Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

מידול מוות עצביים והתנוונות בנוירונים גרגר אסטרוציטומה העיקרי העכבר

Published: November 6, 2017 doi: 10.3791/55871
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,2,4
1Lady Davis Institute for Medical Research, Jewish General Hospital, 2Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 3Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa, 4Department of Oncology, Faculty of Medicine, McGill University

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה עבור בידוד ואת culturing נוירונים גרגר מוחי העכבר הראשי (CGNs) מן הגורים בת 6-7 יום, התמרה חושית יעילה של CGNs להפסד ורווח של תפקוד לימודי, דגמי NMDA-induced excitotoxicity עצביים, מוות של תאים נמוך-אשלגן-induced נזק לדנ א, לחץ חימצוני באמצעות המודל באותה תרבות.

Abstract

גרגר אסטרוציטומה נוירונים (CGNs) הם מודל עצביים נפוץ, ויוצרים אוכלוסיה הומוגנית שופע המוח הקטן. לאור שלהם אחרי לידה, שפע ופיתוח נגישות, CGNs הם מודל אידיאלי ללמוד תהליכים עצביים, כולל פיתוח עצביים, הגירה העצבית של גירוי פיזיולוגי פעילות. עצבית. בנוסף, תרבויות CGN לספק מודל מצוין ללימוד מצבים שונים של מוות של תאים כולל excitotoxicity ואפופטוזיס. בתוך שבוע בתרבות, CGNs מבטאים קולטנים N-מתיל-D-אספרטט (NMDA), קולטן ספציפי ionotropic גלוטמט עם פונקציות קריטיות רבות של מחלה ובריאות עצביים. התוספת של ריכוזים נמוכים של NMDA בשיתוף עם ממברנה דפולריזציה לתרבויות CGN ראשי מכרסם שימש לדגם גירוי פיזיולוגי פעילות. עצבית בעוד התוספת של ריכוזים גבוהים של NMDA יכול להיות מועסק לדגמן excitotoxic הפגיעה העצבית. . הנה, מתוארים שיטה של בידוד, culturing של CGNs בן יום 6 גורים, כמו גם מניפולציה גנטית של CGNs על ידי adenoviruses ו lentiviruses. אנו גם נוכח פרוטוקולים ממוטבת כיצד לעורר NMDA-induced excitotoxicity, נמוך-אשלגן-induced אפופטוזיס, סטרס חמצוני, נזק לדנ א בעקבות התמרה חושית של נוירונים אלה.

Introduction

גרגר אסטרוציטומה נוירונים (CGNs) מאופיינים היטב בתרבות, שמשו כמודל יעיל ללמוד מוות עצביים ו פיתוח 1,2,3,4,5, 6. הביטוי מוקדם של N-מתיל-D-אספרטט (NMDA) קולטנים CGN תרבויות במבחנה גורם להם מודל אטרקטיבי ללמוד NMDA-induced איתות. ההפעלה של רצפטורים אלו עם NMDA בשיתוף עם ממברנה דפולריזציה משמשת למדל גירוי פיזיולוגי פעילות. עצבית, אפשרה למחקר לתוך מנגנוני הפלסטיות הסינפטית 7,8. להפך, גירוי יתר של רצפטורים אלו על ידי ליגנד NMDA יכול לשמש לדגם excitotoxicity, מנגנון מרכזי של אובדן עצביים חריפה נזק מוחי, ניווניות מחלות 9. מנגנון אחד אינדוקציה של excitotoxicity היא דרך ATP רעב עם חמצן מופחתת, כפי ראו בפציעה חריפה עצביים. התוצאה היא ממברנה דפולריזציה, רמות גבוהות של גלוטמט לשחרר את הסינפסה. Overstimulation הבאים של קולטן NMDA על ידי תוצאות מוגברות גלוטמט מופרז Ca2 + זרם דרך רצפטורים אלו, אשר בתורו מפעיל כמה מסלולים כולל Ca2 +-להפעיל פרוטאזות, phospholipases, ו endonucleases, וכתוצאה מכך השפלה בלתי מבוקרת של רכיבים קריטיים הסלולר, מוות של תאים. בנוסף, גבוהה תאיים Ca2 + מוביל הדור של רדיקלים חופשיים של חמצן, נזק מיטוכונדריאלי 10,11.

בעוד הרוב המכריע של אובדן עצביים בעקבות NMDA-induced excitotoxicity עצביים בשל זרם סידן והוא באקס/באק עצמאית, מנגנונים אחרים של מוות של תאים לא ייכללו מודל זה. המראה של שניהם עם נמק, מוות כמו מוות של תאים עקב excitotoxicity נובע חלקית הדור של מינים חמצן תגובתי (ROS) ו- DNA נזק שנגרם על ידי גבוהה תאיים Ca2 רמות 12. נזק לדנ א תוצאות במוות עצביים באמצעות מנגנונים אפופטוטיים להיפגע, להיות בקורלציה עם ההיכר של מוות של תאים אפופטוטיים להיפגע, כגון הופעת גושים כרומטין וגופים אפופטוטיים להיפגע. אינדוקציה של אפופטוזיס מתווך דרך השחרור של ציטוכרום c של המיטוכונדריה, הוכח להיות תלויים באקס/באק oligomerization 13. Oligomerization באקס/באק מקדם נקבובית היווצרות ממברנה מיטוכונדריאלי החיצוני, וכתוצאה מכך ציטוכרום c לשחרר את ההפעלה של הרגולטורים פרו-אפופטוטיים להיפגע כפי שניתן לראות עם פציעה קלה איסכמי 14.

