Summary

Influenza-A-Virus-Studien in einem Mausmodell der Infektion

Published: September 07, 2017
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Summary

Influenza A-Viren (IAVs) sind wichtige Humanpathogene Atemwege. Die Pathogenität von IAVs verstehen und neuartigen Impfstoff präklinischen Erprobung durchführen, sind Tiermodelle imitiert menschliche Physiologie erforderlich. Hier beschreiben wir Techniken zur Bewertung IAV Pathogenese, humorale Reaktionen und Wirksamkeit des Impfstoffes mit einem Maus-Modell der Infektion.

Abstract

Influenza-Viren verursachen mehr als 500.000 Todesfälle weltweit1 und eine jährliche Gebühr von 12 Milliarden US-Dollar in den Vereinigten Staaten allein in Anbetracht direkte medizinische und Krankenhausaufenthalt Kosten und Arbeit Absentismus2zugeordnet sind. Tiermodelle sind entscheidend für Influenza A Virus (IAV) Studien zur Bewertung virale Pathogenese, Wirt-Pathogen Interaktionen, Immunreaktionen und nähert sich die Wirksamkeit der laufenden bzw. neuartige Impfstoff sowie antivirale Medikamente. Mäuse sind vorteilhaft kleine Tiermodell, weil ihr Immunsystem evolutionär ähnelt, findet man bei Menschen, es gibt Sie von kommerziellen Anbietern als genetisch identische Themen, gibt es mehrere Stämme, die ausgenutzt werden können, um zu bewerten die genetische Grundlage von Infektionen, und sie sind relativ preiswert und leicht zu manipulieren. Um die IAV-Infektion beim Menschen über die Atemwege zu rekapitulieren, werden Mäuse zuerst vor der intranasale Inokulation mit infektiösen IAVs unter richtigen Biosafety Containment betäubt. Nach Infektion wird die Pathogenese der IAVs bestimmt, indem Sie täglich die Morbidität (Körper-Gewicht-Verlust) und Sterblichkeit (überleben). Darüber hinaus kann virale Pathogenese auch ausgewertet werden, durch die Replikation des Virus in die obere (Nasenschleimhaut) oder der unteren Atemwege (Lunge), von infizierten Mäusen Bewertung. Humorale Reaktionen bei der IAV-Infektion durch nicht-invasive Blutungen und sekundäre Antikörpernachweis schnell auswertbar Assays abzielen, das Vorhandensein von insgesamt oder neutralisierenden Antikörpern. Hier beschreiben wir die gängige Methoden, Mäuse intranasal zu infizieren (i.n) mit IAV und Pathogenese, humorale Immunantwort und Schutz Wirksamkeit zu bewerten.

Introduction

IAVs sind behüllte Viren in der Orthomyxoviridae Familie3eingestuft. Sie enthalten acht einsträngige RNA-Moleküle mit negativer Polarität3. Beim Menschen verursachen IAVs saisonal Epidemien und gelegentliche Pandemien wichtige Konsequenz, wenn neuartige Viren in der menschlichen Bevölkerung4eingeführt werden. Darüber hinaus werden saisonale IAVs hoch und schnell von Mensch zu Mensch produziert eine erhöhte wirtschaftliche Verluste weltweit jedes Jahr2,5übertragen. IAV Symptome sind Husten, verstopfte Nase, Fieber, Unwohlsein, Kopfschmerzen, Magersucht und Muskelschmerzen, aber das Virus kann auch eine schwere Krankheit bei immungeschwächten Patienten6produzieren. In der Tat, rechnet die World Health Organisation (WHO) vor, dass saisonale Influenza-Viren 300.000-500.000 Todesfälle weltweit pro Jahr1 verursachen. Es gibt nur zwei Arten von Medikamenten, die derzeit von der Food and Drug Administration (FDA) für Influenza-Prophylaxe und Therapie beim Menschen zugelassen: Neuraminidasehemmer (NA) (z.B. Oseltamivir) und Blocker des Ionenkanals M2 (z.B. Amantadin); die Entstehung von resistenten Viren-Varianten ist jedoch eine zunehmende Besorgnis. Impfung, bleibt daher die beste medizinische Möglichkeit, Menschen gegen IAVs Infektionen zu schützen. Bisher wurden drei Arten von Influenza Impfstoffe zugelassen von der FDA für den menschlichen Gebrauch zur Verfügung: rekombinante virale Hämagglutinin (HA) Protein Impfstoffe, inaktivierten Influenza-Impfstoffe (IIV) und live-gedämpft Influenza-Impfstoffe (LAIV)5, 7. die drei Impfstoffe sind entworfen, um gegen das virale HA-Protein, das große Ziel von neutralisierenden Antikörpern gegen IAVs adaptive Immunantwort zu induzieren.

