Bu protokol, radyal olarak göç eden kortikal nöronların doğrudan gözlenmesi için talimatlar sağlar. N utero elektroporasyonda, organotipik dilim kültürü ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme, göç eden nöronlardaki ilgi genlerinin aşırı ekspresyonunun veya downregülasyonunun etkilerini doğrudan ve dinamik olarak incelemek ve gelişme sırasındaki farklılaşmalarını analiz etmek için birleştirilir.
Uterus elektroporasyonu, gelişmekte olan fare embriyolarının serebral korteksindeki radyal göç sürecini incelemek için hızlı ve güçlü bir yaklaşımdır. Radyal göçün farklı adımlarını tarif etmede ve bu işlemi kontrol eden moleküler mekanizmaları karakterize etmede yardımcı oldu. Göç eden nöronları doğrudan ve dinamik olarak analiz etmek için zamanla izlenmesi gerekiyor. Bu protokol , utero elektroporasyon ile organotipik dilim kültürü ve radikal göç eden kortikal nöronların doğrudan muayene ve dinamik analizine imkan veren zaman atlamalı konfokal görüntüleme yöntemlerini bir araya getiren bir iş akışı tanımlamaktadır. Ayrıca, göç hızı, hız profili ve radyal yönlendirme değişiklikleri gibi göç eden nöronların ayrıntılı karakterizasyonu da mümkündür. Bu yöntem, kurtarma deneylerinin yanı sıra fonksiyon kaybı ve kazancı ile radyal olarak göç eden kortikal nöronlarda ilgi çekici genlerin işlevsel analizlerini gerçekleştirmek için kolayca adapte edilebilir. HızlandırılmışGöç eden nöronların görüntülenmesi, ortaya çıktıktan sonra, nöronal migrasyon bozukluklarının fare modellerinde serebral korteks gelişimini incelemek için etkili bir araç olan en gelişmiş tekniktir.
Neokorteks bilişsel, duygusal ve sensorimotor işlevlerin başlıca sitesidir. Beynin yüzeyine paralel altı yatay tabakadan oluşur. Gelişme sırasında, dorsal telencefalonun yan duvarındaki progenitör hücreler, radyal olarak pial yüzeyine doğru göç eden ve katmana spesifik bir nöronal kimlik edinen projeksiyon nöronlarına neden olur. Ventriküler / subventriküler bölgelerde (VZ / SVZ) üretildikten sonra, bu nöronlar geçici olarak çok kutuplu olurlar ve göçlerini yavaşlatırlar. Orta bölgede (IZ) kısa bir süre kaldıktan sonra, iki kutuplu morfolojiye geçerler, radyal glial iskele üzerine bağlanırlar ve radyal olarak göç ederek korteks plakasına (CP) geçerler. Nihai hedef yansıtmalarına ulaştıklarında nöronlar radyal glial süreçlerden ayrılır ve katmana özgü kimlik kazanır. Nöronal migrasyonun farklı adımlarını etkileyen genlerdeki mutasyonlar, lissen gibi şiddetli kortikal malformasyona neden olabilirEfali veya beyaz cevher heterotopisi 1 , 2 .
Enerjide elektroporasyon, kemirgen embriyolarının 3 , 4 gelişmekte olan beyinde sinir öncü hücreleri transfekte etmek için hızlı ve güçlü bir tekniktir. Bu teknikle, nöronların geliştirilmesindeki işlevlerini incelemek için ilgilenilen genleri knockdown ve / veya aşırı ifade etmek mümkündür. Bu yöntem özellikle morfolojik ayrıntıların tanımlanmasına ve radyal göç sürecinin moleküler mekanizmalarının karakterize edilmesine yardımcı olmuştur ( 5 , 6 , 7 , 8 , 9) . Radyal olarak göç eden nöronlar, hücre şekli, göç hızı ve göç yönü gibi zaman içerisinde doğrudan ve sürekli gözlem gerektiren dinamik değişiklikler yaparlar. Organotipik dilim kültürüElektroporasyona uğramış beyinlerin tekrar ve zaman atlamalı konfokal görüntülemesi zaman içinde göç eden nöronları doğrudan gözlemlemesine izin verir. Bu kombine yaklaşımı kullanarak, elektroporasyona uğramış beyinlerin sabit doku kesitlerinde araştırılamayan göç eden nöronların farklı özelliklerini analiz etmek mümkündür.
Geçenlerde kortikal gelişim 10 sırasında transkripsiyon faktörü B hücreli KLL / lenfoma 11a (Bcl11a) rolünü incelemek için Electroporated beyinlerinin dilim kültürlerde nöronları göç zaman atlamalı konfokal görüntüleme uyguladı. Bcl11a, genç göç eden kortikal nöronlarda eksprese edilir ve fonksiyonlarını incelemek için bir koşullu mutant Bcl11a aleli ( Bcl11a flox ) 11 kullanılır . Bcl11a flox / flox beyinlerinin kortikal progenitörlerine Cre optik proteini (GFP) ile birlikte Cre rekombinazın elektroporasyonu, sadece birkaç hücrenin bir mutasyona uğramış olduğu bir mozaik mutant durum yaratmamızı sağladı.Aksi takdirde vahşi tipli arka plan. Bcl11a'nın hücre özerk işlevlerini tek hücre düzeyinde incelemek bu şekilde mümkündü. Bcl11a mutant nöronlarının, hız profillerinde düşük hız, kaymalar ve ayrıca göç sırasında rasgele benzeri oryantasyon değişiklikleri sergilediğini bulduk 10 . Anlatılan protokolde, fare beyinlerinin başarılı elektroporasyon ve dilim kültür hazırlığı 12 için bir iş akışı ve kortikal dilim kültürlerinin zaman kazanım konfokal görüntülemesi açıklanmaktadır.
Radyal göç, neokorteks gelişiminde önemli bir süreçtir. Bu sürecin farklı adımlarını etkileyen genlerdeki mutasyonlar, lissensefali ve beyaz cevher heterotopisi gibi ağır kortikal malformasyonlara neden olabilir 1 , 2 . Geçtiğimiz günlerde genç göç eden kortikal projeksiyon nöronlarında ifade edilen Bcl11a'nın radyal göçte rol oynadığını gösterdik. Aktif nöronlarda Bcl11a'nın genetik olarak silinmesinin ku…
The authors have nothing to disclose.
Yararlı tartışmalar için Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka ve Matthias Toberer'a mükemmel teknik yardım ve Victor Tarabykin'e teşekkür ediyoruz. Bu çalışma Deutsche Forschungsgamesinschaft'ın SB'ye (BR-2215) verilmesi ile desteklendi.
isoflurane | Abbott Laboratories | 506949 | Forene |
6-well plate | Corning | 351146 | |
12-well plate | Corning | 351143 | |
non-absorbable surgical suture | Ethicon | K890H | 3/8 circle, 13 mm, taper point |
Micro Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | serrated, length: 12 cm |
fine scissors | Fine Science Tools | 14063-09 | angled to side, length: 9 cm |
Mathieu Needle Holder | Fine Science Tools | 12510-14 | tungsten carbide, length: 14 cm |
fine tipped forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | straight, 11 cm |
Vannas Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | angled up, 9.5 cm |
ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | OD: 3mm, ID, 2.2 mm, length: 9 cm |
HBSS (10X) | Gibco | 14180046 | |
L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
horse serum | Gibco | 26050088 | |
BME | Gibco | 41010026 | |
borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0016 | 1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm |
anesthsesia system | Harvard Apparaus | 72-6471 | |
anesthetizing chamber | Harvard Apparaus | 34-0460 | |
fluosorber filter canister | Harvard Apparaus | 34-0415 | |
low melting point agarose | Invitrogen | 16520100 | |
vibrating blade microtome | Leica | VT1200 S | |
fluorescence stereo microscope | Leica | M205 FA | |
stereo microscope | Leica | M125 | |
inverted fluorescence tissue culture microscope | Leica | DM IL LED | |
confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5II | |
hybrid detector | Leica | HyD | |
objective, 40x/0.60 NA | Leica | 11506201 | |
microscope temperature control system | Life Imaging Services | Cube, Brick & Box | |
cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
microgrinder | Narishige | EG-45 | use 38° angle for beveling |
microinjector | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III |
carprofen | Pfizer Animal Health | NDC 61106-8507 | Rimadyl |
emdedding mold | Polysciences | 18986-1 | |
endotoxin-free plasmid maxi kit | Qiagen | 12362 | |
fast green | Sigma | F7252 | |
laminin | Sigma | L2020 | |
poly-L-lysine | Sigma | P5899 | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
D-glucose | Sigma | G6152 | |
calcium chloride | Sigma | C7902 | |
magensium sulfate | Sigma | M2643 | |
sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
square wave electroporator | Sonidel | CUY21EDIT | |
tweezers with 5 mm platinum disk electrodes | Sonidel | CUY650P5 | |
micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
box filament | Sutter Instrument | FB255B | 2.5 mm x 2.5 mm |
micro-spoon spatula | VWR | 231-0191 | 185 mm x 5 mm |
glass bottom dish, 50 mm | World Precision Instruments | FD5040-100 |