דור של ROS היא נושא משמעותי במוח עקב אנדוגני רמות נמוכות של נוגדי חמצון, יחד עם הדרישה חמצן גדול עצביים מתפקדים 15. כאשר נחשף אירוע איסכמי, סינתאז תחמוצת החנקן הוא upregulated, בייצור ניטריק אוקסיד והגברת מינים חמצן תגובתי 14. ריכוז מוגבר של רדיקלים של חמצן יכול לגרום נזק לדנ א ולגרום בעקיפין אנרגיה הרעבה. רמות גבוהות של מעברי כפול גדילי הדנ א הם לתקן על ידי הפעלת poly ADP-ריבוז פולימראז 1 (PARP-1), חלבון כרומטין מכורך האיקריוטים אחראי ותזרז את ההעברה של ADP-ריבוז יחידות מ- NAD+, תהליך חלק בלתי נפרד ה-DNA תיקון 16. עם זאת, עם נזק מופרז עקב סטרס חמצוני, עלולים PARP-1 הפעלת אנרגיה רעב עקב הניקוז המוגבר ב- NAD+, מצע הדרושים לייצור ATP באמצעות זרחון חמצוני. בסופו של דבר, סטרס חמצוני יפעילו אפופטוזיס באופן תלותי באקס/באק שמוביל מיטוכונדריאלי ציטוכרום c שחרור, הוכח לגרום נערכו מיטוכונדריאלי CGNs 17.

בסופו של דבר, שינויים בריכוז של אשלגן כלורי (אשלגן) בתרבויות CGN ניתן ליצור מודל דפולריזציה/אשלגן נמוכה מתווכת אפופטוזיס 18,19,20. כאשר הם נחשפים לרמות נמוכות של K+, CGNs עוברים שינויים פיזיולוגיים ברורים, וכתוצאה מכך הנחות של נשימה מיטוכונדריאלי והן גליקוליזה, לייחס הסלולר ירד הביקוש 21, וכן הפחתת רמות של גרעיני גורם-κB (NFκB) אשר מסדיר פעילויות כולל דלקת, הסינאפסית 22. המודל הזה הוא עניין מיוחד לצורך המחקר של מוות תאי במהלך ההתפתחות העצבית. הסביבה K+ נמוך באופן הדוק יותר דומה בתנאים פיזיולוגיים, וגורם ההיכר של מוות של תאים במהלך ההתפתחות העצבית 23.

לסיכום, CGNs מספקות מודל ארוכת שנים לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס של מוות עצביים והתנוונות. להלן כללי התנהגות יאפשר בידוד, culturing של CGNs, ביטוי או דיכוי של שביל גנטי מסוים באמצעות וירוסים, אינדוקציה של המוות עצביים באמצעות מנגנונים שונים המייצגים הפגיעה העצבית והתנוונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול זה מבוסס על שינויים של הליכים שהיו שתוארה לעיל 18 , 24 , 25 , 26 , 27. פרוטוקול זה אושרה על ידי הוועדה אכפת לי חיה ב אוניברסיטת מקגיל.

1. הכנה ניסיוני

הערה: הפתרונות הבאים מניות ניתן להכין, נשמר עד שימוש.

