induceret apoptose, oxidativ stress og DNA-skader efter transduktion af disse neuroner.

Introduction

Cerebellare granulet neuroner (CGNs) er godt præget i kultur og har tjent som en effektiv model til at studere neuronal død og udvikling 1,2,3,4,5, 6. den tidlige udtryk for N-methyl-D-aspartat (NMDA) receptorer i CGN kulturer i vitro gør dem en attraktiv model til at studere NMDA-induceret signalering. Aktivering af disse receptorer med NMDA sammenholdt med membran depolarisering bruges til at modellere fysiologiske neuronal aktivitet stimulation, og har gjort det muligt for forskning i mekanismer af synaptisk plasticitet 7,8. Tværtimod kan over-stimulation af disse receptorer af NMDA ligand bruges til at modellere excitotoxicity, en vigtig mekanisme af neuronal tabet i akutte skader på hjernen og neurodegenerative sygdomme 9. En mekanisme til induktion af excitotoxicity er gennem ATP sult med reduceret ilt, som ses med akut neuronal skade. Dette fører til membran depolarisering og forhøjede niveauer af glutamat frigive på synapser. Den efterfølgende overstimulering af NMDA-receptor af forhøjede glutamat resulterer i overdreven Ca2 + tilstrømning via disse receptorer, som igen aktiverer flere veje herunder Ca2 +-aktiveret proteaser, phospholipases, og endonucleases, der resulterer i ukontrolleret nedbrydningen af kritiske cellulære komponenter og celledød. Derudover, fører høje intracellulære Ca2 + til generation af ilt frie radikaler og mitokondriel skader 10,11.

Mens fleste af neuronal tab efter NMDA-induceret neuronal excitotoxicity skyldes calcium tilstrømning og er Bax/Bak uafhængige, kan andre mekanismer for celledød udelukkes fra denne model. Udseendet af begge nekrotisk og apoptotisk celledød på grund af excitotoxicity er delvist skabelsen af reaktive ilt arter (ROS) og DNA-skader forårsaget af høje intracellulære Ca2 + niveauer 12. DNA-skader medfører neuronal død gennem apoptotiske mekanismer, at være korreleret med kendetegnene ved apoptotisk celledød, såsom fremkomsten af kromatin masserne og apoptotiske organer. Induktion af apoptose er medieret gennem frigivelse af cytokrom c fra mitokondrier, og har vist sig at være afhængig af Bax/Bak oligomerisering 13. Bax/Bak oligomerisering fremmer pore dannelse i den ydre membran, som resulterer i cytokrom c frigivelse og aktivering af pro-apoptotiske lovgivere som set med mild iskæmisk skade 14.

Generation af ROS er et vigtigt spørgsmål i hjernen på grund af de lave endogene niveauer af antioxidanter, kombineret med store ilt kravet om neuronal fungerende 15. Når de udsættes for en iskæmisk begivenhed, er nitrogenoxid syntase upregulated, producerer nitrogenoxid og øge reaktive ilt arter 14. Den øgede koncentration af ilt radikaler kan forårsage DNA-skader og indirekte forårsage energi sult. Høje niveauer af DNA dobbelt-strenget pauser er afhjulpet ved aktivering af poly ADP-ribose polymerase-1 (PARP-1), en eukaryot kromatin-bundet protein ansvarlig for katalysere overførsel af ADP-ribose enheder fra NAD+, en integreret del af processen DNA reparation 16. Men med alt for store skader på grund af oxidativt stress, PARP-1 aktivering kan forårsage energi sult på grund af den øgede afløb på NAD+, et nødvendigt substrat til produktion af ATP ved oxidativ fosforylering. I sidste ende, oxidativ stress vil udløse apoptose i Bax/Bak afhængig måde fører til mitokondrie cytokrom c release, og har vist sig at fremkalde mitokondrie ombygning i CGNs 17.

Endelig, ændringer i koncentrationen af kaliumchlorid (KCl) i CGN kulturer kan bruges til at modellere lavt kalium/depolarisering medieret apoptose 18,19,20. Når udsat for lave niveauer af K+, gennemgå CGNs forskellige fysiologiske ændringer, hvilket resulterer i reduktion af både mitokondrie respiration og glykolyse, tilskrives nedsat cellulær efterspørgsel 21, samt reduktion i niveauet af nuklear factor-κB (NFκB) som regulerer aktiviteter herunder betændelse og synaptisk transmission 22. Denne model er af særlig interesse for studiet af celledød under neuronal udvikling. Lav K+ miljøet mere nøje ligner fysiologiske tilstande, og forårsager kendetegnende for celledød ses under neuronal udvikling 23.

