इंफ्लूएंजा एक वायरस (IAVs) महत्वपूर्ण मानव श्वसन रोगजनकों हैं । IAVs के pathogenicity को समझने के लिए और उपंयास वैक्सीन दृष्टिकोण के नैदानिक परीक्षण प्रदर्शन करने के लिए, मानव शरीर क्रिया विज्ञान नकल उतार पशु मॉडल की आवश्यकता है । यहां, हम तकनीकों का वर्णन करने के लिए IAV रोगजनन, विनोदी प्रतिक्रियाओं और टीके का मूल्यांकन प्रभावकारिता संक्रमण के एक माउस मॉडल का उपयोग कर ।
इंफ्लूएंजा वायरस ५००,००० से अधिक की मृत्यु के कारण दुनिया भर में1 और संयुक्त राज्य अमेरिका अकेले में 12-14 अरब अमरीकी डालर की वार्षिक लागत के साथ जुड़े प्रत्यक्ष चिकित्सा और अस्पताल में भर्ती खर्च और कामअनुपस्थिति2 पर विचार कर रहे हैं । पशु मॉडल इंफ्लूएंजा में महत्वपूर्ण है एक वायरस (IAV) के अध्ययन के लिए वायरल रोगजनन, मेजबान रोगज़नक़ बातचीत, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन, और वर्तमान और/या उपंयास टीका दृष्टिकोण के रूप में अच्छी तरह से antivirals की प्रभावकारिता । चूहों एक लाभप्रद छोटे जानवर मॉडल है क्योंकि उनकी प्रतिरक्षा प्रणाली है कि मानव में पाया के समान evolutionarily है, वे आनुवंशिक रूप से समान विषयों के रूप में वाणिज्यिक विक्रेताओं से उपलब्ध हैं, कई उपभेदों कि मूल्यांकन करने के लिए शोषण किया जा सकता है संक्रमण के आनुवंशिक आधार है, और वे अपेक्षाकृत सस्ती और हेरफेर करने के लिए आसान कर रहे हैं । वायुमार्ग के माध्यम से मनुष्यों में IAV संक्रमण को दोहराऊंगा करने के लिए, चूहों को पहले anesthetized intranasal टीका के साथ संक्रामक IAVs के तहत कर रहे हैं । संक्रमण के बाद, IAVs की रोगजनन दैनिक रुग्णता (शरीर के वजन में कमी) और मृत्यु दर (अस्तित्व) की निगरानी द्वारा निर्धारित किया जाता है । इसके अलावा, वायरल रोगजनन भी ऊपरी (नाक म्यूकोसा) या कम (फेफड़ों) संक्रमित चूहों के श्वसन तंत्र में वायरस प्रतिकृति का आकलन करके मूल्यांकन किया जा सकता है । IAV संक्रमण पर हास्य प्रतिक्रियाओं तेजी से गैर इनवेसिव रक्तस्राव और माध्यमिक एंटीबॉडी का पता लगाने परख कुल या बेअसर एंटीबॉडी की उपस्थिति का पता लगाने के उद्देश्य से मूल्यांकन किया जा सकता है । यहां, हम IAV और मूल्यांकन रोगजनन, विनोदी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और संरक्षण प्रभावकारिता के साथ चूहों intranasally (i. n) संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया आम तरीकों का वर्णन ।
IAVs Orthomyxoviridae परिवार3में वर्गीकृत वायरस को ढंक रहे हैं । वे नकारात्मक ध्रुवीकरण3के साथ आठ एकल फंसे आरएनए अणु होते हैं । मनुष्य में, IAVs मौसमी महामारी और महत्वपूर्ण परिणाम की सामयिक महामारियां जब उपंयास वायरस मानव जनसंख्या4में शुरू कर रहे है कारण । इसके अलावा, मौसमी IAVs उच्च और तेजी से एक ऊंचा आर्थिक नुकसान दुनिया भर में हर साल2,5उत्पादन मानव के बीच संचारित कर रहे हैं । IAV लक्षण खांसी, नाक की भीड़, बुखार, अस्वस्थता, सिर दर्द, आहार और मांसलता शामिल हैं, लेकिन वायरस भी प्रतिरक्षा रोगियों में एक और अधिक गंभीर बीमारी का उत्पादन कर सकते हैं6. वास्तव में, विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) की गणना करता है कि मौसमी इंफ्लूएंजा वायरस के कारण ३००,०००-५००,००० मौतों दुनिया भर में हर साल1। वहां केवल दवाओं के दो वर्गों वर्तमान में इंफ्लूएंजा प्रोफिलैक्सिस और मानव में उपचार के लिए खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं: neuraminidase (एनए) अवरोधकों (जैसे, oseltamivir) और M2 आयन चैनल के ब्लॉकर्स (जैसे, amantadine); हालांकि, दवा प्रतिरोधी वायरस वेरिएंट के उद्भव एक बढ़ती चिंता का विषय है । टीकाकरण, इसलिए, IAVs संक्रमण के खिलाफ मनुष्यों की रक्षा के लिए सबसे अच्छा चिकित्सा विकल्प रहता है । तारीख करने के लिए, इंफ्लूएंजा मानव उपयोग के लिए एफडीए द्वारा लाइसेंस टीके के तीन प्रकार उपलब्ध हैं: संयोजक वायरल hemagglutinin (हा) प्रोटीन टीके, निष्क्रिय इंफ्लूएंजा टीके (IIV), और रहते है क्षीणन इंफ्लूएंजा टीके (LAIV)5, 7. तीन टीके वायरल हा प्रोटीन, IAVs के खिलाफ एंटीबॉडी बेअसर का प्रमुख लक्ष्य के खिलाफ अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पैदा करने के लिए तैयार कर रहे हैं ।