  1. פתרון דיסקציה
    1. התמוססות 3.62 g של נתרן כלורי (NaCl), 0.2 גרם אשלגן כלורי (אשלגן), g 0.069 של סודיום פוספט (NaH 2 PO 4 ∙ H 2 O), ו- g 1.306 של D-(+)-גלוקוז ב 500 מ ל מזוקקים H 2 O. לאחר מכן להוסיף מ"ל מאגר HEPES, µL 450 בפתרון פנול אדום ולאחר 20 מ של BSA שבר V הפתרון. התאם ל pH 7.4 באמצעות N 1 נתרן הידרוקסידי (NaOH).
    2. Sterilize עם מסנן מיקרומטר 0.22, חנות ב 4 º C. פתרון זה יישאר יציב למשך עד שבוע עד עשרה ימים.
  2. טריפסין
    1. להכין פתרון מניות בריכוז של 25 גרם/ליטר של טריפסין ב- 0.9% נתרן כלורי. לאחסן את הפתרון ב-20 מעלות צלזיוס
  3. מעכבי טריפסין
    1. להכין מלאי עם ריכוז של 10 מ"ג/מ"ל על ידי המסת 1 גר' עוף ביצה לבן מעכבי טריפסין ב- 100 מ של 1 מ מ HCl. חנות פתרון זה ב-20 מעלות צלזיוס
  4. DNase
    1. להמיס 100 מ ג של DNase 1 ב 10 מ"ל מים סטריליים כדי לייצר מלאי 10 מ"ג/מ"ל. לאחסן את הפתרון ב-20 מעלות צלזיוס
  5. MgSO 4
    1. להוסיף 6.02 גר' מגנזיום גופרתי (MgSO 4) 50 מ של מים מזוקקים (H 2 O) כדי ליצור מניה 1 מ'. לאחסן את הפתרון ב-4 מעלות צלזיוס
  6. CaCl 2
    1. לפזר 0.735 גר' סידן כלורי (CaCl 2 ∙ 2 H 2 O) ב- 50 מ של מזוקקים H 2 O כדי ריכוז מניות של 100 מ מ. לאחסן פתרון ב-4 מעלות צלזיוס
  7. אשלגן כלורי
    1. g 3.7275 התמוססות של אשלגן כלורי ב- 50 מ של מזוקקים H 2 O כדי ריכוז מניות של 1 מ' חנות פתרון ב-4 מעלות צלזיוס
  8. D-(+)-גלוקוז
    1. לפזר 1.802 גר' D-(+)-גלוקוז ב 50 מ של מזוקקים H 2 O כדי ריכוז מניות של 100 מ מ. לאחסן פתרון ב-4 מעלות צלזיוס
  9. תא תרבות המדיה
    1. להכין תא תרבות המדיה כדלקמן: 5 מ של חום לא פעיל דיאליזה סרום שור עוברית, µL 500 של 200 מ מגלוטמין, 100 µL של 50 מ"ג/מ"ל Gentamycin ו- 1 מ"ל של 1.0 M אשלגן כלורי צריך להתווסף 45 מ ל מסנן של עיקור הנשר ' s מינימלי הכרחי התקשורת (E-מ) כי השלים עם 1.125 g/L D-גלוקוז להפקת 50 מ של גרגר אסטרוציטומה נוירון תרבות המדיה. לאחסן מדיה ב- 4 מעלות צלזיוס
  10. ציטוזין Beta-D-Arabino Furanoside
    1. לפזר 48 מ ג של ציטוזין furanoside beta-D-arabino ב- 10 מ"ל של צמיחה מדיה ריכוז מניות של 20 מ מ. לאחסן פתרון ב-20 מעלות צלזיוס
  11. פולי-D-ליזין
    1. כדי ליצור מבחן פוליגרף 2 מ"ג/מ"ל מניות D-ליזין, להוסיף 10 מ של סטרילי H 2 O 20 מ ג של פולי D-ליזין. מניות פוליפוני D-ליזין צריך להיות מאוחסן ב- 80 ° C ב- 100 µL aliquots.
  12. הערה: הפתרונות הבאים צריך להיות מוכן לפני ניתוח, נשמר ב 4 ° C עד שימוש.
  13. MgSO-4 פתרון דיסקציה Supplemented
    1. µL להוסיף 300 של MgSO מניות 4 כדי 250 מ של פתרון לנתיחה.
  14. טריפסין לנתיחה פתרון
    1. µL להוסיף 100 מניות טריפסין, µL 12 MgSO מניות 4 עד 10 מ"ל של פתרון לנתיחה.
  15. 1 פתרון מעכבי טריפסין
    1. 164 להוסיף µL של מעכבי טריפסין מניות, µL 250 של מניות DNase 1 12 µL של MgSO מניות 4 עד 10 מ"ל של פתרון לנתיחה.
  16. 2 פתרון מעכבי טריפסין
    1. 1040 להוסיף µL של מעכבי טריפסין מניות, µL 750 מניות DNase 1 µL 12 מניות MgSO4 עד 10 מ"ל של פתרון לנתיחה.
  17. CaCl 2 בתוספת לנתיחה פתרון
    1. להוסיף 10 µL של CaCl מניות 2 ו 25 µL של MgSO מניות 4 עד 10 מ"ל של פתרון לנתיחה.
  18. מנות תרבות מצופה D-ליזין פוליפוני
    1. כדי מעיל תרבות מנות לדלל µL 100 מניות צביעה D-ליזין ב 40 מיליליטר סטרילי H 2 O. 35 מ מ כעת תרבות מנות, להוסיף 2 מיליליטר מדולל פוליפוני פתרון D-ליזין. עבור 4 צלחות. ובכן, להוסיף µL 300 של פולי מדולל D-ליזין מכל קידוח.
    2. תן המצב D-ליזין פוליפוני לשעה לפני כ רפה בעברית ושטיפת אחד טוב עם 4 מ"ל או 600 µL (עבור 35 מ מ תרבות מנות או 4 טוב צלחות, בהתאמה) של סטרילי H 2 O. אז תשאף את H 2 O. ותני את האוויר מנות בעבור ה' 1

2. המוח החילוץ, בידוד של המח

  1. Decapitate 6-7 ביום pup העכבר הישן באמצעות מספריים עריפת ראש. לבצע ניתוח המוח בשכונה תרביות רקמה סטרילי.
  2. כדי להסיר את המוח, תופסים את הראש באמצעות זוג מלקחיים, לחתוך העור כלפי החלק הפנימי. של הראש באמצעות מספריים microdissection כפי שמתואר באיור 1. ואז לחתוך עצם הגולגולת בעזרת זוג מספריים חדשים כדי למזער את הסיכון של זיהום. הסר את הגולגולת המכסים את המוח באמצעות מלקחיים, להקניט המוח באמצעות מלקחיים או מרית.
    1. לפי הצורך, לחתוך דרך עצב הראייה כדי להקל על הסרת המוח כולו.
  3. למקם את המוח הפתרון לנתיחה אשר השלים עם MgSO 4. לשמור את הפתרון ואת המוח על קרח
  4. הבאות המוח להסרת, תחת מיקרוסקופ לנתיחה, לנתח את המוח הקטן מהמוח תוך עדיין בפתרון דיסקציה של MgSO 4 בתוספת, להסיר את קרומי המוח באמצעות מלקחיים משובחים. המוח הקטן על הצד הגחון שלו ולפנות להבטיח הסרה של מקלעת דמית העין.
  5. מאגר של cerebella לתוך תבשיל 35 מ מ המכיל ~ 1 מ"ל של MgSO 4 בתוספת לנתיחה פתרון.
  6. קוצצים את הרקמה לחתיכות קטנות ולהעביר לתוך צינור 50 מ ל המכיל 30 מ של MgSO 4 buffered לנתיחה פתרון.