I Resumé giver CGNs en mangeårige model til at undersøge de underliggende molekylære mekanismer af neuronal død og degeneration. Følgende protokol giver mulighed for isolering og dyrkning af CGNs, udtryk eller undertrykkelse af en bestemt genetisk pathway ved hjælp af vira og induktion af neuronal død via forskellige mekanismer der repræsenterer neuronal skade og degeneration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

denne protokol er baseret på ændringer af procedurer, der er blevet beskrevet tidligere 18 , 24 , 25 , 26 , 27. denne protokol godkendes af Animal Care Udvalget på McGill University.

1. eksperimentel forberedelse

Bemærk: de følgende stamopløsninger kan forberedes og opretholdt indtil brug.

  1. Dissektion løsning
    1. opløse 3.62 g natriumchlorid (NaCl), 0,2 g kaliumchlorid (KCl), 0.069 g natrium fosfat (NaH 2 PO 4 ∙ H 2 O), og 1.306 g af D-(+)-Glucose i 500 mL destilleret H 2 O. Derefter tilsættes 12,5 mL HEPES Buffer, 450 µL phenolrødtopløsning og 20 mL af BSA brøkdel V til løsningen. Justeres til pH 7,4 bruger 1 N natriumhydroxid (NaOH).
    2. Sterilize med en 0,22 µm filter og opbevares ved 4 ° C. Denne løsning vil forblive stabil i op til en uge til 10 dage.
  2. Trypsin
    1. forberede en stamopløsning ved en koncentration på 25 g/L af trypsin i 0,9% natriumchlorid. Gemme løsningen på -20 ° C.
  3. Trypsin hæmmer
    1. udarbejder et lager med en koncentration på 10 mg/mL ved at opløse 1 g kylling æggehvide trypsin inhibitor i 100 mL af 1 mM HCl. Store denne løsning på -20 ° C.
  4. DNase
    1. 100 mg DNase 1 i 10 mL sterilt vand til at generere en 10 mg/mL bestand opløses. Gemme løsningen på -20 ° C.
  5. MgSO 4
    1. tilføje 6.02 g magnesium-sulfat (MgSO 4) til 50 mL destilleret vand (H 2 O) til at generere en 1 M bestand. Gemme løsningen på 4 ° C.
  6. CaCl 2
    1. 0.735 g af calcium chlorid opløses (CaCl 2 ∙ 2 H 2 O) i 50 mL destilleret H 2 O til en bestand koncentration på 100 mM. Opbevar løsning ved 4 ° C.
  7. KCl
    1. opløses 3.7275 g af KCl i 50 mL destilleret H 2 O til en bestand koncentration af 1 M. butik løsning ved 4 ° C.
  8. D-(+)-Glucose
    1. opløse 1.802 g af D-(+)-glucose i 50 mL destilleret H 2 O til en bestand koncentration på 100 mM. Opbevar løsning ved 4 ° C.
  9. Celle Kulturmedier
    1. forberede celle Kulturmedier som følger: 5 mL af varme inaktiveret dialysebehandling føtal bovint Serum, 500 µL af 200 mM L-glutamin, 100 µL af 50 mg/mL phosphatbufferet og 1 mL af 1.0 M KCL bør føjes til 45 mL af filter steriliseret Eagle ' s minimal essential medier (E-MEM) der er suppleret med 1,125 g/L D-Glucose til at generere 50 mL af cerebellare granulet neuron kultur medier. Opbevar medier ved 4 ° C.
  10. Cytosin Beta-D-Arabino Furanoside
    1. opløse 48 mg af cytosin beta-D-arabino furanoside i 10 mL af vækst medier til en bestand koncentration af 20 mM. Gemme løsningen på -20 ° C.
  11. Poly-D-lysin
    1. for at generere en 2 mg/mL poly D-lysin bestand, der tilsættes 10 mL sterilt H 2 O 20 mg af poly D-lysin. Stock poly D-lysin bør opbevares ved-80 ° C i 100 µL delprøver.
  12. NOTE: følgende løsninger bør være forberedt før dissektion og opretholdt ved 4 ° C indtil brug.
  13. MgSO 4 Supplemented dissektion løsning
    1. tilføje 300 µL af stock MgSO 4 til 250 mL af dissektion løsning.
  14. Trypsin dissektion løsning
    1. tilsættes 100 µL af stock trypsin og 12 µL af stock MgSO 4 til 10 mL af dissektion løsning.
  15. Trypsin hæmmer løsning 1
    1. tilføje 164 µL af stock trypsin inhibitor, 250 µL af stock DNase 1 og 12 µL af stock MgSO 4 til 10 mL af dissektion løsning.
  16. Trypsin hæmmer løsning 2
    1. tilføje 1040 µL af stock trypsin inhibitor, 750 µL af stock DNase 1 og 12 µL af stock MgSO4 til 10 mL af dissektion løsning.
  17. CaCl 2 suppleret dissektion løsning
    1. tilføje 10 µL af stock CaCl 2 og 25 µL af stock MgSO 4 til 10 mL af dissektion løsning.
  18. Poly D-lysin belagt kultur retter
    1. til at coat kultur retter, fortyndes 100 µL af stock poly D-lysin i 40 mL sterilt H 2 O. For 35 mm Nunc kultur retter, tilsættes 2 mL fortyndet poly D-lysin løsning. For 4 plader godt, tilsæt 300 µL fortyndede poly D-lysin til hver brønd.
    2. Lad poly D-lysin sidde i 1 time før sugning og vask hver godt med 4 mL eller 600 µL (for 35 mm kultur retter eller 4 godt plader, henholdsvis) af sterile H 2 O. Derefter Aspirér H 2 O og lad retter lufttørre for 1 h.