Eine validierte Mausmodell IAV Infektion in Vivo zu studieren

Tiermodelle wurden verwendet, um, unter anderem IAV Pathogenese8,9,10,11, virale Faktoren zu untersuchen, die zu Krankheit12 und/oder viralen Übertragung13 beitragen ,14, und testen Sie die Wirksamkeit der neuen Impfstoffe oder antivirale Medikamente9,10,15. Mäuse (Mus Musculus) sind die am häufigsten verwendeten Tiermodell für IAV Forschung aus mehreren Gründen: 1) das Immunsystem ist evolutionär ähnlich präsentieren, beim Menschen; (2) low-cost, einschließlich Tier Kauf, Gehäuse und Reproduktion; (3) kleine Größe zu bearbeiten und zu speichern; (4) minimal Host Variabilität, homogene Antworten und Ergebnisse zu erhalten; (5) eine große Kenntnis der Mäuse Biologie, einschließlich Genomsequenz; (6) viele verfügbare Molekularbiologie bzw. Immunologie Reagenzien; (7) zur Verfügung Knock-out Mäuse (KO), den Beitrag eines bestimmten Host-Proteins auf virale Infektion zu studieren; und 8) mehrere Maus-Stämmen, die ausgenutzt werden können, um die genetischen Grundlagen von Infektionen zu bewerten.

Es gibt verschiedene Mausstämme derzeit für IAV in Vivozu studieren. Alter, Immunstatus, Geschlecht, genetische Hintergrund und Maus Belastung sowie Routen der Infektion, Dosis und Virenstämme Einfluss auf den Ausgang der IAV-Infektion bei Mäusen. Die am häufigsten verwendeten Mausstämme IAV Forschung verwendeten sind C57BL/6, BALB/C und, in jüngerer DBA.2 Mäuse, da sie anfälliger für IAV Krankheit als die beiden ehemaligen Stämme16,17,18, sind 19 , 20. wichtiger ist, die Immunantwort auch können abweichen, je nach der Maus Belastung18,19,20. Daher ist es sehr wichtig, um alle verfügbaren Informationen über die Maus und die IAV Sorte wählen Sie die beste Option für das Experiment durchgeführt werden zu erholen.

Obwohl die Maus eine gute Tiermodell Infektionsrisiko für in Vivo Studien mit IAV ist, haben sie mehrere Einschränkungen, die in der experimentellen Gestaltung berücksichtigt werden müssen. Zum Beispiel ist eine große Einschränkung der Verwendung von Mäusen für in Vivo Studien, dass IAVs nicht unter Mäuse übertragen. So, für die Übertragung Studien, akzeptiert Tiermodelle (z.B.Frettchen oder Meerschweinchen) sind gebrauchte16,17,21. Darüber hinaus gibt es einige Unterschiede zwischen den Manifestationen der IAV bei Mäusen und Menschen. Im Gegensatz zum Menschen entwickeln Mäuse nicht Fieber bei IAV Infektion; im Gegensatz dazu präsentieren sie mit Hypothermie16,17. Bei Mäusen konzentriert sich IAV Replikation in den unteren Atemwegen (Lunge) anstatt der oberen Atemwege. So korreliert Virulenz der IAV in Mäusen nicht immer in Menschen gesehen. Insgesamt, weil die Vorteile der begrenzten Nachteile überwiegen, stellt Maus erste Tiermodell verwendet, um virale Pathogenese der Grippe, Immunogenität und Schutzwirkung im Impfstoff und antivirale Studien bewerten. Darüber hinaus wäre es nicht vertretbar, Studien mit IAV mit großen Tiermodellen ohne vorherigen Nachweis in einer kleinen Tiermodell der IAV-Infektion. In dieser Handschrift die, wir beschreiben, wie Mäuse intranasal infiziert (i.n.) mit IAV, wie der Schweregrad und Fortschritten der viralen Infektion und zur Durchführung der Experimente erforderlich, um die humorale Immunantwort und Schutz Wirksamkeit bewertet.