3. העכבר אסטרוציטומה גרגר נוירון בידוד, Culturing

  1. Centrifuge הצינור 50 מ ל המכיל הרקמה המוחית קצוצים עבור 5 דקות-644 x g ו- 4 מעלות צלזיוס
  2. להסיר את תגובת שיקוע והוסף 10 מ"ל של טריפסין לנתיחה פתרון. . אז תלחצו את הצינור במהירות גבוהה למשך 15 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
  3. להוסיף 10 מ"ל של פתרון מעכבי טריפסין 1 שפופרת, רוק בעדינות על 2 דק.
  4. Centrifuge הצינור עבור 5 דקות-644 x g ו- 4 מעלות צלזיוס
  5. להסיר את תגובת שיקוע והוסף 2 מיליליטר פתרון מעכבי טריפסין 2 ולאחר מכן העברת צינור 15 מ"ל.
  6. Triturate הרקמה בצינור 15 מ"ל עד הפתרון נעשית עכורה. אז תן להסתפק 5 דק
  7. להסיר את תגובת שיקוע ברור ולהעביר את תגובת שיקוע צינור חדש המכיל 1 מ"ל של CaCl 2 בתוספת לנתיחה פתרון.
  8. להוסיף עוד מ של פתרון מעכבי טריפסין 2 לתחתית הצינור המכיל בגדר מהשלב 3.6. Triturate שוב ולתת מסתפק 5 דק. להסיר את תגובת שיקוע והוסף אותו אל הצינור המכיל את תגובת שיקוע מהשלב 3.7 (זה שידור חוזר של צעדים 3.6-3.7). חזור על תהליך זה עד רוב הרקמה מכנית חלופה מועדפת-
  9. הוסף mL 0.3 CaCl 2 בתוספת לנתיחה פתרון לאוסף supernatant עבור כל גרם של תגובת שיקוע.
  10. לערבב את תכולת השפופרת, צנטריפוגה ואז במשך 5 דקות ב- g x 644...
  11. להסיר את תגובת שיקוע, להוסיף 10 מ של מדיה טריים בגדר ומערבבים.
  12. התאים עשויים להיות ואז נספרים, מדולל על ריכוז של 1.5 x 10 6 תאים למ"ל. אנא שימו לב כי באופן כללי 10 מיליון תאים צפויים מהמוח כל גזור, תלויים trypsinization את היעילות של ניתוח. צלחת תאים על צלחות שבוצעה בעבר פוליפוני D-ליזין. עבור לוחות 4-ובכן, צלחת 0.5 mL, נותן 7.5 x 10 5 תאים לכל טוב. עבור מנות 35 מ מ, צלחת 4 מ"ל, נותן 6 x 10 6 תאים לכל צלחת-
  13. לאחר 24 h, להוסיף ציטוזין-β-arabino furanoside (AraC) הלוחות כדי לצמצם זיהום גליה. µL 0.5 מ מ 20 AraC נדרש עבור כל גרם של מדיה. תוספת של AraC אינו דורש שינוי מדיה. אם תאים תישמר במשך 7-8 ימים, לחזור על טיפול זה ביום 3-
  14. לשמור על תרבויות חממה 2 CO 5% ב 37 מעלות צלזיוס, להאכיל עם 100 µL של גלוקוז 100 מ מ נוספו התרבות עבור כל 2 מ"ל של מדיה כל יומיים חמישה ימים. שינוי בתקשורת מלאה אינה נדרשת.

4. אריזה lentivirus, טיהור, טיטור

הערה: הפרוטוקול עבור אריזה, ריכוז, טיהור טיטור של lentivirus בעבר תיאר בפירוט ללא השימוש של ערכת 28, כולל שיטות אלטרנטיביות עבור טיטור, כגון cytometry זרימה 29. כאן אנו מציגים בקצרה את פרוטוקול המשמש במעבדה שלנו לייצור lentivirus ללמוד הפגיעה העצבית באמצעות פתרון טיהור וירוס מהירה וערכת טיטור lentiviral qPCR.