2. Hjernen udvinding og Isolation af lillehjernen

  1. Decapitate en 6-7 dag gamle mus pup bruger halshugning saks. Udføre dissektion af hjernen i en steril vævskultur hætte.
  2. For at fjerne hjernen, forstå hovedet ved hjælp af et par pincet og skære igennem huden mod den forreste af hovedet ved hjælp af microdissection saks, som vist i figur 1. Derefter skæres igennem den kranium ben ved hjælp af et nyt par saks til at minimere risikoen for kontaminering. Fjerne kraniet dækker hjernen bruger pincet og drille ud af hjernen ved hjælp af pincet eller en spatel.
    1. Efter behov, skære gennem synsnerven at gøre det lettere at få hjernen hele.
  3. Placerer hjernen i dissektion løsning, som er suppleret med MgSO 4. Holde løsningen og hjernen på ice.
  4. Følgende hjerne fjernelse, under et mikroskop for dissektion, dissekere ud lillehjernen fra hjernen mens du stadig i MgSO 4 suppleret dissektion løsning og fjerne meninges ved hjælp af fine pincet. Drej lillehjernen til sin ventrale side og sikre fjernelse af plexus chorioideus.
  5. Pulje til cerebella i en 35-mm skål indeholdende ~ 1 mL af MgSO 4 suppleret dissektion løsning.
  6. Snittes i væv i små stykker og overfoeres til en 50 mL tube indeholder 30 mL af MgSO 4 buffered dissektion løsning.

3. Musen cerebellare granulet Neuron Isolation og Culturing

  1. centrifugeres 50 mL tube indeholdende den hakkede cerebral væv i 5 min på 644 x g og 4 ° C.
  2. Fjern supernatanten og tilsættes 10 mL trypsin dissektion. Derefter ryste røret ved høj hastighed for 15 min. ved 37 ° C.
  3. Tilføje 10 mL trypsin hæmmer løsning 1 tube og rock forsigtigt i 2 min.
  4. Centrifugeres røret i 5 min på 644 x g og 4 ° C.
  5. Fjern supernatanten og der tilsættes 2 mL Trypsin hæmmer løsning 2, og derefter overføre til en 15 mL tube.
  6. Hakkede væv i 15 mL tube, indtil løsningen bliver skumle. Lad derefter nøjes med 5 min.
  7. Fjerne klart supernatanten og overføre supernatanten til et nyt rør indeholdende 1 mL af CaCl 2 suppleret dissektion løsning.
  8. Tilføje en anden mL trypsin hæmmer løsning 2 til bunden af røret indeholder pellet fra trin 3.6. Hakkede igen og lad nøjes med 5 min. Fjern supernatanten og føje den til de rør, der indeholder supernatanten fra trin 3.7 (der er en gentagelse af trin 3.6-3.7). Gentag denne proces, indtil de fleste af væv er mekanisk dissocieres.
  9. Tilføj 0,3 mL af CaCl 2 suppleret dissektion løsning til supernatanten samling for hver mL af supernatanten.
  10. Bland indholdet af røret og derefter centrifugeres i 5 min på 644 x g.
  11. Fjern supernatanten og der tilsættes 10 mL af friske medier til pellet og bland.
  12. Celler kan derefter tælles og fortyndet til en koncentration på 1,5 x 10 6 celler/mL. Bemærk venligst, at 10 millioner celler generelt forventer fra hver dissekeret hjerne, afhængig af trypsinization tid og effektivitet af dissektion. Plade celler på tidligere foretaget poly D-lysin plader. For 4-godt plader, plade 0,5 mL, giver 7,5 x 10 5 celler pr. brønd. For 35-mm retter, plade 4 mL, at give 6 x 10 6 celler pr. plade.
  13. Efter 24 h, tilføje cytosin-β-arabino furanoside (AraC) til plader til glial kontaminationen reduceres. For hver mL af medier er 0,5 µL af 20 mM AraC påkrævet. Tilsætning af AraC kræver ikke en ændring af medier. Hvis celler skal opretholdes i 7-8 dage, gentage denne behandling på dag 3.
  14. Vedligehold kulturer i en 5% CO 2 inkubator ved 37 ° C og fodre med 100 µL af 100 mM glukose føjet til kultur for hver 2 mL af medierne hver 2 dage tidligere 5 dage. En komplet media ændring er ikke påkrævet.