Protocol

alle tierischen Protokolle, die hier beschrieben wurden durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) und der institutionellen Biosafety Committee (IBC) an der University of Rochester School of Medicine and Dentistry zugelassen und erfüllt mit den Empfehlungen in der Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Research Council 22. Die Einrichtungen und Programme der Vivarium und Division des Tieres Labormedizin der Schule von Medizin und Zahnmedizin sind von AAALAC Intern…

Representative Results

Charakterisierung der viralen Pathogenese bei Mäusen Die Pathogenese der IAV bezieht sich auf die Morbidität und Mortalität durch die Infektion verursacht. Diese beiden Parameter können leicht bei Mäusen ausgewertet werden: IAV Morbidität Körper Gewichtsverlust bei infizierten Mäusen zugeordnet ist und der Prozentsatz des Überlebens zeigen die Sterblichkeitsrate (Abbildung 1). Das Körpergewic…

Discussion

Die Maus-Modell der IAV ist für in Vivo Studien der IAV Pathogenese, Immunogenität und Schutz Wirksamkeit verbreitet. Die geringe Größe von Mäusen macht sie leicht zu bearbeiten und speichern im Vergleich zu anderen Tiermodellen wie Frettchen oder Meerschweinchen. Darüber hinaus erlauben die Leichtigkeit in Bezug auf Tier Kosten, Gehäuse und Reproduktion ihre Verwendung in präklinischen Impfung-Tests in denen großen Anzahl von Tieren erforderlich sind. Vor allem, da Mäuse verwendet wurden mehrere Forsc…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forschung auf Influenza-Virus im LM-S Labor wird teilweise von The New York Influenza Center of Excellence (GEMON), ein Mitglied des NIAID Centers of Excellence für Influenza-Forschung und Überwachung (CEIRS) finanziert. Wir danken für ihre Unterstützung bei der Korrektur des Manuskripts Wendy Bates.

Materials

Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells ATCC CCL-34
Six- to eight-week-old female C57BL/6 mice National Cancer Institute (NCI) 01XBE
Turckey red blod cells Biolink Inc Store at 4°C
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Corning Cellgro 15-013-CV Store at 4°C
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1500-050 Store at -20°C
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100X Corning 30-009-CI Store at -20°C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100X Corning 30-00-CI Store at -20°C
Bovin Albumin solution (BA) Sigma-Aldrich A7409 Store at 4°C
Bovin Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9647 Store at 4°C
Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin Sigma-Aldrich T8802 Store at -20°C
Neutral Buffered Formalin 10% EMD 65346-85 Store at RT
Triton X-100 J.T.Baker X198-07 Store at RT
Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 ATTC H16-L10-4R5 Store at -20°C
Polyclonal rabbit anti-mouse immunoglobulins/FITC Dako F0261 Store at 4°C
ECL Anti-mouse IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody GE Healthcare LNA931V/AG Store at 4°C
TMB substrate set BioLegend 421101 Store at 4°C
Vmax Kinetic plate reader Molecular Devices
Dounce Tissue Grinders Thomas Scientific 7722-7
Receptor destroying enzyme, RDE (II) Denka Seiken Co. 370013 Store at -20°C
Crystal Violet Fisher Scienctific C581-100 Store at RT
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 655-180
Cell Culture dishes 100mm Greiner Bio-one 664-160
Nunc MicroWell 96-Well Microplates Thermo Fisher Scienctific 269620
Nunc 96-Well Polystyrene Conical Bottom MicroWell Plates Thermo Fisher Scienctific 249570
Puralub Vet Ointment Dechra 9N-76855
Fluorescent microscope Olympus Olympus IX81

References

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Rodriguez, L., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (127), e55898, doi:10.3791/55898 (2017).

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