  1. Hek293T צלחת תאים במנות תרבות 10 ס מ עם Dulbecco ' s ששינה הנשר ' s מינימלי הכרחי בינוני (DMEM) בתוספת 10% FBS. להשגת כייל נוגדנים גבוה ויראלי, לגדול לפחות 5 צלחות Hek293T תאים עבור כל תרביות תאים. ודא כי ביום של תרביות תאים תאים הם 70% confluent. לשנות מדיה שלוש שעות לפני תרביות תאים.
  2. עבור כל תרביות תאים, להכין שני צינורות. צינור 1 להוסיף 1.5 mL MEM מופחת סרום ומדיה µL 41 של ריאגנט תרביות תאים, מערבבים היטב. צינור 2, הוסף 1.5 מ של סרום MEM-מופחתת מדיה ו 6 µg של העברת פלסמיד, µg 6 של וקטור pCMV-dR8.2 (אריזה פלסמיד), µg 3 pCMV-VSV-G וקטור (מעטפה פלסמיד) 35 µL של ריאגנט enhancer p3000 (מסופק עם lipofectamine). לערבב היטב, וצינורות לשלב 1 ו- 2, מערבולת, תקופת דגירה של 15 דקות
  3. להסיר 50% של המדיה Hek293T צלחות ולהוסיף מתחמי DNA-השומנים לתאים. תקופת דגירה של 6-אייץ ' ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. להסיר את המדיה, להחליף 5 מ של DMEM טריים, דגירה בין לילה.
  4. פוסט-תקנים h-24, לאסוף מנה ראשונה של תגובת שיקוע ויראלי כל צלחת. למנוע מהתקשורת ויראלי ב 4 ° C, הוסף 5 מ של מדיה חדשה לתוך כל צלחת של תאים Hek293T. דגירה בין לילה.
  5. 48 שעות לאחר תרביות תאים, לאסוף את הקבוצה השנייה של תגובת שיקוע ויראלי, ולשלב אותו עם הקבוצה הראשונה, צנטריפוגה תגובת שיקוע נגיפי המשולב 10 דקות ב 600 x g...
  6. לסנן את תגובת שיקוע דרך מסנן עם גודל הנקבוביות מיקרומטר 45.
  7. לטהר את הנגיף באמצעות פתרון טיהור וירוס מהירה. עבור כל 45 מ של תגובת שיקוע ויראלי, הוסף 5 מ של איגוד lentiviral פתרון, מיקס צנטריפוגה 10 דקות ב > 5,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס
  8. להסיר את תגובת שיקוע בזהירות כדי לא להפריע בגדר.
  9. להוסיף 20-40 µL בינוני, מחדש להשעות את גלולה. Aliquot וחנות ב-80 מעלות צלזיוס
  10. כדי להשיג את כייל נוגדנים lentiviral, ערכת טיטור lentiviral qPCR משמש. למהול 2 µL של וירוס מטוהרים ב µL 500 ל- PBS. להוסיף 2 µL של הנגיף מדולל 18 µL וירוס פירוק מאגר (המסופק בערכה).
  11. סט 3 שונים התגובות q-RT-PCR ב triplicates, לתייג אותם כמו שליטה lysate, חיובי ויראלי 1 (STD1), בקרה חיובית 2 (STD2). עבור כל תגובה להוסיף, µL 12.5 של x 2 qPCR MasterMix, µL 2.5 מהם נגיפי lysate או STD1 (המסופק בערכה) או STD2 (המסופק בערכה), µL 10 של ריאגנט-mix (המסופק בערכה) ב- 0.2 מ"ל המבחנות.
  12. להגדיר את תוכנית ה-PCR כדלקמן: 20 דקות ב 42 ° C עבור שעתוק במהופך, 10 דקות ב 95 ° C להפעלת האנזים, 40 מחזורי 15 s ב 95 ° C עבור דנטורציה ו- 1 דקות ב- 60 ° C עבור חישול/סיומת.
  13. לחשב את כייל ויראלי באמצעות נוסחה זו:
    כייל של נגיפי lysate = 5 x 10 7 / 2 3(Ctx-Ct1)/(Ct2-Ct1).
    אקס = ערך Ct הממוצע של המדגם לא ידוע, Ct1 = ערך הממוצע של STD1, Ct2 = ערך הממוצע של STD2.
    הערה: CGNs יכול להיות הטוב ביותר transduced עם lentiviruses או נגועים adenoviruses בהתאם למצב של פגיעה נחקר. תוספת של lentiviruses ב MOI של 2-3 תא תרבות פתרון בזמנו של ציפוי משמש ללמוד NMDA המושרה איתות ביום 7 של התרבות. התוצאה היא יותר מ 80% התמרה חושית, ראוי להמשיך עם ניתוח הביוכימי של הנוירונים הללו ( איור 2). תוספת של adenoviruses ביום 5 של תרבות (בגיל MOI 50) ולימוד NMDA המושרה איתות-יום 7-8 משמש טכניקות אחרות כגון הדמיה. טיפול זה מתבטא פחות מ 10% זיהום של נוירונים, שהופך אותו אידיאלי עבור הדמיה ולוקליזציה שיתוף של חלבונים. Adenoviruses ניתן בזמנו של ציפוי ללמוד מוות תאי DNA נזק הנגרם על-ידי תוספת של camptothecin-יום 2-3 או סטרס חמצוני על ידי תוספת של חמצן. נוכחותם של חלבונים קרינה פלואורסצנטית (GFP, RFP, CFP או YFP) מתויג אל הגן עניין יכול לשמש כדי להעריך את אחוז התמרה חושית, רעילות פוטנציאלית. עם למשרד הפנים מומלץ, אנו רואים רעילות מינימלית המרבי התמרה חושית ( איור 3).

5. מידול הפגיעה העצבית

  1. לזירוז NMDA המושרה excitotoxicity עצביים, לאחר 7 ימים במבחנה, לטפל CGNs עם 100 מיקרומטר NMDA ו- 10 מיקרומטר גליצין עבור ה 1 החלף כל המדיום בינוני ממוזגים מתרבויות מקבילים ללא טיפול. זה ריכוז תוצאות ב- 50% מוות תאי-24 שעות לאחר הטיפול ( איור 3C). פיצול מיטוכונדריאלי מתבטא ב- 6-8 שעות לאחר הטיפול (ראה Jahani-Asl. et al. 26 , 27).
  2. כדי לגרום מוות תאי ROS-induced (סטרס חמצוני), מתייחסים נוירוns עם 75-100 מיקרומטר מימן על-חמצני (H 2 O 2), המתג ממוזגים מדיה מתרבויות מקבילים בעקבות חשיפה 5 דקות H-2-O-2. הערה, עקב חוסר היציבות של 2 O H 2, למטב את הריכוז לרמה שגורם מוות של תאים 50-70% בתרבות לאחר 24 שעות של טיפול-
  3. לזירוז DNA נזק מוות תאי המושרה, לטפל CGNs עם 10 מיקרומטר camptothecin. ריכוז זה גורם יותר מאשר מוות של תאים 50% ב- 24 ח' פיצול מיטוכונדריאלי ומתרחשת איתות מוות מוקדם 2-3 h לאחר תוספת של camptothecin בריכוז זה (ראה Jahani-Asl. et al. 18)
  4. לזירוז נמוך + K המושרה עצביים אפופטוזיס CGNs, לשנות את המדיה המכילה 25 מ מ K + למדיה אשלגן נמוכה עם 5 מ מ K + לאחר 7 ימים במבחנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עם ניתוח זהיר, המוח ללא פגע להסירה עם נזק מינימלי כפי שניתן לראות באיור 1 א'-ב'. מאמץ יש לנקוט כדי למזער את הנזק במוח במהלך ההסרה, במיוחד נזק במוח הקטן. פגיעה המוח הקטן הופך קשה יותר וזיהוי הסרה מלאה של קרומי המוח, מגבירה את הסבירות של זיהום של התרבות עצביים. ברגע הוסרו קרומי המוח, המוח הקטן יכול להיות גזור מן הרקמה הנותרת כפי שניתן לראות באיור 1C ו מוכן דיסוציאציה.

לפני ציפוי, יכול להיות transduced עם lentivirus CGNs או לטפל בו שלא נגוע אדנו כמתואר באיור2. אנו מוצאים יעילות מקסימלית רעילות מינימלית עם MOI 50 זיהום עם אדנו, ואת של MOI של 2-3 ביום של ציפוי עבור lentivirus (איור 3).

Transduced תרבויות CGN בריא-7 DIV מוצגים באיור 3 א. אם מספר גדול של עכשיו, דונלד להיות נוכח בתרבות, ניתן להגדיל את ריכוז AraC כדי להבטיח אוכלוסיית עצביים. גם גלייה תופסים את הנגיף בקלות רבה יותר מאשר נוירונים, זה הופך להיות קריטי אם transductions מבוצעות ביום 5. הנוכחות של נוירונים שעברו מוות תאי יכול להיות מוערך על ידי היווצרות של הגרעינים pyknotic, כפי שניתן לראות באיור 3C. כל ריכוזי של NMDA, H2O2ו- Camptothecin אופטימיזציה כדי לגרום מוות של תאים 50% לאחר 24 שעות. דבר זה מאפשר ללמוד אירועים אחרים מוקדם שקודמים אובדן עצביים כגון פיצול מיטוכונדריאלי.

Figure 1
איור 1: הסרת מוח העכבר דיסקציה של המוח הקטן. (א) כדי לחלץ המוח של עכבר בת 6-7 יום, באמצעות זוג מלקחיים, תופסים הראש, לחתוך את העור anteriorly לאורך הקווים המנוקדים בעזרת זוג מספריים microdissection. יש להקפיד לחתוך רק את העור ואת רקמת חיבור, חתך עמוק מדי עלולה לנקב את הגולגולת, נזק למוח. החתכים האלו שלוש, ישר לאורך הקו האמצעי, ושניים מתעקל רוחבית, לאפשר לעור להיות דחף לאחור חושף את הגולגולת. ברגע נחשף, הגולגולת יכול להיות חדרו עם קצה המספריים, לחתוך anteriorly. יש לנקוט זהירות רבה שלא יגרמו נזק הקטן כדי להקל על זיהוי והסרה של קרומי המוח. לאחר הגזירה, מלקחיים עשוי לשמש כדי לקלף את הגולגולת, חשיפת המוח ואז ייתכן שיציקו לתוך לנתיחה מגניב הפתרון באמצעות זוג מלקחיים או מרית. כדי להסיר את המוח, ייתכן שיהיה עליך עצב הראייה ינותקו. (B) לאחר שהוסר הגולגולת, קרומי המוח יש להסיר מן המוח הקטן באמצעות זוג מלקחיים משופעת משובחים. (ג) באמצעות זוג מלקחיים משופעת בסדר, המוח הקטן הוא גזור מן הרקמה הנותרת ולא בדק כדי להבטיח הסרה מלאה של קרומי המוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: מידול הפגיעה העצבית בנוירונים גרגר אסטרוציטומה. Cerebella מבודד מיום ש-6-7 עכברים הם חלופה מועדפת לתוך תאים בודדים בעקבות ההליך הציג חלק 3. בעקבות דיסוציאציה, תאים נספרות resuspended באמצעי אחסון של תרבות התקשורת כדי להפיק 1.5 x 106 cells/mL.For מנות 35 מ מ, 4 מ"ל הם מצופים, נותן 6 x 106 תאים לכל צלחת. הדמיה שקופיות, 0.5 mL היא מצופה, נותן 7.5 x 105 תאים/טוב. CGNs אז ניתן transduced עם lentivirus או נגוע אדנו. באמצעות אדנו ביום של ציפוי (0 ימים במבחנה (DIV)) נותן גדול מ- 90% יעילות תרביות תאים ומאפשר לצורך המחקר הפגיעה העצבית דרך סטרס חמצוני, נזק לדנ א. התוספת של 10 מיקרומטר camptothecin (CPT) יגרום נזק לדנ א, בעוד 75-100 מיקרומטר חמצן (H2O2) יניעו סטרס חמצוני. הריכוז של2O H2 חייב להיות מוטבת כדי לגרום מוות של תאים 50% לאחר 24 שעות. מדביק עם adenoviruses-5 DIV נותן ליעילות נמוכה של התמרה חושית של פחות מ-10%. ב- 7 DIV כאשר קולטני NMDA מועשרים בתרבות, נוירונים יכולים להיות מטופלים עם 100 מיקרומטר NMDA ו- 10 מיקרומטר גליצין כדי לגרום excitotoxicity. זה אידיאלי עבור הדמיה ניתוח או מעקב נוירון בודד. לבסוף, transducing עם lentivirus-DIV 0, ואחריו בטיפול עם 100 מיקרומטר NMDA ו- 10 מיקרומטר גליצין-7 DIV, נותן יעילות גבוהה מספיק התמרה חושית (> 80%) כדי לאפשר ניתוח הביוכימי של התרבות, כולל צ'יפ רצף, בחינת ביטוי חלבון, ולאחר ביצוע מבחני חי/מת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: אסטרוציטומה גרגר נוירונים. נוירונים (א) היו transduced עם lentiviruses עבור RFP-MOI 3 בזמנו של ציפוי, קבוע, צבעונית ב 7 ימים במבחנה. Colocalization סימן RFP, MAP2, ואת Hoechst מוצג להפגין נוירונים בריא זה הם transduced באופן מלא על-ידי lentiviruses. (B) התמונות מייצגות assay מת חי ניתוחים של נוירונים נגוע MOI שונים, כדי למדוד רעילות. CGNs נגוע אדנו לבטא LacZ-MOI בין 25 ל- 50 מאפשר יעילות מירבית תוך שמירה על רעילות מינימלית. פחות הבדל 1% הישרדות cell לעומת שליטה נתפסת בעת הדבקה ב MOI הזה. (ג) Hoechst מכתים של שליטה CGNs, CGNs שטופלו NMDA כדי לגרום מוות של תאים. הערה היווצרות של גרעינים pyknotic בטיפול NMDA. זה מרמז על מוות של תאים, ניתן לראות כ- 50% תרבות 24 שעות לאחר הטיפול עם 100 מיקרומטר NMDA ו- 10 מיקרומטר גליצין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן אנו מספקים שיטה פשוטה culturing של נוירונים גרגר אסטרוציטומה העכבר הראשי (CGNs), הפסד ורווח של תפקוד לימודי, מידול מנגנונים שונים של מוות של תאים. מספר גורמים משפיעים על הפארמצבטית את התוצאות באמצעות הליך זה דורש ניטור קרוב. אלה כוללים את הטוהר של תרבות כולל חיסול של תאי גליה בתרבות, המפגש של התרבות, ושמירה על תאים בריאים. היכרות עם השתנות של גורמים אלה יכולים הטיה התוצאות ואתגר את הפארמצבטית. להלן נתאר כיצד למזער את הגורמים להשפיע לרעה על התוצאות.

כדי לחסל תאי גליה מתרבות CGNs ולהקים אוכלוסיה עצביים טהור, אנו משתמשים 10 מיקרומטר של ציטוזין-β-arabino furanoside (AraC), antimetabolite פירימידין זה הורג תאים מתרבים על ידי עיכוב סינתזת ה-DNA. אם עדיין יש אוכלוסיה של תאי גליה הנוכחי, ניתן להגדיל את ריכוז AraC 15 מיקרומטר. זה גם מאוד תלוי. בנוסף, על תרבויות המתוחזקת עד 7-8 ימים, ניתן לבצע טיפול AraC השני ביום 3. כדי להשיג את אוכלוסיית עצביים למנוע מוות של תאים, חשוב לקלף כל קרומי המוח את המוח הקטן לפני חיתוך לרקמת לחתיכות, ואחריו trypsinization. זה צריך להיעשות תוך תקופה קצרה יחסית של זמן (לא יותר מ 7-10 דקות לכל המוח הקטן). הנוכחות של קרומי המוח בתרבות עצביים תוצאות תרבות לא בריא ובסופו של דבר מוות של תאים. גורם נוסף שיכול לגרום מוות של נוירונים לפני טיפול זה הזמן trypsinization. חשוב כי התאים אינם trypsinized יתר על המידה. מצד שני, תחת-trypsinization דורש יותר מכני דיסוציאציה של התאים להם נזק או להניב תשואה נמוכה. לכן, הפעם trypsinization דורש אופטימיזציה, זה תלוי.

הגורם הבא כדי להיחשב הוא המפגש של התאים בזמן השימוש. Confluency שונים ניתן להפיק השתנות בתוצאות. הדבר חשוב במיוחד בהתאם המדידה בניסויים. עם מצב זרימה נמוכה, נוירונים להתחיל מזיעות לאחר 2-3 ימים. מדינה נמוך מדי או גבוה מדי זרימה של הנוירונים פוגע איתות. חשוב לספור את מספר תאים חיים עבור ציפוי מדויק.

שיטות אחרות של תרבויות CGN תוארו, במיוחד מסתכלים הליכים בסיסיים culturing באמצעות מערכת פפאין דיסוציאציה קיט 30 כמו טוב כמו פוסט culturing הליכים ומניפולציה של CGN ללימוד הגירה העצבית, מורפולוגיה- 31. פרוטוקול שהוצגו על ידי Lee. et al. מתאר את השימוש ערכת מערכת פפאין דיסוציאציה. הם ממליצים על שתי שיטות כדי להגדיל את טוהר CGNs מבודדים: מריץ את התאים פרידה הדרגתי Percoll, כמו גם plating מראש על צלחת זכוכית אקרילית-D-ליזין כעשרים דקות. שתי השיטות הן לסייע ההפרדה של CGNs של גליה מזהמים. זה מומלץ למקרה טיפול עם AraC לבד אינה מספיקה כדי להעשיר לתרבות עצביים טהור. בנוסף, לי משתמש בת 4-6 יום העכבר הגורים, בזמן זה משמש מודל יעיל לבחינת בידול עצביים; אנו מוצאים שימוש CGNs מן הגורים העכבר בת 6-7 יום מתאים יותר לצורך המחקר הפגיעה העצבית. Holubowska et al. מציג עבור תקנים של נוירונים אסטרוציטומה פוסט mitotic באמצעות של סידן פוספט שיטת במבחנה , אלקטרופורציה vivo בתוךפרוטוקול. אלה הן שיטות מעולה עבור הנדסה גנטית של נוירונים שבו נוירון בודד שיכול להוביל. היעילות תרביות תאים בשיטת סידן פוספט יכול לנוע בין 0.1-5%. לכן, אנו מוצאים כי עבור ניתוחים הביוכימי כולל צ'יפ-Seq ניתוחים, Co-immunoprecipitation, immunoblotting, השימוש lentiviruses הוא מתאים יותר כאשר התוצאה היא יותר מ 80% התמרה חושית כאשר transduced בזמנו של ציפוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי מדעי הטבע, הנדסה מחקר המועצה של קנדה ומענקים המכון הקנדי של בריאות המחקר איי-איי

Materials

Name Company Catalog Number Comments
qPCR lentivitral titration kit  ABM #LV900
speedy virus purification solution  ABM #LV999
pCMV-dR8.2 Addgene #8455
pCMV-VS.VG Addgene #8454
Distilled water  Gibco #15230162
200 mM L-Glutamine  Gibco #25030081
35 mm Nunc culture dishes Gibco #174913
PowerUP SYBR green master mix life technologies #A25742
BSA V Solution Sigma Aldrich #A-8412
CaCl2 • 2H2O Sigma Aldrich #C-7902 
Camptothecin Sigma Aldrich #C-9911
Chicken Egg White Trypsin Inhibitor  Sigma Aldrich #10109878001
Cytosine beta-D-Arabino Furanoside Sigma Aldrich #C-1768
D-(+)-Glucose  Sigma Aldrich #G-7528
DNase1  Sigma Aldrich #11284932001
Eagle-minimal essential medium Sigma Aldrich #M-2279
Glycine Sigma Aldrich #G-5417
Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum  Sigma Aldrich #F-0392
Hepes Buffer  Sigma Aldrich #H-0887
Hydrogen peroxide Sigma Aldrich #216763
50 mg/mL Gentamycin  Sigma Aldrich #G-1397
MgSO4  Sigma Aldrich #M-2643
N-Methyl-D-aspartic acid Sigma Aldrich #M-3262
Phenol Red Solution  Sigma Aldrich #P-0290
Trypsin  Sigma Aldrich #T-4549
Lipofectamine 3000 Thermo Fisher Scientific L3000-008
p3000 enhancer reagent Thermo Fisher Scientific L3000-008
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
KCl  VWR #CABDH9258
NaCl  VWR #CABDH9286
NaH2PO4H2O  VWR #CABDH9298
Poly D-lysine  VWR #89134-858
DMEM Wisent #319-005-CL
FBS Wisent #080-450

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldowitz, D., Hamre, K. The cells and molecules that make a cerebellum. Trends in Neurosciences. 21 (9), 375-382 (1998).
  2. Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
  3. Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. , (2008).
  4. Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
  5. Burgoyne, R. D., Cambray-Deakin, M. A. The cellular neurobiology of neuronal development: the cerebellar granule cell. Brain Res. 472 (1), 77-101 (1988).
  6. Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu Rev Neurosci. 18, 385-408 (1995).
  7. Evans, G. J. Synaptic signalling in cerebellar plasticity. Biol Cell. 99 (7), 363-378 (2007).
  8. Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 496-508 (2012).
  9. Arundine, M., Tymianski, M. Molecular mechanisms of calcium-dependent neurodegeneration in excitotoxicity. Cell Calcium. 34 (4-5), 325-337 (2003).
  10. Szydlowska, K., Tymianski, M. Calcium, ischemia and excitotoxicity. Cell Calcium. 47 (2), 122-129 (2010).
  11. Jahani-Asl, A., Germain, M., Slack, R. S. Mitochondria: joining forces to thwart cell death. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 162-166 (2010).
  12. Rego, A. C., Oliveira, C. R. Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis: implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Neurochem Res. 28 (10), 1563-1574 (2003).
  13. Wei, M. C., et al. Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science. 292 (5517), 727-730 (2001).
  14. Doyle, K. P., Simon, R. P., Stenzel-Poore, M. P. Mechanisms of ischemic brain damage. Neuropharmacology. 55 (3), 310-318 (2008).
  15. Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262 (5134), 689-695 (1993).
  16. Cole, K., Perez-Polo, J. R. Neuronal trauma model: in search of Thanatos. Int J Dev Neurosci. 22 (7), 485-496 (2004).
  17. Cheung, E. C., McBride, H. M., Slack, R. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of neuronal cell death. Apoptosis. 12 (5), 979-992 (2007).
  18. Jahani-Asl, A., et al. Mitofusin 2 protects cerebellar granule neurons against injury-induced cell death. J Biol Chem. 282 (33), 23788-23798 (2007).
  19. Gallo, V., Kingsbury, A., Balazs, R., Jorgensen, O. S. The role of depolarization in the survival and differentiation of cerebellar granule cells in culture. J Neurosci. 7 (7), 2203-2213 (1987).
  20. Miller, T. M., et al. Bax deletion further orders the cell death pathway in cerebellar granule cells and suggests a caspase-independent pathway to cell death. J Cell Biol. 139 (1), 205-217 (1997).
  21. Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
  22. Piccioli, P., et al. Inhibition of nuclear factor-kappaB activation induces apoptosis in cerebellar granule cells. J Neurosci Res. 66 (6), 1064-1073 (2001).
  23. D'Mello, S. R., Galli, C., Ciotti, T., Calissano, P. Induction of apoptosis in cerebellar granule neurons by low potassium: inhibition of death by insulin-like growth factor I and cAMP. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (23), 10989-10993 (1993).
  24. Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7919-7923 (1982).
  25. Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
  26. Jahani-Asl, A., et al. CDK5 phosphorylates DRP1 and drives mitochondrial defects in NMDA-induced neuronal death. Hum Mol Genet. 24 (16), 4573-4583 (2015).
  27. Jahani-Asl, A., et al. The mitochondrial inner membrane GTPase, optic atrophy 1 (Opa1), restores mitochondrial morphology and promotes neuronal survival following excitotoxicity. J Biol Chem. 286 (6), 4772-4782 (2011).
  28. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
  29. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), (2009).
  30. Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
  31. Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).

Tags

מדעי המוח גיליון 129 המוח הקטן נוירונים גרגר אסטרוציטומה (CGN) אדנו התמרה חושית Lentiviral Excitotoxicity N-מתיל-D-אספרטט (NMDA) אפופטוזיס אשלגן כלורי (אשלגן) Camptothecin מימן על-חמצני (H2O2)
מידול מוות עצביים והתנוונות בנוירונים גרגר אסטרוציטומה העיקרי העכבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Laaper, M., Haque, T., Slack, R. S., … More

Laaper, M., Haque, T., Slack, R. S., Jahani-Asl, A. Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons. J. Vis. Exp. (129), e55871, doi:10.3791/55871 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter