Influensa A virus (IAVs) er viktig human åndedretts patogener. Forstå virusets av IAVs og prekliniske teste romanen vaksine tilnærminger, kreves dyremodeller etterligne menneskelige fysiologi. Her beskriver vi teknikker for å evaluere IAV patogenesen, humoral svar og vaksinen bruker en musemodell av infeksjon.
Influensavirus føre til over 500 000 dødsfall over hele verden1 og er knyttet til en årlig kostnad på 12-14 milliarder dollar i USA alene vurderer direkte medisinsk og sykehusinnleggelse kostnader og arbeid fravær2. Dyremodeller er avgjørende for influensa A virus (IAV) studier for å vurdere viral patogenesen, vert-patogen interaksjoner, immunreaksjoner, og effekten av nåværende og/eller romanen vaksine tilnærminger og antivirale midler. Mus er en fordel små dyr modell fordi deres immunsystem ligner evolusjonært som mennesker, de er tilgjengelige fra kommersielle leverandører som genetisk identisk fag, det er flere stammer som kan utnyttes for å evaluere genetisk grunnlag av infeksjoner, og de er relativt billig og lett å manipulere. For å recapitulate IAV infeksjon hos mennesker via luftveiene, er mus først anesthetized før intranasal inoculation med smittsomme IAVs under riktig biosikkerhet forvaring. Etter infeksjon bestemmes patogenesen av IAVs ved å overvåke daglig sykelighet (kroppen vekttap) og dødelighet (overlevelse). I tillegg kan viral patogenesen også bli vurdert ved å vurdere virus replikering i øvre (nasal slimhinner) eller nedre (lungen) luftveier infiserte mus. Humoral svar på IAV infeksjon kan evalueres raskt av ikke-invasiv blødning og sekundære antistoff oppdagelsen analyser å oppdage tilstedeværelsen av totalt eller nøytralisere antistoffer. Her beskriver vi de vanlige metodene som brukes til å infisere mus gjennom (i.n) med IAV patogenesen, humoral immunreaksjoner og beskyttelse effekt.
IAVs er innhyllet virus klassifisert i Orthomyxoviridae familien3. De inneholder åtte single-strandet RNA molekyler med negativ polaritet3. Hos mennesker forårsake IAVs sesongmessige epidemier og sporadiske pandemier av viktig betydning når romanen virus er innført i befolkningen4. Videre overføres sesongmessige IAVs svært og raskt mellom mennesker produserer et forhøyet økonomiske tap over hele verden hvert år2,5. IAV symptomer inkluderer hoste, nese, feber, ubehag, hodepine, anoreksi og Myalgi, men viruset kan også gi en mer alvorlig sykdom hos immunsupprimerte pasienter6. Faktisk beregner av Verdens helseorganisasjon (WHO) at sesonginfluensa virus forårsaker 300.000-500 000 dødsfall over hele verden hvert år1. Det er to klasser av stoffer som er godkjent av Food and Drug Administration (FDA) for influensa profylakse og behandling hos mennesker: neuraminidase (NA) hemmere (f.eks, oseltamivir) og blokkering av M2 ion kanalen (f.eks, Amantadine); fremveksten av stoff-resistente virusvarianter er imidlertid en økende bekymring. Vaksinasjon, derfor forblir det beste medisinske alternativet å beskytte mennesker mot IAVs infeksjoner. Til dags dato, tre typer influensa vaksiner lisensiert av FDA for menneskelig bruk er tilgjengelige: rekombinant viral hemagglutinin (HA) protein vaksiner, inaktivert influensa vaksiner (IIV) og live-dempes influensa vaksiner (LAIV)5, 7. tre vaksiner er utviklet for å indusere adaptive immunrespons mot viral HA protein, store målet for nøytralisere antistoffer mot IAVs.
En godkjent musemodell å studere IAV infeksjon i vivo
Dyremodeller har blitt brukt til å studere, blant annet IAV patogenesen8,9,10,11, viral faktorer som bidrar til sykdom12 og/eller viral overføring13 ,14, og å teste effekten av nye vaksiner eller antivirale legemidler9,10,15. Mus (Mus musculus) er den mest utbredte brukt dyremodell for IAV forskning av flere grunner: 1) immunsystemet er evolutionarily lik som finnes i mennesker; 2) lave kostnader, inkludert dyr kjøp, bolig og reproduksjon; 3) liten størrelse lett manipulere og lagre; 4) minimal vert variasjon homogen svar og resultater; 5) en stor kunnskap om mus biologi, inkludert Genova orden; 6) mange tilgjengelige molekylærbiologi og/eller immunologi reagenser; 7) tilgjengelig slå ut (KO) mus å studere bidrag av et gitt vert protein på virusinfeksjon; og 8) flere musen stammer som kan utnyttes for å evaluere genetisk grunnlag av infeksjoner.
Det er flere musen stammer tilgjengelig å studere IAV i vivo. Alder, immun rang, kjønn, genetisk bakgrunn og mus belastning samt ruter infeksjon, dose og viral stammer alle påvirke utfallet av IAV infeksjon i mus. De vanligste musen stammene i IAV forskning er C57BL/6, BALB/C og, mer nylig, DBA.2 mus siden de er mer utsatt for IAV sykdom enn de to tidligere stammer16,17,18, 19 , 20. viktigst, immunforsvaret også kan være forskjellig avhengig av musen belastningen18,19,20. Dermed er det veldig viktig å gjenopprette all tilgjengelig informasjon om mus og IAV belastning å velge det beste alternativet for å bli gjennomført.
Selv om musen er en god dyr modell av infeksjon for i vivo studier med IAV, har de flere begrensninger, som må vurderes i eksperimentell design. For eksempel, er en stor begrensning av bruk av mus for i vivo studier at IAVs overfører blant mus. Dermed for overføring akseptert studier, mer dyremodeller (f.eksoppspore eller marsvin) er brukt16,17,21. I tillegg finnes det flere forskjeller mellom manifestasjoner av IAV i mus og mennesker. I motsetning til mennesker utvikle mus ikke feber på IAV infeksjon; omvendt presenterer de med nedkjøling16,17. I mus, er IAV replikering konsentrert i de nedre luftveier (lungen) i stedet for de øvre luftveiene. Dermed er virulens av IAV i mus ikke alltid korrelert til at sett i mennesker. Helt, fordi fordelene oppveier ulempene begrenset, musen representerer den første dyr modellen brukes til å evaluere influensa virus patogenesen, immunogenisitet og beskyttende effekt i vaksine og antivirale studier. Dessuten ville det ikke være etisk akseptabelt å gjennomføre studier med IAV med store dyr modeller uten tidligere bevis i en liten dyr modell av IAV infeksjon. I dette manuskriptet beskriver vi hvordan å infisere mus gjennom (i.n.) med IAV, hvordan å overvåke alvorlighetsgraden og fremdriften for viral infeksjon og utføre eksperimenter som er nødvendig for å evaluere humoral immunreaksjoner og beskyttelse effekt.
Musemodell av IAV er mye brukt for i vivo studier av IAV patogenesen, immunogenisitet og beskyttelse effekt. Den lille størrelsen på mus gjør dem lett å manipulere og lagre i forhold til andre dyr modeller som oppspore eller marsvin. Videre, enkelt i dyr koster, bolig og reproduksjon tillate bruken i pre-klinisk vaksinasjon tester som stort antall dyr er nødvendig. Spesielt siden mus har blitt brukt i flere forskning disipliner, flere molekylære og immunologi murine reagenser er tilgjengelig for å lette b…
The authors have nothing to disclose.
Forskning på influensavirus i LM-S laboratorium er delvis finansiert av The New York influensa Center of Excellence (NYICE), medlem av NIAID Centers of Excellence for influensa forskning og overvåking (CEIRS). Vi takker Wendy Bates for sin støtte i korreksjoner manuskriptet.
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells | ATCC | CCL-34 | |
Six- to eight-week-old female C57BL/6 mice | National Cancer Institute (NCI) | 01XBE | |
Turckey red blod cells | Biolink Inc | Store at 4°C | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4°C |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Store at -20°C |
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100X | Corning | 30-009-CI | Store at -20°C |
Penicillin/Streptomycin (PS) 100X | Corning | 30-00-CI | Store at -20°C |
Bovin Albumin solution (BA) | Sigma-Aldrich | A7409 | Store at 4°C |
Bovin Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | Store at 4°C |
Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | Store at -20°C |
Neutral Buffered Formalin 10% | EMD | 65346-85 | Store at RT |
Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Store at RT |
Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 | ATTC | H16-L10-4R5 | Store at -20°C |
Polyclonal rabbit anti-mouse immunoglobulins/FITC | Dako | F0261 | Store at 4°C |
ECL Anti-mouse IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody | GE Healthcare | LNA931V/AG | Store at 4°C |
TMB substrate set | BioLegend | 421101 | Store at 4°C |
Vmax Kinetic plate reader | Molecular Devices | ||
Dounce Tissue Grinders | Thomas Scientific | 7722-7 | |
Receptor destroying enzyme, RDE (II) | Denka Seiken Co. | 370013 | Store at -20°C |
Crystal Violet | Fisher Scienctific | C581-100 | Store at RT |
96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
Cell Culture dishes 100mm | Greiner Bio-one | 664-160 | |
Nunc MicroWell 96-Well Microplates | Thermo Fisher Scienctific | 269620 | |
Nunc 96-Well Polystyrene Conical Bottom MicroWell Plates | Thermo Fisher Scienctific | 249570 | |
Puralub Vet Ointment | Dechra | 9N-76855 | |
Fluorescent microscope | Olympus | Olympus IX81 |