एक मांय माउस मॉडल vivo में IAV संक्रमण का अध्ययन करने के लिए
पशु मॉडल अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, दूसरों के बीच में, IAV रोगजनन8,9,10,11, वायरल कारक है कि रोग में योगदान12 और/या वायरल संचरण13 ,14, और नए टीकों या एंटीवायरल दवाओं9,10,15की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए । चूहों (मस musculus) कई कारणों के लिए IAV अनुसंधान के लिए सबसे बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया पशु मॉडल हैं: 1) प्रतिरक्षा प्रणाली evolutionarily है कि मानव में मौजूद के समान है; 2) कम लागत, पशु खरीद, आवास और प्रजनन सहित; 3) आसानी से हेरफेर और स्टोर करने के लिए छोटे आकार; 4) सजातीय प्रतिक्रियाओं और परिणामों को प्राप्त करने के लिए ंयूनतम मेजबान परिवर्तनशीलता; 5) चूहों जीव विज्ञान का एक बड़ा ज्ञान, जीनोम अनुक्रम सहित; 6) कई उपलब्ध आणविक जीवविज्ञान और/या इम्यूनोलॉजी रिएजेंट; 7) उपलब्ध दस्तक (KO) चूहों वायरल संक्रमण पर एक दिया मेजबान प्रोटीन के योगदान का अध्ययन करने के लिए; और, 8) एकाधिक माउस उपभेदों कि संक्रमण के आनुवंशिक आधार का मूल्यांकन करने के लिए शोषण किया जा सकता है ।
वहां कई माउस उपभेदों वर्तमान में vivo मेंIAV अध्ययन करने के लिए उपलब्ध हैं । उंर, प्रतिरक्षा स्थिति, लिंग, आनुवंशिक पृष्ठभूमि और माउस तनाव के साथ ही संक्रमण, खुराक और वायरल उपभेदों के मार्गों सभी चूहों में IAV संक्रमण के परिणाम को प्रभावित करते हैं । सबसे आम माउस IAV अनुसंधान में इस्तेमाल किया उपभेदों है C57BL/6, बालब/सी और, हाल ही में, DBA .2 चूहों के बाद से वे अधिक दो पूर्व उपभेदों की तुलना में IAV रोग के लिए अतिसंवेदनशील हैं,17,18, 19 , 20. महत्वपूर्ण बात, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया भी माउस तनाव18,19,20के आधार पर अलग हो सकता है । इस प्रकार, यह प्रयोग के लिए सबसे अच्छा विकल्प का चयन करने के लिए माउस और IAV तनाव के बारे में सभी उपलब्ध जानकारी को पुनर्प्राप्त करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है आयोजित किया जाना है ।
हालांकि माउस IAV के साथ vivo अध्ययन में के लिए संक्रमण का एक अच्छा पशु मॉडल है, वे कई सीमाएं हैं, जो प्रयोगात्मक डिजाइन में विचार किया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, vivo में अध्ययन के लिए चूहों का उपयोग करने की एक प्रमुख सीमा है कि IAVs चूहों के बीच संचारित नहीं है. इस प्रकार, पारेषण अध्ययन के लिए, और अधिक स्वीकार किए जाते है पशु मॉडल (जैसे, ferrets या गिनी सूअरों)16,17,21इस्तेमाल कर रहे हैं । इसके अलावा, चूहों और मनुष्यों में IAV की अभिव्यक्तियों के बीच कई मतभेद हैं । मनुष्यों के विपरीत, चूहों IAV संक्रमण पर बुखार का विकास नहीं है; इसके विपरीत वे हाइपोथर्मिया१६,१७के साथ उपस्थितहुए. चूहों में, IAV प्रतिकृति ऊपरी वायुमार्ग के बजाय निचले श्वसन तंत्र (फेफड़ों) में केंद्रित है. इस प्रकार, चूहों में IAV के डाह हमेशा मानव में देखा है कि करने के लिए संबंधित नहीं है. कुल मिलाकर, क्योंकि लाभ सीमित नुकसान पल्ला झुकना, माउस पहले पशु को इंफ्लूएंजा वायरल रोगजनन, immunogenicity और वैक्सीन और एंटीवायरल अध्ययन में सुरक्षात्मक प्रभावकारिता का मूल्यांकन किया मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है । इसके अलावा, यह नैतिक रूप से IAV संक्रमण का एक छोटा सा जानवर मॉडल में पिछले सबूत के बिना बड़े पशु मॉडल का उपयोग IAV के साथ अध्ययन आचरण स्वीकार्य नहीं होगा । इस पांडुलिपि में, हम कैसे IAV के साथ चूहों intranasally (i.n.) संक्रमित करने के लिए का वर्णन, कैसे गंभीरता और वायरल संक्रमण की प्रगति की निगरानी करने के लिए और कैसे बाहर विनोदी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और संरक्षण प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक प्रयोगों को ले जाने के लिए.
यहां वर्णित सभी पशु प्रोटोकॉल संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) और चिकित्सा और दंत चिकित्सा के रोचेस्टर स्कूल के विश्वविद्यालय में संस्थागत सुरक्षा समिति (IBC) द्वारा अनुमोदित किया गया है, और अनु?…
IAV के माउस मॉडल व्यापक रूप से IAV रोगजनन, immunogenicity और संरक्षण प्रभावकारिता के vivo अध्ययन में के लिए प्रयोग किया जाता है । चूहों के छोटे आकार के लिए उन्हें हेरफेर करने के लिए आसान बनाता है और ferrets या गिनी सूअरों ?…
The authors have nothing to disclose.
एल एम एस प्रयोगशाला में इंफ्लूएंजा वायरस पर अनुसंधान आंशिक रूप से ंयूयॉर्क इंफ्लूएंजा उत्कृष्टता के केंद्र (NYICE), इंफ्लूएंजा अनुसंधान और निगरानी (CEIRS) के लिए उत्कृष्टता के NIAID केंद्रों के एक सदस्य द्वारा वित्त पोषित है । हम पांडुलिपि के सुधार में उसके समर्थन के लिए वेंडी Bates धंयवाद ।
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells | ATCC | CCL-34 | |
Six- to eight-week-old female C57BL/6 mice | National Cancer Institute (NCI) | 01XBE | |
Turckey red blod cells | Biolink Inc | Store at 4°C | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4°C |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Store at -20°C |
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100X | Corning | 30-009-CI | Store at -20°C |
Penicillin/Streptomycin (PS) 100X | Corning | 30-00-CI | Store at -20°C |
Bovin Albumin solution (BA) | Sigma-Aldrich | A7409 | Store at 4°C |
Bovin Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | Store at 4°C |
Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | Store at -20°C |
Neutral Buffered Formalin 10% | EMD | 65346-85 | Store at RT |
Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Store at RT |
Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 | ATTC | H16-L10-4R5 | Store at -20°C |
Polyclonal rabbit anti-mouse immunoglobulins/FITC | Dako | F0261 | Store at 4°C |
ECL Anti-mouse IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody | GE Healthcare | LNA931V/AG | Store at 4°C |
TMB substrate set | BioLegend | 421101 | Store at 4°C |
Vmax Kinetic plate reader | Molecular Devices | ||
Dounce Tissue Grinders | Thomas Scientific | 7722-7 | |
Receptor destroying enzyme, RDE (II) | Denka Seiken Co. | 370013 | Store at -20°C |
Crystal Violet | Fisher Scienctific | C581-100 | Store at RT |
96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
Cell Culture dishes 100mm | Greiner Bio-one | 664-160 | |
Nunc MicroWell 96-Well Microplates | Thermo Fisher Scienctific | 269620 | |
Nunc 96-Well Polystyrene Conical Bottom MicroWell Plates | Thermo Fisher Scienctific | 249570 | |
Puralub Vet Ointment | Dechra | 9N-76855 | |
Fluorescent microscope | Olympus | Olympus IX81 |