4. Lentivirus emballage, rensning og titrering

Bemærk: protokol til emballager, koncentration, rensning og titrering af lentivirus er tidligere blevet beskrevet udførligt uden brug af et kit 28, herunder alternative metoder til titrering, såsom flow flowcytometri 29. Her præsenterer vi kort den protokol, der bruges i vores lab til fremstilling af lentivirus for at studere neuronal skade ved hjælp af hurtig virus rensning opklaring og en qPCR lentiviral titrering kit.

  1. Plade Hek293T celler i 10 cm kultur retter med Dulbecco ' s ændret Eagle ' s minimal afgørende medium (DMEM) suppleret med 10% FBS. For at opnå en høj viral titer, dyrke mindst 5 plader af Hek293T celler for hver Transfektion. Kontroller på dagen for Transfektion celler er 70% sammenflydende. Ændre media tre timer før Transfektion.
  2. For hver Transfektion, forberede to rør. I tube tilføje 1 1,5 mL MEM-reduceret serum medier og 41 µL Transfektion reagens, bland godt. I røret 2, tilføje 1,5 mL af MEM-reduceret serum medier og 6 µg overførsel plasmid, 6 µg på pCMV dR8.2 vektor (emballage plasmid), 3 µg pCMV-VSV-G vektor (kuvert plasmid) og 35 µL p3000 enhancer reagens (følger med lipofectamine). Bland godt, og kombinere rør 1 og 2, vortex og Inkuber i 15 min.
  3. Fjerne 50% af medierne fra Hek293T plader og tilføje DNA-lipid komplekser til celler. Inkuber i 6 timer ved 37 ° C, 5% CO 2. Fjerne medier og erstatte med 5 mL frisk DMEM, inkuberes natten.
  4. På 24 h efter Transfektion, indsamle det første parti af viral supernatanten fra hver plade. Holde den viral medier ved 4 ° C og tilsættes 5 mL frisk medier i hver plade af Hek293T celler. Der inkuberes natten.
  5. 48 timer efter Transfektion, indsamle det andet parti af viral supernatanten, kombinerer det med den første batch og centrifugeres kombineret viral supernatanten i 10 min på 600 x g.
  6. Filtreres supernatanten gennem et filter med 45 µm porestørrelse.
  7. Rense den virus benytter en hurtig virus rensning opklaring. For hver 45 mL af viral supernatanten, tilsættes 5 mL af lentiviral bindende løsning, mix og centrifugeres i 10 min. ved > 5.000 x g og 4 ° C.
  8. Fjern supernatanten forsigtigt for ikke at forstyrre pelleten.
  9. Tilsættes 20-40 µL af medium og genopslæmmes pellet. Alikvot og opbevares ved-80 ° C.
  10. At få lentiviral titer, en qPCR lentiviral titrering kit bruges. Fortyndes 2 µL af renset virus i 500 µL af PBS. Tilføje 2 µL af de fortyndede virus til 18 µL af virus lysisbuffer (medfølger i sættet).
  11. Sæt op tre forskellige RT-q-PCR reaktioner i triplicates og mærke dem som, viral lysate, positiv kontrol 1 (STD1) og positiv kontrol 2 (STD2). For hver reaktion tilføje, 12,5 µL af 2 x qPCR MasterMix, 2,5 µL af enten viral lysate eller STD1 (medfølger i sættet) eller STD2 (medfølger i sættet) og 10 µL af reagens-mix (medfølger i sættet) i 0,2 mL PCR rør.
  12. Sæt PCR program som følger: 20 min på 42 ° C til reverse transkription, 10 min. ved 95 ° C for enzymet aktivering, 40 cykler med 15 s ved 95 ° C denaturering og 1 min. ved 60 ° C for udglødning/udvidelse.
  13. Beregne viral titer ved hjælp af følgende formel:
    Titer af viral lysate = 5 x 10 7 / 2 3(Ctx-Ct1)/(Ct2-Ct1).
    Ctx = Ct gennemsnitsværdi af ukendt prøve, Ct1 = gennemsnitlig værdi af STD1, Ct2 = gennemsnitlig værdi af STD2.
    Bemærk: CGNs kan være bedst, transduced med lentiviruses eller inficeret med adenovirus afhængigt af tilstanden af skaden undersøges. Tilsætning af lentiviruses på en MOI af 2-3 til celle kultur løsning på tidspunktet for plating bruges til at studere NMDA induceret signalering på dag 7 i kulturen. Dette resulterer i mere end 80% transduktion og er egnede til at forfølge biokemiske analyser af disse neuroner ( figur 2). Tilsætning af adenovirus på dag 5 af kultur (på MOI 50) og studerer NMDA induceret signalering på dag 7-8 bruges til andre teknikker som imaging. Denne behandling resulterer i mindre end 10% infektion af neuroner, hvilket gør den ideel til billedbehandling og co lokalisering af proteiner. Adenovirus kan bruges i forbindelse med plating for at studere DNA skader induceret celledød ved tilsætning af camptothecin på dag 2-3 eller oxidativt stress ved tilsætning af hydrogenperoxid. Tilstedeværelsen af fluorescens proteiner (normal god landbrugspraksis, RFP, fælles fiskeripolitik eller YFP) markeret gen interesse kan bruges til at anslå procent transduktion og potentielle toksicitet. Med den anbefalede MOI, ser vi minimumstoksicitet og maksimale transduktion ( figur 3).

5. Modeling Neuronal skade

  1. til at fremkalde NMDA induceret neuronal excitotoxicity, efter 7 dage i vitro, behandle CGNs med 100 µM NMDA og 10 µM glycin for 1 h. erstatte alle medium med konditioneret medium fra parallel kulturer uden behandling. Denne koncentration resulterer i 50% celledød på 24 h efterbehandling ( figur 3 c). Mitokondrie fragmentering er indlysende på 6-8 h indlæg behandling (Se Jahani-Asl et al. 26 , 27).
  2. for at fremkalde ROS-induceret celledød (oxidativt stress), behandling af neuroNS med 75-100 µM hydrogenperoxid (H 2 O 2) og skifte til aircondition medier fra parallel kulturer efter 5 min eksponering for H 2 O 2. Bemærk, på grund af ustabilitet i H 2 O 2, optimere koncentration til et niveau, der inducerer 50-70% celledød i kultur efter 24 timer behandling.
  3. Til at fremkalde DNA skader induceret celledød, behandle CGNs med 10 µM camptothecin. Denne koncentration fremkalder mere end 50% celledød i 24 h. mitokondrie fragmentering og tidlige apoptotiske signalering opstår 2-3 timer efter tilsætning af camptothecin ved denne koncentration (Se Jahani-Asl et al. 18)
  4. for at fremkalde lav K + induceret neuronal apoptose i CGNs, ændre medier indeholdende 25 mM K + til lavt kalium medier med 5 mM K + efter 7 dage i vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med omhyggelig dissektion, intakt hjernen, bør fjernes med minimal skade som det ses i figur 1A-B. Indsats bør træffes for at minimere hjerneskader under fjernelse, især skader på lillehjernen. Beskadige lillehjernen gør for vanskeligere identifikation og fuldstændig fjernelse af meninges, og øger risikoen for kontaminering af neuronal kultur. Når meninges er blevet fjernet, kan lillehjernen dissekeret fra de resterende væv, som det ses i figur 1 c og forberedt til dissociation.

Før plating, kan CGNs transduced med lentivirus eller inficeret med adenovirus, som beskrevet i figur 2. Vi finde maksimal effektivitet og minimal toksicitet med MOI 50 for infektion med adenovirus og en MOI af 2-3 dag i plating for lentivirus (figur 3).

Transduced sund CGN kulturer på 7 DIV er præsenteret i figur 3A. Hvis store tal om glia forbliver i kulturen, kan koncentrationen af AraC øges for at sikre en ren neuronal befolkning. Også glial celler optager virus lettere end neuroner og der bliver kritisk, hvis transductions udføres på dag 5. Tilstedeværelsen af neuroner gennemgår celledød kan vurderes ved dannelsen af pyknotic kerner, som det ses i figur 3 c. Alle koncentrationer af NMDA, H2O2, og Camptothecin er optimeret til at fremkalde 50% celledød efter 24 timer. Dette giver mulighed for at studere andre tidlige begivenheder, der går forud for neuronal tab såsom mitokondrie fragmentering.

Figure 1
Figur 1: fjernelse af musen hjernen og dissektion af lillehjernen. (A) at udtrække hjerne af en 6-7 daggamle mus, ved hjælp af et par pincet, forstå hovedet og skære huden anteriorly langs de prikkede linjer ved hjælp af et par microdissection saks. Vær omhyggelig med at skære kun hud og bindevæv, for dybt et snit kan punktere kraniet og skade hjernen. Disse tre snit lige langs midterlinjen, og to buede sideværts, tillader huden at blive skubbet tilbage afslørende kraniet. Når udsat, kan kraniet gennemtrænges med spidsen af saksen, og skære anteriorly. Stor omhu skal tages ikke at beskadige lillehjernen for at lette identifikation og fjernelse af meninges. En gang skar, kan pincet bruges til at skrælle kraniet, udsætter hjernen som kan derefter blive drillet i cool dissektion løsning ved hjælp af et par pincet eller spatel. For at fjerne hjernen, skal synsnerven adskilles. (B) når fjernet fra kraniet, hjernehinderne bør fjernes fra lillehjernen ved hjælp af et par fine tippes pincet. (C) med et par fine tippes pincet, lillehjernen er dissekeret fra de resterende væv og inspiceres for at sikre fuldstændig fjernelse af meninges. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: modellering neuronal skade i cerebellare granulet neuroner. Isolerede cerebella fra dag 6-7 mus der dissocieres til enkelt celler efter proceduren, der præsenteres i del 3. Efter dissociation, celler tælles og genopslemmes i et volumen på kultur medier til at generere 1,5 x 106 cells/mL.For 35 mm retter, 4 mL er forgyldt, giver 6 x 106 celler pr. plade. For imaging dias, er 0,5 mL forgyldt, giver 7,5 x 105 celler/brønd. CGNs kan derefter transduced med lentivirus eller inficeret med adenovirus. Ved hjælp af adenovirus på dagen for plating (0 dage i vitro (DIV)) giver større end 90% Transfektion effektivitet og giver mulighed for undersøgelse af neuronal skade gennem oxidativ stress og DNA-skader. Tilsætning af 10 µM camptothecin (CPT) vil fremkalde DNA-skader, mens 75-100 µM hydrogenperoxid (H2O2) vil fremkalde oxidativt stress. Koncentrationen af H2O2 skal optimeres for at fremkalde 50% celledød efter 24 timer. Smitte med adenovirus på 5 DIV giver en lavere transduktion virkningsgrad på mindre end 10%. 7 DIV når NMDA-receptorer er beriget med kultur, kan neuroner behandles med 100 µM NMDA og 10 µM glycin til at fremkalde excitotoxicity. Dette er ideelt for efterfølgende imaging analyse eller spore en enkelt neuron. Endelig transducing med lentivirus på 0 DIV, efterfulgt af behandling med 100 µM NMDA og 10 µM glycin på 7 DIV, giver en tilstrækkelig høj transduktion effektivitet (> 80%) til biokemiske analyser af kultur, herunder ChIP sekventering, undersøge protein udtryk, og udfører live/døde assays. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: cerebellare granulet neuroner. (A) neuroner blev transduced med lentiviruses for RFP på en MOI 3 på tidspunktet for plating, og fast og farves på 7 dage in vitro. Colocalization af RFP signal, MAP2, og Hoechst er vist at demonstrere sund neuroner, der er fuldt ud transduced af lentiviruses. (B) billederne udgør levende døde assay analyser af neuroner inficeret med forskellige MOI, til at måle toksicitet. CGNs inficeret med adenovirus udtrykker LacZ på en MOI mellem 25 og 50 giver mulighed for maksimal effektivitet samtidig opretholde minimale toksicitet. Mindre end 1% forskel i celle overlevelse i forhold til kontrol ses når smitte på denne MOI. (C) Hoechst farvning af kontrol CGNs og CGNs behandlet med NMDA til at fremkalde celledød. Bemærk dannelsen af pyknotic kerner med NMDA behandling. Dette er vejledende for celledød, og kan ses i cirka 50% af kultur 24 timer efter behandling med 100 µM NMDA og 10 µM glycin. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her giver vi en simpel metode til dyrkning af primære mus cerebellare granulet neuroner (CGNs), tab og gevinst på funktion studier og modellering forskellige ordninger for celledød. Adskillige faktorer påvirker reproducerbarhed af resultaterne ved hjælp af denne procedure, som kræver nøje overvågning. Disse omfatter renheden af den kultur, herunder eliminering af glial celler i kulturen, sammenløbet af kultur, og opretholde sunde celler. At indføre variation i disse faktorer kan bias resultaterne og udfordre reproducerbarhed. Nedenfor beskriver vi hvordan man kan minimere de faktorer, der negativt påvirker resultaterne.

For at fjerne glial celler fra CGNs kulturen og etablere en ren neuronal befolkning, bruger vi 10 µM af cytosin-β-arabino furanoside (AraC), en pyrimidin antimetabolit, der dræber celler ved at hæmme DNA syntesen. Hvis der er stadig en bestand af gliaceller stede, kan koncentrationen af AraC øges til 15 µM. Dette er også meget afhængige. Derudover for kulturer, der føres for op til 7-8 dage, kan en anden AraC behandling udføres på dag 3. For at opnå en ren neuronal befolkning og undgå celledød, er det vigtigt at skræl alle meninges off lillehjernen før skære væv i stykker, efterfulgt af trypsinization. Dette bør gøres på en rimelig kort tid (ikke længere end 7-10 min pr. cerebellum). Tilstedeværelsen af meninges i neuronal kultur medfører usund kultur og til sidst celledød. En anden faktor, som kan resultere i død af neuroner forud for behandlingen er trypsinization tid. Det er vigtigt, at cellerne ikke over trypsinized. På den anden side kræver under trypsinization yderligere mekanisk dissociation af de celler, der kan skade dem eller resultere i et lavt udbytte. Derfor, trypsinization tid kræver optimering og det er meget afhængige af.

Den næste faktor overvejes er sammenløbet af cellerne på tidspunktet for brug. Forskellige confluency kan skabe variation i resultaterne. Dette er særlig vigtigt afhængigt af udlæsning i eksperimenter. Med en lav sammenløbet stat begynder neuroner at klumpe efter 2-3 dage. En for lav eller for høj sammenløbet tilstand af neuroner forringer signalering. Det er vigtigt at tælle antallet af levende celler for nøjagtig plating.

Andre metoder til CGN kulturer er blevet beskrevet, især ser på grundlæggende dyrkningsbaserede procedurer ved hjælp af en Papain Dissociation system kit 30 som godt som post dyrkningsbaserede procedurer og manipulation af CGN for at studere neuronal migration og morfologi 31. Protokollen præsenteret af Lee et al. beskriver brugen af Papain Dissociation System Kit. De anbefaler to metoder til at øge renhed af de isolerede CGNs: kører cellerne gennem en Percoll gradient adskillelse, samt før plettering på en poly-D-lysin plade i 20 min. Begge metoder er at hjælpe i adskillelsen af CGNs fra glial forurenende stoffer. Det anbefales i tilfælde af behandling med AraC alene ikke er tilstrækkeligt til at berige for ren neuronal kultur. Desuden bruger Lee 4-6 daggamle mus unger, mens dette tjener en effektiv model for behandlingen af neuronal differentiering; vi finde, ved hjælp af CGNs fra 6-7 daggamle mus unger er mere passende for studiet af neuronal skade. Holubowska et al. præsenterer en protokol for Transfektion af indlæg mitotiske cerebellare neuroner ved hjælp af calciumphosphat metode i vitro og elektroporation in vivo. Disse er fremragende metoder til genetisk manipulation af neuroner i som en enkelt neuron kan spores. Transfektion effektivitet ved hjælp af calciumphosphat metode kan variere fra 0,1-5%. Vi finder derfor, at biokemiske analyser herunder ChIP-Seq analyser, Co-immunoprecipitation og immunoblotting, brug af lentiviruses er mere passende, da det resulterer i mere end 80% transduktion når transduced på tidspunktet for plating.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde er støttet af naturvidenskab og Engineering Research Council of Canada og den canadiske institutter for sundhedsforskning tilskud til AJ-A.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
qPCR lentivitral titration kit  ABM #LV900
speedy virus purification solution  ABM #LV999
pCMV-dR8.2 Addgene #8455
pCMV-VS.VG Addgene #8454
Distilled water  Gibco #15230162
200 mM L-Glutamine  Gibco #25030081
35 mm Nunc culture dishes Gibco #174913
PowerUP SYBR green master mix life technologies #A25742
BSA V Solution Sigma Aldrich #A-8412
CaCl2 • 2H2O Sigma Aldrich #C-7902 
Camptothecin Sigma Aldrich #C-9911
Chicken Egg White Trypsin Inhibitor  Sigma Aldrich #10109878001
Cytosine beta-D-Arabino Furanoside Sigma Aldrich #C-1768
D-(+)-Glucose  Sigma Aldrich #G-7528
DNase1  Sigma Aldrich #11284932001
Eagle-minimal essential medium Sigma Aldrich #M-2279
Glycine Sigma Aldrich #G-5417
Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum  Sigma Aldrich #F-0392
Hepes Buffer  Sigma Aldrich #H-0887
Hydrogen peroxide Sigma Aldrich #216763
50 mg/mL Gentamycin  Sigma Aldrich #G-1397
MgSO4  Sigma Aldrich #M-2643
N-Methyl-D-aspartic acid Sigma Aldrich #M-3262
Phenol Red Solution  Sigma Aldrich #P-0290
Trypsin  Sigma Aldrich #T-4549
Lipofectamine 3000 Thermo Fisher Scientific L3000-008
p3000 enhancer reagent Thermo Fisher Scientific L3000-008
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
KCl  VWR #CABDH9258
NaCl  VWR #CABDH9286
NaH2PO4H2O  VWR #CABDH9298
Poly D-lysine  VWR #89134-858
DMEM Wisent #319-005-CL
FBS Wisent #080-450

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldowitz, D., Hamre, K. The cells and molecules that make a cerebellum. Trends in Neurosciences. 21 (9), 375-382 (1998).
  2. Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
  3. Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. , (2008).
  4. Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
  5. Burgoyne, R. D., Cambray-Deakin, M. A. The cellular neurobiology of neuronal development: the cerebellar granule cell. Brain Res. 472 (1), 77-101 (1988).
  6. Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu Rev Neurosci. 18, 385-408 (1995).
  7. Evans, G. J. Synaptic signalling in cerebellar plasticity. Biol Cell. 99 (7), 363-378 (2007).
  8. Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 496-508 (2012).
  9. Arundine, M., Tymianski, M. Molecular mechanisms of calcium-dependent neurodegeneration in excitotoxicity. Cell Calcium. 34 (4-5), 325-337 (2003).
  10. Szydlowska, K., Tymianski, M. Calcium, ischemia and excitotoxicity. Cell Calcium. 47 (2), 122-129 (2010).
  11. Jahani-Asl, A., Germain, M., Slack, R. S. Mitochondria: joining forces to thwart cell death. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 162-166 (2010).
  12. Rego, A. C., Oliveira, C. R. Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis: implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Neurochem Res. 28 (10), 1563-1574 (2003).
  13. Wei, M. C., et al. Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science. 292 (5517), 727-730 (2001).
  14. Doyle, K. P., Simon, R. P., Stenzel-Poore, M. P. Mechanisms of ischemic brain damage. Neuropharmacology. 55 (3), 310-318 (2008).
  15. Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262 (5134), 689-695 (1993).
  16. Cole, K., Perez-Polo, J. R. Neuronal trauma model: in search of Thanatos. Int J Dev Neurosci. 22 (7), 485-496 (2004).
  17. Cheung, E. C., McBride, H. M., Slack, R. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of neuronal cell death. Apoptosis. 12 (5), 979-992 (2007).
  18. Jahani-Asl, A., et al. Mitofusin 2 protects cerebellar granule neurons against injury-induced cell death. J Biol Chem. 282 (33), 23788-23798 (2007).
  19. Gallo, V., Kingsbury, A., Balazs, R., Jorgensen, O. S. The role of depolarization in the survival and differentiation of cerebellar granule cells in culture. J Neurosci. 7 (7), 2203-2213 (1987).
  20. Miller, T. M., et al. Bax deletion further orders the cell death pathway in cerebellar granule cells and suggests a caspase-independent pathway to cell death. J Cell Biol. 139 (1), 205-217 (1997).
  21. Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
  22. Piccioli, P., et al. Inhibition of nuclear factor-kappaB activation induces apoptosis in cerebellar granule cells. J Neurosci Res. 66 (6), 1064-1073 (2001).
  23. D'Mello, S. R., Galli, C., Ciotti, T., Calissano, P. Induction of apoptosis in cerebellar granule neurons by low potassium: inhibition of death by insulin-like growth factor I and cAMP. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (23), 10989-10993 (1993).
  24. Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7919-7923 (1982).
  25. Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
  26. Jahani-Asl, A., et al. CDK5 phosphorylates DRP1 and drives mitochondrial defects in NMDA-induced neuronal death. Hum Mol Genet. 24 (16), 4573-4583 (2015).
  27. Jahani-Asl, A., et al. The mitochondrial inner membrane GTPase, optic atrophy 1 (Opa1), restores mitochondrial morphology and promotes neuronal survival following excitotoxicity. J Biol Chem. 286 (6), 4772-4782 (2011).
  28. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
  29. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), (2009).
  30. Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
  31. Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).

Tags

Neurovidenskab sag 129 lillehjernen cerebellare granulet neuroner (CGN) Adenovirus Lentiviral transduktion Excitotoxicity N-methyl-D-aspartat (NMDA) apoptose kaliumchlorid (KCl) Camptothecin hydrogenperoxid (H2O2)
Modeling Neuronal død og Degeneration i musen primære cerebellare granulet neuroner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Laaper, M., Haque, T., Slack, R. S., … More

Laaper, M., Haque, T., Slack, R. S., Jahani-Asl, A. Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons. J. Vis. Exp. (129), e55871, doi:10.3791/55871 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter