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Immunology and Infection

Influenza-A-Virus-Studien in einem Mausmodell der Infektion

doi: 10.3791/55898 Published: September 7, 2017

Summary

Influenza A-Viren (IAVs) sind wichtige Humanpathogene Atemwege. Die Pathogenität von IAVs verstehen und neuartigen Impfstoff präklinischen Erprobung durchführen, sind Tiermodelle imitiert menschliche Physiologie erforderlich. Hier beschreiben wir Techniken zur Bewertung IAV Pathogenese, humorale Reaktionen und Wirksamkeit des Impfstoffes mit einem Maus-Modell der Infektion.

Abstract

Influenza-Viren verursachen mehr als 500.000 Todesfälle weltweit1 und eine jährliche Gebühr von 12 Milliarden US-Dollar in den Vereinigten Staaten allein in Anbetracht direkte medizinische und Krankenhausaufenthalt Kosten und Arbeit Absentismus2zugeordnet sind. Tiermodelle sind entscheidend für Influenza A Virus (IAV) Studien zur Bewertung virale Pathogenese, Wirt-Pathogen Interaktionen, Immunreaktionen und nähert sich die Wirksamkeit der laufenden bzw. neuartige Impfstoff sowie antivirale Medikamente. Mäuse sind vorteilhaft kleine Tiermodell, weil ihr Immunsystem evolutionär ähnelt, findet man bei Menschen, es gibt Sie von kommerziellen Anbietern als genetisch identische Themen, gibt es mehrere Stämme, die ausgenutzt werden können, um zu bewerten die genetische Grundlage von Infektionen, und sie sind relativ preiswert und leicht zu manipulieren. Um die IAV-Infektion beim Menschen über die Atemwege zu rekapitulieren, werden Mäuse zuerst vor der intranasale Inokulation mit infektiösen IAVs unter richtigen Biosafety Containment betäubt. Nach Infektion wird die Pathogenese der IAVs bestimmt, indem Sie täglich die Morbidität (Körper-Gewicht-Verlust) und Sterblichkeit (überleben). Darüber hinaus kann virale Pathogenese auch ausgewertet werden, durch die Replikation des Virus in die obere (Nasenschleimhaut) oder der unteren Atemwege (Lunge), von infizierten Mäusen Bewertung. Humorale Reaktionen bei der IAV-Infektion durch nicht-invasive Blutungen und sekundäre Antikörpernachweis schnell auswertbar Assays abzielen, das Vorhandensein von insgesamt oder neutralisierenden Antikörpern. Hier beschreiben wir die gängige Methoden, Mäuse intranasal zu infizieren (i.n) mit IAV und Pathogenese, humorale Immunantwort und Schutz Wirksamkeit zu bewerten.

Introduction

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IAVs sind behüllte Viren in der Orthomyxoviridae Familie3eingestuft. Sie enthalten acht einsträngige RNA-Moleküle mit negativer Polarität3. Beim Menschen verursachen IAVs saisonal Epidemien und gelegentliche Pandemien wichtige Konsequenz, wenn neuartige Viren in der menschlichen Bevölkerung4eingeführt werden. Darüber hinaus werden saisonale IAVs hoch und schnell von Mensch zu Mensch produziert eine erhöhte wirtschaftliche Verluste weltweit jedes Jahr2,5übertragen. IAV Symptome sind Husten, verstopfte Nase, Fieber, Unwohlsein, Kopfschmerzen, Magersucht und Muskelschmerzen, aber das Virus kann auch eine schwere Krankheit bei immungeschwächten Patienten6produzieren. In der Tat, rechnet die World Health Organisation (WHO) vor, dass saisonale Influenza-Viren 300.000-500.000 Todesfälle weltweit pro Jahr1 verursachen. Es gibt nur zwei Arten von Medikamenten, die derzeit von der Food and Drug Administration (FDA) für Influenza-Prophylaxe und Therapie beim Menschen zugelassen: Neuraminidasehemmer (NA) (z.B. Oseltamivir) und Blocker des Ionenkanals M2 (z.B. Amantadin); die Entstehung von resistenten Viren-Varianten ist jedoch eine zunehmende Besorgnis. Impfung, bleibt daher die beste medizinische Möglichkeit, Menschen gegen IAVs Infektionen zu schützen. Bisher wurden drei Arten von Influenza Impfstoffe zugelassen von der FDA für den menschlichen Gebrauch zur Verfügung: rekombinante virale Hämagglutinin (HA) Protein Impfstoffe, inaktivierten Influenza-Impfstoffe (IIV) und live-gedämpft Influenza-Impfstoffe (LAIV)5, 7. die drei Impfstoffe sind entworfen, um gegen das virale HA-Protein, das große Ziel von neutralisierenden Antikörpern gegen IAVs adaptive Immunantwort zu induzieren.

Eine validierte Mausmodell IAV Infektion in Vivo zu studieren

Tiermodelle wurden verwendet, um, unter anderem IAV Pathogenese8,9,10,11, virale Faktoren zu untersuchen, die zu Krankheit12 und/oder viralen Übertragung13 beitragen ,14, und testen Sie die Wirksamkeit der neuen Impfstoffe oder antivirale Medikamente9,10,15. Mäuse (Mus Musculus) sind die am häufigsten verwendeten Tiermodell für IAV Forschung aus mehreren Gründen: 1) das Immunsystem ist evolutionär ähnlich präsentieren, beim Menschen; (2) low-cost, einschließlich Tier Kauf, Gehäuse und Reproduktion; (3) kleine Größe zu bearbeiten und zu speichern; (4) minimal Host Variabilität, homogene Antworten und Ergebnisse zu erhalten; (5) eine große Kenntnis der Mäuse Biologie, einschließlich Genomsequenz; (6) viele verfügbare Molekularbiologie bzw. Immunologie Reagenzien; (7) zur Verfügung Knock-out Mäuse (KO), den Beitrag eines bestimmten Host-Proteins auf virale Infektion zu studieren; und 8) mehrere Maus-Stämmen, die ausgenutzt werden können, um die genetischen Grundlagen von Infektionen zu bewerten.

Es gibt verschiedene Mausstämme derzeit für IAV in Vivozu studieren. Alter, Immunstatus, Geschlecht, genetische Hintergrund und Maus Belastung sowie Routen der Infektion, Dosis und Virenstämme Einfluss auf den Ausgang der IAV-Infektion bei Mäusen. Die am häufigsten verwendeten Mausstämme IAV Forschung verwendeten sind C57BL/6, BALB/C und, in jüngerer DBA.2 Mäuse, da sie anfälliger für IAV Krankheit als die beiden ehemaligen Stämme16,17,18, sind 19 , 20. wichtiger ist, die Immunantwort auch können abweichen, je nach der Maus Belastung18,19,20. Daher ist es sehr wichtig, um alle verfügbaren Informationen über die Maus und die IAV Sorte wählen Sie die beste Option für das Experiment durchgeführt werden zu erholen.

Obwohl die Maus eine gute Tiermodell Infektionsrisiko für in Vivo Studien mit IAV ist, haben sie mehrere Einschränkungen, die in der experimentellen Gestaltung berücksichtigt werden müssen. Zum Beispiel ist eine große Einschränkung der Verwendung von Mäusen für in Vivo Studien, dass IAVs nicht unter Mäuse übertragen. So, für die Übertragung Studien, akzeptiert Tiermodelle (z.B.Frettchen oder Meerschweinchen) sind gebrauchte16,17,21. Darüber hinaus gibt es einige Unterschiede zwischen den Manifestationen der IAV bei Mäusen und Menschen. Im Gegensatz zum Menschen entwickeln Mäuse nicht Fieber bei IAV Infektion; im Gegensatz dazu präsentieren sie mit Hypothermie16,17. Bei Mäusen konzentriert sich IAV Replikation in den unteren Atemwegen (Lunge) anstatt der oberen Atemwege. So korreliert Virulenz der IAV in Mäusen nicht immer in Menschen gesehen. Insgesamt, weil die Vorteile der begrenzten Nachteile überwiegen, stellt Maus erste Tiermodell verwendet, um virale Pathogenese der Grippe, Immunogenität und Schutzwirkung im Impfstoff und antivirale Studien bewerten. Darüber hinaus wäre es nicht vertretbar, Studien mit IAV mit großen Tiermodellen ohne vorherigen Nachweis in einer kleinen Tiermodell der IAV-Infektion. In dieser Handschrift die, wir beschreiben, wie Mäuse intranasal infiziert (i.n.) mit IAV, wie der Schweregrad und Fortschritten der viralen Infektion und zur Durchführung der Experimente erforderlich, um die humorale Immunantwort und Schutz Wirksamkeit bewertet.

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Protocol

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alle tierischen Protokolle, die hier beschrieben wurden durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) und der institutionellen Biosafety Committee (IBC) an der University of Rochester School of Medicine and Dentistry zugelassen und erfüllt mit den Empfehlungen in der Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Research Council 22. Die Einrichtungen und Programme der Vivarium und Division des Tieres Labormedizin der Schule von Medizin und Zahnmedizin sind von AAALAC International akkreditiert und Staatsrecht, Bundesgesetz und National Institute of Health (NIH) Richtlinie einhalten. Ähnliche Anforderungen an jede Institution zur Einhaltung der tierischen Protokolle in diesem Manuskript beschrieben angewandt werden.

1. Verwendung von kleinen Wirbeltieren

Hinweis: die richtigen persönlichen Schutz (PSA) ist erforderlich für die Arbeit mit Mäusen. Mindestanforderungen sind Einweg-Overalls, Überschuhe, Kopf Haube, Maske und Handschuhe.

  1. Gemäß dem Protokoll von IACUC legen Sie maximal 5 Mäusen pro Käfig. Nach IACUC-Protokolls, um sicherzustellen, dass das Tier tot ist Mäuse mit zwei Methoden der Sterbehilfe (die zweite ist eine physikalische Methode) einschläfern.
    Hinweis: In den Experimenten, in denen IAV Morbidität und Mortalität ausgewertet, Mäuse, die 20 % ihres ursprünglichen Körpergewichts verloren galten als die experimentelle Endpunkt erreicht haben, und mit CO 2 und zervikale Dislokation als eingeschläfert wurden die physische sekundäre Methode. Dieser Prozentsatz des Körpergewichts kann in anderen Organen unterscheiden. In den Verfahren, wo die Mäuse Lunge und Nasenschleimhaut nach IAV Infektion gesammelt werden, Mäuse sind mit eine tödliche Dosis von 2,2,2-Tribromoethanol (FSME) eingeschläfert und durch Schneiden die hepatische Ader als physische sekundäre Methode. Weibliche 6 bis 8 Wochen alten C57BL/6 Mäusen waren gekauft und gepflegt in der Tierpflege-Anlage an der University of Rochester School of Medicine and Dentistry unter bestimmten Bedingungen Pathogen-freies.

2. Biologische Sicherheit

Hinweis: In diesem Bericht sind die IAVs verwendet, um Mäuse zu infizieren die gemeinsame Maus angepasst Laborstamm A/Puerto Rico/8/34 H1N1 Influenza (PR8 WT) 22 , 23 und eine Temperatur empfindliche LAIV Variante, PR8 LAIV 8. Führen Sie alle Verfahren, die IAV Infektionen (in Vitro oder in Vivo), Zellkulturen und biologische Proben in einem biologischen Sicherheitsschrank unter Biosafety Niveau (BSL)-2 Bedingungen. Andere BSL-Anzüge oder Containment-Bedingungen zu nutzen, wenn hoch virulente IAV-Sorten verwendet werden.

  1. Reinigen die Biosicherheit Schrank mit Chlor Dioxid Desinfektionsmittel vor und nach der Durchführung der experimentellen Verfahren beschrieben in dieser Handschrift. Sterilisieren Sie alle Dissektion Material (Schere, Skalpell und seziert Zange) und die Dounce-Homogenisator, vor und nach ihrer Verwendung, die richtige IBC Empfehlungen. Sämtliches Material, während die Verfahren unter entsprechenden IBC und IACUC Richtlinien produziert entsorgen.

3. Intranasale Infektion

  1. Ort der weiblichen 6 bis 8 Wochen alten C57BL/6 Mäusen unter bestimmten Pathogen-freies Bedingungen. Organisieren und Beschriften der Maus Käfige mit dem Virus und der verwendeten Dosis. Identifizieren Sie die Mäuse in jedem Käfig mit einem Ohr Punch oder mit einem anderen zugelassenen Verfahren wie Gemälde von den Schwänzen. Legen Sie ein Maximum von 5 Mäusen pro Käfig.
  2. Bereiten die Verdünnung der IAV (fluoreszierende bilden Einheiten (FFU) / Maus) unter aseptischen Bedingungen in einem Gesamtvolumen von 30 µL/Maus in sterilen 1 x Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (PBS). Pflegen Sie das Virus Inokulum auf Eis. Berechnen Sie die Menge der IAV in der viralen Verdünnung mit der Formel hinzufügen: ((X FFU per Mausklick/30 µL) x Endvolumen) / stock virale Titer.
  3. Wiegen die Mäuse mit einer Skala und nehmen das Gewicht jeder Maus (Tag 0). Halten Sie die Maus in eine Rückenlage durch Abholung durch das Genick zwischen Zeigefinger und Daumen. Halten Sie die Rute gegen die Hand mit dem kleinen Finger.
  4. Betäuben die Maus intraperitoneal (i.p.) mit 240-250 mg/kg der FSME durch die Nadel in der kaudalen 2/3 von der rechten Seite des Bauches. Halten Sie kurz vor dem Zurückziehen der Nadelöhrs. Die Maus in den Käfig zurück und warten Sie 5 Minuten
  5. Gelten sterile ophthalmologischen Salbe für die Augen, um Trockenheit zu verhindern, während die Maus betäubt ist. Überprüfen Sie, ob die Maus durch Mangel an Pedal Rückzug Reflex (d. h. Zehe Prise) betäubt ist. Wenn Mäuse nicht vollständig betäubt sind, werden sie das Virus Husten.
  6. Wenn die Maus vollständig betäubt ist, platzieren Sie den Mauszeiger im dorsalen liegen. Setzte die Pipettieren Spitze mit 30 µL des Inokulums Virus in das Nasenloch und langsam aber ständig Auswerfen die Lösung. Achten Sie darauf, dass die Maus ist die Vorbereitung durch die Beobachtung des Inokulums verschwinden fallen einatmen.
  7. Prüfen, ob die Maus atmet wie FSME kann die Temperatur und Atmung Rate drücken. Das Tier in den Käfig, indem es in dorsal liegen zurück. Die Mäuse auf Anzeichen von Atemnot zu überwachen und wenn beobachtet, helfen der Maus zu atmen durch halten Tier vertikal und induzieren Auswirkungen Atmung 24 angetrieben. Überwachen die Maus, bis es Bewusstsein (30-45 min gewinnt nach es wurde betäubt).

4. Charakterisierung der viralen Pathogenese ( Abbildung 1)

  1. Bewertung der Morbidität und Mortalität ( Abbildung 1 und Abbildung 2)
    1. I.n. 3-4 Gruppen von weiblichen 6 bis 8 Wochen alten C57BL/6 Mäusen zu infizieren (mindestens 5 Mäusen pro Gruppe, n = 5) mit 10-divisibel Dosen (10, 10 2, 10 3 und 10 4 FFU/Maus) von PR8 WT wie beschrieben in Abschnitt 3.
    2. Monitor und wiegen die Mäuse mit einer Skala in den nächsten 14 Tagen in etwa zur gleichen Zeit, Gewicht Variationen durch Nahrungsaufnahme zu minimieren. Mäuse, die 20 % ihres ursprünglichen Körpergewichts verlieren, wie in Abschnitt 1 beschrieben einschläfern.
    3. Nach 14 Tagen einschläfern die Mäuse, die Virusinfektion zu überleben, wie in Abschnitt 1 beschrieben.
    4. Berechnen die virale 50 % Maus letale Dosis (MLD 50) basierend auf den Überlebensdaten unter Verwendung der Methode von Reed und Münch 25. Berechnen Sie zunächst, den Anteil Abstand (PD):
      Equation 1
      1. als Nächstes berechnen die MLD 50 nach folgender Formel:
        Equation 2
  2. Bewertung der viralen Titer in Lunge und Nasenschleimhaut ( Abbildung 1 und Abbildung 2. )
    1. Erholung der Lungen und Nasenschleimhaut
      1. infizieren i.n. weibliche 6 bis 8 Wochen alten C57BL/6 Mäusen (n = 6) mit der viralen Dosis, 10 / 4 FFU PR8 WT zu testen, wie beschrieben in Abschnitt 3.
      2. Sammeln Sie die Maus-Lunge und Nasenschleimhaut Tage 2 (n = 3) und 4 (n = 3).
        1. Einschläfern die Mäuse mit einer tödlichen Dosis (i.p.) FSME (500 mg/kg). Legen Sie das Tier in dorsal liegen und desinfizieren Sie das Fell über den Brustkorb mit 70 % Ethanol zu. Schneiden Sie die Haut mit einem Skalpell aus dem Brustbein auf der Basis des Bauches. Kürzen 1 cm von der Basis des Schnittes, die seitlichen Teile der Mäuse mit der Schere.
        2. Schneiden mit der Schere zu bluten die Maus als sekundäre Euthanasie-Methode die Lebervene. Legen Sie das Tier in eine Bauchlage und warten Sie 2 Minuten, damit das Blut abfließen. Dieser Schritt ist wichtig, Blut in der Lunge reduzieren.
        3. Entfernen Sie die Haut von der gesamte obere Teil der Maus (inkl. Kopf) an der Basis des Bauches, wo der erste Schnitt mit Hilfe von Pinzetten und Scheren sezieren gemacht wurde. Den Kopf mit der Schere ausschneiden und in eine sterile Petrischale trocken.
        4. Die Übergänge zwischen den Oberkiefer und Unterkiefer mit der Schere ausschneiden und entsorgen Sie den Unterkiefer. Mit der Schere zwei Schnitte an den Enden der Jochbein-Bögen und entfernen Sie sie. Entfernen Sie die Augen mit Hilfe der sezierenden Zange.
        5. Des Schädels mit der sezierenden Zange halten und das Schädeldach entlang die sagittale Naht mit einem Skalpell schneiden. Heben Sie die beiden Hälften des Schädels mit dem Gehirn, die Nasenschleimhaut zu sehen. Die nasale Schleimhäute sind umgeben von den vorderen Knochen des Schädels, einschließlich der Nasal, Oberkiefer, Jochbein, Palatin und Siebbein Knochen.
        6. Mit dem Skalpell, schneiden Sie den Teil des Schädels mit dem Gehirn und verwerfen. Legen Sie den anderen Teil des Schädels mit der Nasenschleimhaut in ein steriles Röhrchen. Das Rohr auf dem Eis (4 ° C) zu speichern, wenn die Proben sind am selben Tag bearbeitet, oder auf Trockeneis zu schnell einfrieren, wenn die Proben später bearbeitet werden.
        7. Zur Vermeidung von Kontamination der Proben reinigen und desinfizieren der Resektionsinstrumente zwischen jedem Gewebe erholt und jedes Tier Dissektion mit Chlor Dioxid Desinfektionsmittel.
        8. Der Lunge sammeln, legen Sie das Tier in dorsal liegen und der Pleura mit der Schere ausschneiden. Öffnen Sie den Brustkorb durch Schneiden die Rippen 1 cm an beiden Seiten des Brustbeins. Die Kürzungen von der Basis des Brustkorbes, der obere Teil mit der Schere machen.
        9. Stellen einen Querschnitt mit der Schere zwischen den zwei Einschnitten in den oberen Teil des Brustkorbs und entfernen Sie die Brustplatte. Die Lungen mit der Zange halten, am Ende der Luftröhre (kurz vor der Lunge) mit der Schere ausschneiden und der Lunge in ein steriles Röhrchen. Das Rohr auf dem Eis (4 ° C) zu speichern, wenn die Proben sind am selben Tag bearbeitet, oder auf Trockeneis zu schnell einfrieren, wenn die Proben später bearbeitet werden.
          Hinweis: Die Gewebeproben zu homogenisieren, am selben Tag, den sie gesammelt werden, und speichern bei-80 ° C, virale Titer später zu analysieren. Es ist wichtig, dass die Proben nicht unterziehen wiederholte Frost-Tau-Zyklen vor Virus-Titer bestimmt werden. Alternativ die Gewebeproben bei-80 ° C lagern, bis sie verarbeitet werden.
    2. Homogenisierung der Lungen und Nasenschleimhaut
      1. der Lunge oder der Nasenschleimhaut in einem sterilen Dounce-Homogenisator und fügen Sie 1 mL kalte Infektion Medien. Homogenisieren der Probenmaterials durch Verschieben der Stößel rauf und runter ca. 1 min. bei Raumtemperatur (RT), bis die Lunge völlig gestört sind. Setzen die homogenisierte Probe in ein steriles Röhrchen und Store bei 4 ° C. Verwendung für jede Probe eine neue Dounce-Homogenisator.
      2. Zentrifugieren Sie die Proben bei 300 X g für ca. 5-10 min bei RT. Collect der Überstand in ein neues steriles Röhrchen. Speichern Sie überstand bei 4 ° C zu, wenn virale Titration am selben Tag ausgeführt wird und verwerfen Sie das Pellet zu. Alternativ Einfrieren (-80 ° C) den Überstand von der homogenisierte Proben um virale Titer später bewerten.
    3. Virus Titration durch indirekte Immunfluoreszenz
      1. am Vortag Titration, seed 96-Well-Platten mit Madin Darby Canine Kidney (MDCK) Epithelzellen (4 x 10 4 Zellen/Na), ~ 80-90 % Zusammenfluss in Gewebekultur Medien zu erreichen. Platzieren Sie die Zellen in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO 2. Der Tag der viralen Titration, überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop eine Monolage zu bestätigen, bevor Sie beginnen die Virusinfektion.
      2. Vorbereiten 01:10 Verdünnungen des Überstands der homogenisierten Proben (Lungen- oder Nasenschleimhaut) Infektion Medien in einer 96-Well-Platte. Führen Sie die virale Titration durch Triplicates, virale Titer genau zu bestimmen.
        1. Hinzufügen 90 µL Infektion Medien zueinander der Brunnen in der 96-Well-Platte. Hinzu kommt 10 µL des Überstands der homogenisierten Proben eines Brunnen A1, A2 und A3, die virale Titer von jeder Probe in dreifacher Ausfertigung zu bewerten. Brunnen A4, A5 und A6 10 µL einer anderen Überstand der homogenisierten Proben hinzufügen. Führen Sie die gleichen Verdünnung nacheinander mit dem Rest der Proben.
        2. Nach der Zugabe der Probe überstand, Reihe A, verwenden, eine Mehrkanal-Pipettieren um zu mischen, durch Pipettieren rauf und runter. 10 µL von Reihe A, Reihe B. Change die Spitzen zwischen Verdünnungen und mischen Sie gut. Wiederholen Sie diesen Vorgang bis zum Erreichen der letzten Zeile (H).
      3. Entfernen der Gewebekultur Medium (Schritt 4.2.3.1) mit einem Vakuum-Sauger-Mehrkanal-Adapter aus den MDCK-Zellen in der 96-Well Platten und zweimal mit 100 µL/Well 1 X PBS waschen.
      4. Transfer 50 µL/Well seriell verdünnt Überstand der homogenisierten Proben auf der 96-Well-Platte mit MDCK-Zellen. Starten Sie die höhere Verdünnungen (Reihe H) auf die niedrigeren Verdünnungen (Reihe A) übertragen. In diesem Fall ist es nicht notwendig, zwischen verschiedenen Zeilen Spitzenwechsel.
      5. Setzen die 96-Well-Platten auf einer rockigen Plattform für 1 h bei RT um virale Adsorption zu ermöglichen. Entfernen Sie nach viralen Adsorption das Inokulum mit einem Vakuum-Sauger-Mehrkanal-Adapter und 100 µL/Well der Medien nach der Infektion. Inkubieren Sie infizierte Zellen für 8 h in einem 33 ° C und 37 ° C Inkubator mit 5 % CO 2. Gehen Sie um die Festsetzung, Färbung, Bildgebung und virale Titer Berechnung wie in Schritten 4.2.3.6 – 4.2.3.12.
      6. Entfernen der Gewebekultur Medium von den 96-Well-Platten mit einem Vakuum-Sauger-Mehrkanal-Adapter. Zu beheben und die Zellen mit 100 µL/Well Fixierung/Permeabilisierung Lösung für 20 min bei RT. permeabilize
        Achtung: Verwenden Sie die Fixierung/Permeabilisierung Lösung in einer Dampfhaube, um Formaldehyd-Exposition zu verhindern.
      7. Die Fixierung/Permeabilisierung Lösung mit einem Vakuum-Sauger-Mehrkanal-Adapter entfernen, mit 1 X PBS waschen und die festen Zellen mit blockiert Lösung für 1 h bei RT. Store die Zellen blockiert Lösung bei 4 ° C inkubieren oder mit dem nächsten Schritt fortfahren.
      8. Entfernen Sie die blockierende Lösung. Fügen Sie 50 µL/Well von 1 µg/mL monoklonaler Antikörper (mAb) Anti-NP HB-65 in Antikörperlösung Verdünnung verdünnt. Inkubation für 1 h bei 37 ° c verschiedene mAb oder polyclonAl (pAb) Antikörper Anti-PR8 verwendet werden kann.
      9. Unterdessen verdünnen 1: 200 Fluorescein-Herstellung (FITC)-konjugierten Anti-Maus Sekundärantikörper in Verdünnung Antikörperlösung. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 1.700 x g für ca. 5-10 min bei RT Andere mit anderen Fluorophore konjugierten Sekundärantikörper verwendet werden können.
      10. Entfernen Sie den primären Antikörper und 3 Mal mit 100 µL/Well 1 X PBS waschen. Fügen Sie 50 µL/Well der Sekundärantikörper Verdünnung und inkubieren Sie für 30-45 min bei 37 ° C. Entfernen Sie den sekundären Antikörper und 3 Mal mit 100 µL/Well 1 X PBS waschen. Verlassen die letzten Wäsche in der Platte.
      11. Beobachten die Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop zu bestimmen, die Anzahl der positiv gefärbten Zellen (grün). Berechnen Sie die virale Titer durch zählen der FFU/mL. Die virale Titer, ausgedrückt in FFU/mL von der Verdünnung mit 30-50 positiv gefärbten Zellen mit der Formel zu berechnen: ((n1 + n2 + n3) / 3) x 20 x 1/Verdünnung.

5. Bewertung der humoralen Immunantwort ( Abbildung 3)

  1. infizieren i.n. 3 Gruppen von weiblichen 6 bis 8 Wochen alten C57BL/6 Mäusen (n = 5) mit den verschiedenen Dosen (10 2, 10 3 und 10 4 FFU / Maus) von PR8 LAIV und Mock-infizieren eine Gruppe (n = 5) mit 1 x sterile PBS als Negativkontrolle. I.n Maus Infektionen führen, wie in Abschnitt 3 beschrieben.
    1. Maus Blutungen durch mandibulären Punktion
      1. vierzehn Tage nach der Immunisierung, sammeln die Mäuse Blut mandibulären Blutungen mit einer 4 mm Lanzette 26, oder mit einem anderen IACUC Verfahren genehmigt.
        1. Halten die Maus durch Abholung durch das Genick zwischen Zeigefinger und Daumen. Halten Sie die Rute gegen die Hand mit dem kleinen Finger auf die Maus zu immobilisieren.
        2. Setzen Sie die Maus in Seitenlage auf die Wange zu sehen. Die Punktion an der Stelle des Retro-Orbital und mandibulären Venen mit der Halsschlagader zu machen. Sinken die Lanzette (4 mm) und das Blut in ein steriles Röhrchen zu erholen (ca. 0,2 - 0,4 mL/Maus sind wiederhergestellt). Üben Sie Druck auf die Einstichstelle mit einem sterilen Tuch für ein paar Sekunden. Platzieren Sie die Maus zurück in den Käfig.
      2. Setzen die Röhren für 1-2 h bei 37 ° C und anschließend Zentrifugieren sie 700 X g für 30 min bei RT, das Serum aus dem Blut zu trennen. Übertragen Sie die obere Schicht, die aus dem Serum mit einem pipettieren, ein neues steriles Röhrchen besteht. Entsorgen Sie das Pellet der roten Blutkörperchen (Erythrozyten). Speichern Sie das Serum bei-20 ° c
  2. Analyse der gesamten Antikörper gegen virale Proteine
    1. Vorbereitung der infizierten MDCK Zellextrakte
      1. am Vortag Infektion, Samen ein 100-Millimeter-Teller mit 4-5 x 10 6 MDCK Zellen (~ 80-90 zu erreichen % Zusammenfluss am nächsten Tag) in Gewebekultur Medien. Platzieren Sie die Zellen in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO 2. Der Tag der Virusinfektion, überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop eine Monolage zu bestätigen, bevor Sie beginnen die Virusinfektion.
      2. Bereiten eine virale Verdünnung mit einer niedrigen (0,001) Vielzahl der Infektion (MOI) des PR8 WT in Infektion Medien im gesamten letzten Band 4 mL. Berechnen Sie die Menge der PR8 WT mit der Formel ((X MOI x n ° Zellen) x Endvolumen) / stock virale Titer.
      3. Gewebe Kulturmedium aus MDCK Zellplatte Aspirieren und zweimal mit 4 mL 1 X PBS waschen. Fügen Sie das virale Inokulum (4 mL) und setzen Sie die Platte auf einer rockigen Plattform für 1 h bei RT um virale Adsorption zu ermöglichen. Entfernen Sie das virale Inokulum mit Vakuum und 8-10 mL nach der Infektion Medien mit 1 µg/mL Trypsin TPCK behandelt. Inkubieren Sie infizierte Zellen für 48-72 h in einem 33 ° C und 37 ° C Inkubator mit 5 % CO 2.
      4. Lösen die Zellen mit Hilfe einer Zelle Schaber und sammeln Sie die Zellen und Gewebe Kulturmedium mit einem Pipettieren in eine 15-mL-Tube. Zentrifugieren Sie das Rohr auf 400 X g für ca. 5-10 min bei RT Aspirat überstand und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL RIPA Puffer und setzen Sie die Mischung in eine 1,5 mL steriles Röhrchen. Inkubieren Sie für 20-30 min auf Eis
      5. Zentrifuge das Rohr auf 1.300 x g für 20-30 min bei 4 ° C. sorgfältig, wiederherstellen den überstand. Laden die Zelle extrahieren in 100 µL-Aliquots bei-20 ° c
      6. Titrieren Zellextrakte wie beschrieben durch Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) vor deren Auswertung auf das Vorhandensein von Antikörpern 9 , 10 , 11 , 27. Include Zelle extrahiert aus Mock-infizierten MDCK-Zellen (zubereitet wie oben angegeben) als Negativkontrolle.
    2. ELISA ( Abbildung 4)
      1. Polystyrol 96-Well-Platten mit der entsprechenden Verdünnung infiziert hat Zelle mit 1 X PBS-Puffer (in der Regel zwischen 1: 200 - 1:1 000 extrahieren) zu beschichten. Eine weitere Platte mit den gleichen Verdünnung von Mock-infizierten MDCK-Zellen-Extrakt als Negativkontrolle zu beschichten. Inkubation über Nacht (O/N) bei 4 ° c
      2. Den Überstand mit einem Vakuum-Sauger-Mehrkanal-Adapter zu entfernen und Waschen einmal mit 100 µL/Well 1 X PBS mit einem Mehrkanal-pipettieren. Blockieren der unspezifischen Bindung durch Zugabe von 100 µL/Well blockieren Lösung für 1 h bei RT
      3. Unterdessen machen 2-fold serielle Verdünnungen (ab Verdünnung 01:50) des Sera aus jeder Maus im Schritt 5.1 in Verdünnung Antikörperlösung in eine 96-Well-Platte infiziert.
      4. Entfernen Sie die blockierende Lösung aus Polystyrol 96-Well-Platten mit einem Vakuum-Sauger-Mehrkanal-Adapter. Fügen Sie 50 µL jeder Maus-Serum-Verdünnung in den entsprechenden Brunnen und inkubieren Sie 1 h bei 37 ° c
      5. Entfernen der Mäuse Sera mit einem Vakuum-Sauger-Mehrkanal-Adapter. Waschen Sie die Brunnen 3 Mal mit destilliertem Wasser mit einem Mehrkanal-pipettieren. Fügen Sie 50 µL/Well aus einem sekundären Anti-Maus-Antikörper konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) verdünnt 1:2,000 in Verdünnung Antikörperlösung. 1 h bei 37 ° c inkubieren
      6. Entfernen den sekundären Antikörper mit einem Vakuum-Sauger-Mehrkanal-Adapter. Waschen Sie die Brunnen 3 Mal mit destilliertem Wasser mit einem Mehrkanal-pipettieren. Bereiten Sie die Tetramethylbenzidine (TMB) Substrat-Lösung durch Mischen von 1:1 Lösung A und B. hinzufügen 100 µL/Well des Substrats und ca. 5-10 min bei RT im Dunkeln inkubieren.
      7. Stoppen die Reaktion durch Zugabe von 100 µL/Well von 0,2 N H 2 SO 4. Lesen Sie die Platten bei 450 nm auf einem ELISA-Reader Platte.
      8. Subtrahieren Sie den Wert jeder Verdünnung der MDCK Mock-infizierten 96-Well-Platte aus den Wert in der MDCK-infizierten 96-Well-Platte. Berechnen Sie die durchschnittlichen Werte für jede Verdünnung mit dem verschiedenen Sera und vertreten sie in ein Diagramm, Standardabweichungen (SD).
  3. Analyse von neutralisierenden Antikörpern
    1. Hämagglutination Inhibition (HAI) Assay ( Abbildung 5)
      1. vor der Durchführung der HAI Assay, behandeln die Maus Sera mit Rezeptor zerstören Enzym (RDE), alle nicht-spezifische Inhibitoren vorhanden im Serum zu beseitigen. 4 Bände von RDE arbeiten Verdünnung 1 Volumen von Maus-Serum hinzufügen (Serum Verdünnung beträgt nun 1:5). O/N (12 - inkubieren 18 h) in einem 37 ° C Wasserbad.
      2. Heizen die Serumproben bei 56 ° C für 30 min, das RDE zu inaktivieren.
      3. Bestimmen die Hämagglutination Aktivität (HAU) von PR8 WT von standard HA Assay 28. Sobald die virale HAU feststeht, virale Lager 8 HAU pro 50 µL in 1 X PBS verdünnen.
      4. Bereiten 2-fold Verdünnungsreihen (12 Verdünnungen) RDE behandelt Sera in eine 96-Well-V-Boden-Platte. Verwenden Sie eine Zeile für jede Serumprobe (z.B. A1, A12).
        1. Hinzufügen 25 µL 1 x PBS von A1, A12 Wells. Testen Sie jede der Serumproben in einer Zeile. 25 µL 1 X PBS in der ersten Spalte (A1) 25 µL der RDE-behandelten Sera (1:5) hinzufügen. Die erste Serum-Verdünnung ist 01:10.
        2. Nach der ersten Spalte alle RDE behandelt Seren hinzugefügt werden (z.B. A1, B1, C1), verwenden Sie eine Mehrkanal-Pipettieren der Sera und 1 X PBS mischen durch Pipettieren rauf und runter. 25 µL des verdünnten Sera aus der ersten Spalte in der zweiten Spalte (z.B. von A1 bis A2) zu übertragen. Ändern Sie die Spitzen zwischen Verdünnungen und mix.
        3. Wiederholen Sie die Schritte 5.3.1.4.2. bis zum Erreichen der letzten Spalte (z.B. A12, B12, C12). Entsorgen Sie die 25 µL aus der letzten Spalte, die Lautstärke in alle Wells (25 µL) konsistent zu halten. Umfassen eine Reihe von Brunnen mit nur 25 µL 1 X PBS ohne jede Sera als Negativkontrolle.
      5. Hinzufügen 25 µL der IAV verdünnt, um 8 HAU/50 µL zu jedem der Brunnen mit Sera in 96-Well-V-Boden-Platte; das Endvolumen in jedem ist gut 50 µL, mit 4 HAU des Virus. Mischen Sie den Inhalt durch wiederholte pipettieren. 1 h bei RT inkubieren
      6. Fügen Sie 50 µL 0,5 % Türkei Erythrozyten zu jedem der Brunnen. Mischen Sie den Inhalt durch wiederholte pipettieren. Inkubieren Sie die Platte für 30-45 min auf Eis. Der HAI Assay visuell zu lesen, wenn der Erythrozyten in die Kontroll-Vertiefungen (1 X PBS) einen roten Niederschlag (d. h. Pellet) an der Unterseite der Brunnen bilden.
        Hinweis: Erythrozyten von anderen Tierarten wie z. B. Hühner, Meerschweinchen oder Pferd kann auch verwendet werden.
      7. Berechnung der HAI-Titer durch die Identifizierung der letztes auch in denen der Erythrozyten bilden eine rote Kugel und Hämagglutination tritt nicht auf,.
        Hinweis: Der Kehrwert von dieser Verdünnung ist die HAI-Titer. Der Kehrwert ist multipliziert mit einem Faktor von 20 für die 01:20 korrigieren Verdünnung des Serums in der ersten Reihe.
    2. Virus Microneutralization Assay (VNA) ( Abbildung 6)
      1. am Vortag VNA, bereiten MDCK-Zellen in eine 96-Well-Platte, Zusammenfluss von 80-90 % am nächsten Tag zu erreichen, wie in Schritt 5.2.1.1 beschrieben. Bereiten Sie eine Verdünnung von PR8 WT Infektion Medien bis 200 FFU/25 µL haben.
      2. Inaktivierung der Maus Sera bei 56 ° C für 1 h 2-fold Verdünnungsreihen (12 Verdünnung) pro Maus Sera in dreifacher Ausfertigung mit einer 96-Well-Platte machen.
        1. Hinzufügen 40 µL Serum auf 160 µL Infektion Medien in die erste Vertiefung der ersten Zeile (z.B. A1) (Serum Verdünnung 1:5). Mischen von pipettieren. Die weiteren Bohrungen 100 µL der Infektion Medien hinzufügen (A2 bis H12).
        2. Transfer 100 µL aus der ersten Zeile der zweiten Zeile, 1:2 Verdünnungen (z.B. von A1 bis A2) zu machen. Ändern Sie Tipps zwischen Verdünnungen und Mischung von pipettieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang bis zur letzten Reihe (z.B. A12). Entsorgen Sie 100 µL aus der letzten Reihe, die Lautstärke in alle Wells (100 µL) konsistent zu halten.
      3. Hinzufügen 100 µL der IAV Verdünnung in alle Vertiefungen. 1 h bei RT inkubieren Unterdessen das Gewebe Kulturmedium aus den MDCK-Zellen in der 96-Well-Platte mit einem Vakuum-Sauger-Mehrkanal-Adapter zu entfernen und waschen zweimal mit 100 µL/Well 1 X PBS.
      4. In jedem 96-Well-Platte MDCK-Zellen, lassen Sie zwei Zeilen für die Steuerelemente. Eine Zeile ist die negativ-Kontrolle (Zellen ohne Virus und Sera), und die zweite Zeile ist die positive Kontrolle der Infektion (Zellen mit Viren in der Abwesenheit von Sera oder Seren von Mock-infizierten Mäusen).
      5. Transfer 50 µL/Well von Virus-Antikörper-Platte an den 96-Well-Platten von MDCK-Zellen. Setzen Sie die Platten auf einer rockigen Plattform für 1 h bei RT virale Adsorption ermöglichen.
      6. Das Virus-Antikörper-Inokulum mit einem Vakuum-Sauger-Mehrkanal-Adapter zu entfernen und hinzufügen 100 µL/Well nach der Infektion Medien mit 1 µg/mL TPCK behandelt Trypsin.
      7. ~ 3-4 Tage in einem 33 ° C und 37 ° C Inkubator mit 5 % CO 2 Zellen inkubieren, bis zytopathischer Effekt (CPE) in der Positivkontrolle (infizierte Zellen in Abwesenheit von Sera oder mit Kontrollserum) beobachtet wird.
      8. Entfernen der Gewebekultur-Medium mit einem Vakuum-Sauger-Mehrkanal-Adapter und 100 µL/Well von 0,1 % Kristallviolett. Inkubieren Sie für 1 h bei RT. Entfernen Sie die Kristallviolett-Lösung mit einem Vakuum-Sauger-Mehrkanal-Adapter. Die Brunnen 3 Mal mit destilliertem Wasser zu waschen. Trocknen Sie die Platten bei RT
      9. Berechnen die VNA-Titer durch die Ermittlung der höchsten Verdünnung, die eine konfluierende Cell Monolayer MDCK Zellen beibehält.
        Hinweis: Der Kehrwert dieser entsprechende Verdünnung ist der neutralisierende Antikörpertiter. Der Kehrwert ist multipliziert mit einem Faktor von 10 zu korrigieren, die 01:10 Verdünnung des Sera in die erste Vertiefung der Zeile.

6. Bewertung der Schutz Wirksamkeit Impfstoffe ( Abbildung 3)

  1. impfen i.n. eine Gruppe von weiblichen 6 bis 8 Wochen alten C57BL/6 Mäusen (n = 11) mit der PR8 LAIV Dosis zu testen (FFU/Maus) und eine andere Gruppe von Mäusen Mock zu impfen (n = 11) mit 1 x sterile PBS. Führen Sie die Maus i.n. Impfungen wie zuvor beschrieben in Abschnitt 3.
  2. Vierzehn Tage nach der Impfung, bluten die Mäuse und die Sera zu sammeln, wie in Abschnitt 3 beschrieben. Analysieren Sie die Anwesenheit von Total und neutralisierenden Antikörpern gegen PR8 WT, wie beschrieben in Abschnitt 5.1.1.
  3. 15 Tage nach der Impfung, Messung und Aufzeichnung der Maus des Körpergewichts (Tag 0). Fordern Sie Mäuse i.n. mit eine tödliche Dosis von PR8 WT (homologe Challenge) wie oben beschrieben in Abschnitt 3.
  4. Messen, das Körpergewicht und das Überleben (n = 5 / Gruppe) innerhalb von 14 Tagen nach der Herausforderung, die Morbidität und Mortalität von PR8 WT Herausforderung bei geimpften Mäusen (Abschnitt 4.1) produziert bewerten.
  5. Maus-Lunge und Nasenschleimhaut zu erholen (n = 3/Tag) an Tag 2 und Tag 4 Post-challenge mit PR8 WT homogenisieren und die Lungen zu analysieren und Nasenschleimhaut wie in Abschnitt 4.2 beschrieben, bewertet die virale Replikation PR8 WT bei geimpften Mäusen.

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Representative Results

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Charakterisierung der viralen Pathogenese bei Mäusen

Die Pathogenese der IAV bezieht sich auf die Morbidität und Mortalität durch die Infektion verursacht. Diese beiden Parameter können leicht bei Mäusen ausgewertet werden: IAV Morbidität Körper Gewichtsverlust bei infizierten Mäusen zugeordnet ist und der Prozentsatz des Überlebens zeigen die Sterblichkeitsrate (Abbildung 1). Das Körpergewicht und das Überleben bei IAV-infizierten Mäusen werden in der Regel täglich für mindestens zwei Wochen nach Infektion8,9,10,29überwacht. Die Überlebensdaten erhalten können die MLD50 bestimmen, die nach der Methode von Reed und Münch25berechnet wurde. Ein weiterer Indikator für IAV Pathogenese bezieht sich auf die virale Replikation in der unteren (Lunge) und in den oberen (Nasenschleimhaut) Atemwegen (Abbildung 1). Die Informationen mit der viralen Titer in diesen Organen entspricht der Morbidität und Mortalität Werte und zusammengenommen bieten einen guten Überblick über virale Pathogenese. Es ist bekannt, dass IAV Replikation in Maus-Lunge Höhepunkt zwischen 2 und 4 Tage nach der Infektion (p.i.), und so wir empfohlen Wiederherstellung dieser Organe bei 2 und 4 Tage p.i.

Figure 1
Abbildung 1: Charakterisierung der IAV Pathogenese bei Mäusen: IAV Pathogenese bei Mäusen bezieht seine Morbidität (Körper-Gewicht-Verlust) und Mortalität (% überleben) und auch die Fähigkeit der IAV in der oberen (Nasenschleimhaut) und unteren Atemwege (Lunge) zu replizieren. Kurz, am Tag 0 Mäuse sind gewogen und intraperitoneale mit 2,2,2-Tribromoethanol (FSME) betäubt, bevor sie mit IAV intranasal infiziert sind. Von Tag 1 bis Tag 14 werden Mäuse auszuwertende Körper Weight Loss (Morbidität) und % überleben (Mortalität) zu berechnen, die Maus letale Dosis 50 (MLD50) täglich gewogen. An den Tagen 2 und 4. Tag nach der Infektion Mäuse Lungen und Nasenschleimhaut erholt und homogenisiert, um virale Replikation zu bewerten. BSL-2 Bedingungen werden Mäuse Experimente zur Charakterisierung von IAV Pathogenese mit PR8 WT durchgeführt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

In Abbildung 2werden bei der Bewertung von PR8 WT Pathogenese gewonnenen Daten dargestellt. Vier Gruppen von 6 bis 8 Wochen alten C57BL/6 Mäusen (n = 11) wurden infizierte i.n. mit den angegebenen Dosen (10, 102, 103 und 104 FFU/Maus) von PR8 WT. Das Körpergewicht und das Überleben von 5 Mäusen pro Gruppe waren 14 Tage p.i. (Abbildung 2AB) gemessen. Alle Mäuse mit 104 FFU PR8 WT verloren Gewicht schnell immunisiert (Abbildung 2A) und alle von ihnen starb am Tag 5 und 6 p.i. (Abb. 2 b). Mäuse mit 103 FFU PR8 WT verloren Körpergewicht beim später mal PI (Abbildung 2A) und sie alle starben durch die 7. und 8. Tag p.i. (Abb. 2 b) geimpft. Alle Mäuse geimpft mit 102 FFU PR8 WT verloren Körpergewicht (Abbildung 2A) aber nur 2 von ihnen starben am 9. Tag p.i. (Abbildung 2 b). Zu guter Letzt Mäuse mit 10 immunisiert FFU PR8 WT nicht verlieren Gewicht (Abbildung 2A) und alle von ihnen überlebte Infektion (Abb. 2 b). Die MLD50 PR8 WT in diesem Experiment mit dem Reed und Münch Methode25 berechnet war 1,5 x 102 FFU (Abbildung 2).

Zu bewerten die PR8-Replikation in der oberen und unteren Atemwege-Darm-Trakt von Mäusen infiziert i.n. mit den angegebenen Dosen (10, 102, 103und 104 FFU/Maus), die Lunge und die Nasenschleimhaut wurden geborgen, am Tag 2 und 4 p.i. (n = 3). Nach der Homogenisierung der Lunge wurde die Menge an Viren in diesem Organ Immunfluoreszenz-Assay (Abb. 2D) analysiert. Die virale Titer in den Lungen der verschiedenen Mäuse Gruppen erkannt wurde im Zusammenhang mit der Dosis verwendet, um sie zu impfen: höhere virale Titer erkannt wurden, in der Lunge von Mäusen mit 10 immunisiert4 FFU PR8 WT am Tag 2 und 4 p.i., während niedrigere virale Titer in entdeckt wurden die Lunge von Mäusen mit 10 FFU PR8 WT immunisiert.

Figure 2
Abbildung 2: Darstellung der Daten zu erhalten, bei der Bewertung der virale Pathogenese: Morbidität und Mortalität von PR8 WT, 6 bis 8 Wochen alten weiblichen C57BL/6 Mäusen zu analysieren (n = 5) wurden infizierte i.n. mit der angegebenen Anzahl von Leuchtstoff-bildende Einheiten (FFU) PR8 WT und dann täglich für 2 Wochen für (A)-Körper-Gewicht-Verlust (Morbidität) überwacht und (B) überleben (Mortalität). Daten darstellen, die Mittel und die Standardabweichungen der einzelnen Mäuse ermittelten Ergebnisse (n = 5). (C) Werte % überleben mehr als 2 Wochen ausgewertet werden verwendet, um die MLD50 mit Reed und Münch Methode25zu berechnen. (D), virale Replikation, 6 bis 8 Wochen alten weiblichen C57BL/6 Mäusen zu bewerten (n = 6) wurden infizierte i.n. mit der angegebenen Nummer der FFU. Virusreplikation in der Lunge oder der Nasenschleimhaut von infizierten Mäusen wird in der Regel am Tag 2 und 4 p.i. mit einem Immunofocus-Assay ausgewertet. Virale Titer werden als FFU/mL erfasst. Daten stellen die Mittel und SDs Ergebnisse in jeder Maus. Gestrichelte Linien sind an der Nachweisgrenze (200 FFU/mL) des Assays enthalten. Mäuse und Gewebekultur Experimente zur IAV Morbidität, Mortalität und virale Titer mit PR8 bewerten wurden unter BSL-2 Bedingungen durchgeführt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Bewertung der humoralen Reaktionen nach der Impfung induziert

Humorale Reaktionen induziert IAV Infektionsschutz spielen eine wesentliche Rolle bei der Kontrolle der Virusinfektion. Aus diesem Grund ist es sehr wichtig, die humoralen Reaktionen hervorgerufen durch IAV WT Infektionen oder durch neue IAV Impfstoffe (Abbildung 3) zu analysieren. Im Mausmodell sind 14 Tage nach der Immunisierung, Mäuse blutete, um das Vorhandensein von Antikörpern gegen die gesamte virale Proteine von ELISA (Abbildung 4) und das Vorhandensein von neutralisierenden Antikörpern Ausrichtung auf das virale HA Protein, das in der Regel zu analysieren durch gemeinsame serologische Ansätze, wie ein HAI Assay (analysiertNG-Klasse = "Xfig" > Abbildung 5) und/oder eine VNA (Abbildung 6).

Figure 3
Abbildung 3: Schema der verschiedenen Schritte in der Charakterisierung der Schutz Wirksamkeit von einem LAIV, Sicherheit und Immunogenität: Bei der Entwicklung einer neuen LAIV wird Mausmodell der IAV-Infektion normalerweise verwendet, um Schutz, Sicherheit und Immunogenität Wirksamkeit zu testen. In diesem Schema, Experimente, Sicherheit (A) zu bewerten sind Immunogenität (B) und Schutz Wirksamkeit (C) eines Kandidaten LAIV angegeben. (A) zur Bewertung der Sicherheit eine LAIV ist es erforderlich, die gleichen Parameter bestimmen (Morbidität, Mortalität und virale Replikation in der oberen und unteren Atemwege) in Abbildung 1beschrieben. Immunogenität bewerten, Mäuse sind geimpft und 14 Tage nach der Impfung sind sie durch mandibulären Punktion bluteten. Humorale Reaktionen werden analysiert, indem die Bewertung total Antikörper gegen IAV Proteine durch Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) und durch die Auswertung der Präsenz von neutralisierenden Antikörpern durch Hämagglutination Inhibition Assay (HAI) und/oder virus Microneutralization-Assay (VNA). (C) Schutz Wirksamkeit, 15 Tage nach der Impfung, auszuwertende Mäuse stehen vor der Herausforderung mit IAV WT. Protection Wirksamkeit wird durch die Messung der Mäuse Morbidität, Mortalität und virale Titer in den Lungen von herausgefordert Mäuse ausgewertet, wie in Abbildung 1 beschrieben . Mäuse-Experimente, Schutz, Sicherheit und Immunogenität Wirksamkeit von LAIV Kandidat zu charakterisieren sind unter BSL-2 Bedingungen durchgeführt. Andere BSL-Anzüge oder Containment Bedingungen sein abhängig von der IAV-Sorte verwendet für die Herausforderung von geimpften Mäusen erforderlich. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Immunogenität von PR8 LAIV, drei Gruppen von 6 bis 8 Wochen alten C57BL/6 Mäusen zu beurteilen (n = 5) wurden mit unterschiedlichen Dosen geimpft (102, 103und 104 FFU/Maus) PR8 LAIV oder Mock geimpft mit 1 X PBS als Negativkontrolle. Vierzehn Tage nach der Impfung wurden Mäuse Seren von mandibulären blutende26 (Abbildung 3) gesammelt. Antikörperantworten gegen insgesamt virale Proteine wurden von ELISA mit einer Verdünnung 1: 200 der Zelle Extrakt PR8-infizierten MDCK Zellen (Abbildung 4) bewertet. Jedes Serum wurde einzeln analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass die Seren von Mäusen mit der höheren Dosis geimpft (104 FFU) PR8 LAIV hatte höhere Antikörpertiter gegen insgesamt PR8 Proteine als die Seren von Mäusen, die mit der niedrigeren Dosis geimpft (102 FFU). Seren Kontrolle (Mock-infizierten Mäusen) zeigen Reaktivität gegen PR8 Antigene nicht.

Figure 4
Abbildung 4: Schematische Darstellung des Enzym-linked Immunosorbentprobe Assays (ELISA), humorale Antikörperreaktionen zu bewerten: PR8-spezifische Antikörper vorhanden bei infizierten Mäusen werden durch ELISA in Polystyrol 96-Well-Platten beschichtet mit Zelle Extrakten von Mock (Kontrolle) oder PR8-infizierten MDCK Zellen bestimmt. Kurz, auf 14 Tage p.i. (Abbildung 3), Mäuse, die mit den angegebenen Dosen PR8 LAIV immunisiert wurden durch mandibulären Punktion geblutet und Seren wurden gesammelt. Jedes Serum wurde individuell von ELISA für IgG-Antikörper gegen insgesamt PR8 Proteine bewertet. Grafische Darstellung von Daten repräsentieren die Mittel und Standardabweichung der Ergebnisse aus einzelnen Mäusen gewonnen Sera (n = 6). O.D, optische Dichte. ELISA-Assays wurden in einem Schrank BSL-2 durchgeführt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Das Vorhandensein von neutralisierenden Antikörpern in der Maus analysieren Serum mit dem HAI assay, 2-fold Verdünnungsreihen von Sera (zuvor bei 56 ° C inaktiviert) jeder Gruppe von Mäusen mit verschiedenen Dosierungen immunisiert (102, 103und 104 FFU) von PR8 LAIV mit 4 HAU PR8 WT für 1 h bei RT (Abbildung 5) inkubiert wurden. Dann wurden 0,5 % der Türkei RBCs PR8-Sera Mischungen hinzugefügt. Der obere Teil der Abbildung 5 ist eine schematische Darstellung der möglichen HAI Ergebnisse: Wenn das Serum neutralisierende Antikörper enthält, Erythrozyten Niederschlag beobachtet in der Unterseite des Brunnens weil die Antikörper gegen das virale HA Protein gebunden verhindern die Hämagglutination der Erythrozyten. Auf der anderen Seite wird in der Abwesenheit von neutralisierenden Antikörpern, Hämagglutination der Erythrozyten beobachtet. Dann ist die HAI-Titer als Kehrwert der Verdünnung des Serums in den letzten gut fehlt Hämagglutination berechnet. Die HAI-Ergebnisse zeigten im unteren Teil der Abbildung 5 zeigen, dass das Serum von Maus mit die größte Menge an PR8 LAIV geimpft (104 FFU) haben höhere Titer von neutralisierenden Antikörpern, während das Serum von einer Maus mit immunisiert die niedrigere Dosis (102 FFU) haben die niedrigsten Titer von neutralisierenden Antikörpern gegen PR8. Keine neutralisierende Antikörper waren im Serum Kontrolle (Mock-infizierten Mäusen) anwesend.

Figure 5
Abbildung 5: Hämagglutination Inhibition (HAI) Assay: Ebenen von neutralisierenden Antikörpern gegen PR8 WT bei infizierten Mäusen können leicht durch HAI Assay ausgewertet werden. 2-fold serielle Verdünnungen (ab Verdünnung 01:10) Seren von Mäusen, die mit den angegebenen Dosen PR8 LAIV immunisiert wurden kurz (1:1) mit 4 HAU PR8 WT für 1 h bei RT in eine 96-Well-V-Boden-Platte gemischt. Nach 1 h Inkubation wurden die Virus-Serum-Gemische für 30-60 min auf Eis 0,5 % RBCs hinzugefügt. HAI-Titer sind bestimmt durch die Identifizierung der letztes auch in denen der Erythrozyten bilden einen roten Knopf und Hämagglutination tritt nicht (oben). HAI-Assays mit PR8 WT wurden in einem Schrank BSL-2 durchgeführt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

In Abbildung 6ist die Daten in der Auswertung von neutralisierenden Antikörpern im Serum Maus VNA vertreten. 200 FFU PR8 WT mit 2-fold Verdünnungsreihen von Sera (zuvor Inactivat gemischtEd bei 56 ° C) von Mäusen immunisiert mit verschiedenen Dosierungen (102, 103und 104 FFU) von PR8 LAIV für 1 h bei RT Jede Serumprobe wurde in dreifacher Ausfertigung bewertet. Die Virus-Sera-Mischungen wurden zur Monolagen MDCK-Zellen in einer 96-Well-Platte zu infizieren. Der obere Teil der Abbildung 6 ist eine schematische Darstellung der möglichen VNA Ergebnisse: Abwesenheit von neutralisierenden Antikörpern in der Serum führt CPE auf ca. 3-4 Tage p.i. Im Gegensatz dazu wenn neutralisierende Antikörper vorhanden sind (intakte Zelle Monolayer), sie binden an die virale HA und virale Infektionen zu verhindern, und es gibt keinen CPE. Vorhandensein von CPE ist in der Regel durch Färbung infizierten Zellen mit Kristallviolett visualisiert und virale Neutralisation Titer berechnet als Kehrwert der letzten Verdünnung auf die Infektion vollständig blockiert ist. Die Ergebnisse der VNA sind im unteren Teil der Abbildung 6dargestellt. Das Serum von Mäusen, die mit den hohen Anteil an PR8 LAIV immunisiert (104 FFU) haben den größten Titer von neutralisierenden Antikörpern bei Seren von Mäusen, die mit der niedrigeren Dosis oder PR8 LAIV immunisiert (102 FFU) haben die niedrigsten Titer von neutralisierenden Antikörpern, ähnlich wie mit dem HAI Assay erzielten Ergebnisse. Keine neutralisierende Antikörper waren im Serum von Mock-infizierten Mäusen anwesend.

Figure 6
Abbildung 6: Virus Microneutralization Assay (VNA): Eine Alternative zu den HAI Assay, VNA-Assay kann das Vorhandensein von PR8 WT neutralisierenden Antikörpern auswerten. Kurz, Seren von Mäusen, die mit der angegebenen Dosen von PR8 LAIV geimpft wurden serienmäßig 2-fold (Anfang Verdünnung 1:5) in 96-Well Platten verdünnt und gemischt 1:1 mit 200 FFU PR8 WT für 1 h bei RT Nach 1 h dienten die Virus-Serum-Gemische, 96-Well-Platten von MDCK Zellen zu infizieren. Infizierte Zellen wurden für 3-4 Tage bis zum kompletten zytopathischen Effekt inkubiert. Die 96-Well-Platten wurden dann mit 0,1 % Kristallviolett gefärbt. VNA-Titer sind durch die Ermittlung der höchsten Verdünnung weiterhin eine Monolage konfluierende Zelle bestimmt. VNA mit PR8 WT wurden unter BSL-2 Bedingungen durchgeführt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Bewertung der Wirksamkeit der Schutz von IAV Impfstoffen bei Mäusen

Bei der Entwicklung einer neuen LAIV muss seinen Schutz, Sicherheit und Immunogenität Wirksamkeit getestet in Vivo, und die Maus-Modell ist in der Regel die erste Tiermodell gewählt, um diese Parameter zu analysieren. Abbildung 3 ist ein Schema der verschiedenen Schritte erforderlich, um eine neue LAIV bei Mäusen zu charakterisieren. Um die Sicherheit von einem LAIV (Abbildung 3A) zu bewerten, Mäuse sind infizierte i.n. verwenden ein ähnliches Protokoll zu den experimentellen Verfahren im Abschnitt Pathogenese (Abschnitt 4) beschrieben, und das Körpergewicht und überleben Überwachung bieten Informationen in Bezug auf die Morbidität und Mortalität von LAIV (Figuren 2A2 b), darunter die MLD50. Darüber hinaus nach Inokulation mit verschiedenen Impfdosen, die Replikation von LAIV im unteren (Lunge) und der oberen (Nasenschleimhaut) Atemwege sollte bewerteten8,9,10, 11,29 (Abb. 2D). Immunogenität testen, sind Seren von Mäusen mit dem LAIV geimpften vor Herausforderung mit PR8 WT (homologe Challenge), über ähnliche Protokolle zu den beschriebenen im Abschnitt Immunogenität (Kapitel 5) (Abb. 3 b) erfasst. Das Vorhandensein von Total und neutralisierenden Antikörpern im Sera kann durch ELISA und HAI bzw. VNA, bzw. erkannt werden.

Zu guter Letzt um Schutz Wirksamkeit zu testen, LAIV geimpften Mäuse mit PR8 WT gefordert werden und die Wirksamkeit des Schutzes zeichnet sich durch die Überwachung der Morbidität, Mortalität und das Vorhandensein von Herausforderung PR8 WT in der Lunge, wie zuvor beschrieben in Abschnitt 4 ( Abbildung 3)8,9,10,11. Wenn die LAIV Schutz gegen PR8 WT Herausforderung induziert, Mäuse Körpergewicht nicht verlieren, und sie werden die tödliche Herausforderung mit IAV WT überleben. Darüber hinaus IAV WT virale Titer in der Lunge wird nicht erkannt, oder deutlich reduziert werden, im Vergleich zu Mock (PBS) geimpft Mäuse8,9,10,11.

Gewebe-Kultur, Medien und Lösungen Zusammensetzung Lagerung Verwendung Kommentare
Gewebe-Kulturmedien: Dulbecco modifizierten Adlers Medium (DMEM), 10 % fetalen Bovine Serum (FBS), 1 % Penicillin-Streptomycin-L-Glutamin (PSG) (DMEM 10 % FBS 1 % PSG) 445 ml DMEM, 50 ml der FBS und 5 ml 100 x 1 % Penicillin (100 Einheiten/ml)-Streptomycin (100 µg/ml) - L - Glutamin (2 mM) (PSG) Shop bei 4° C Dieses Medium ist für die Wartung der Epithelzellen Madin Darby Canine Kidney (MDCK) verwendet.
Nach der Infektion Medien: DMEM 0,3 % Bovine Albumin (BA), 1 % PSG (DMEM 0,3 % BA 1 PSG) 491 ml DMEM, 4,2 ml 35 % BA und 5 ml 100 X PSG Shop bei 4° C Dieses Medium ist für die Wartung von MDCK-Zellen nach Infektion mit Influenza A-Virus (IAV) verwendet.
10 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (10 X PBS) 80 g NaCl, KCl, 11,5 g Na2HPO4.7H2O, 2 g KH2PO42 g. 7.3 DdH2O bis 1 L. Adjust pH-Wert hinzufügen Lagerung bei Raumtemperatur (RT) Von Autoklaven sterilisieren
1 X PBS 01:10 mit DdH2O 10 X PBS zu verdünnen Shop bei RT Von Autoklaven sterilisieren
Infektion-Medien: 1 X PBS, 0,3 % BA, 1 % Penicillin-Streptomycin (PS) (PBS/BA/PS) 487 ml 1 X PBS steril, 4,2 ml 35 % BA und 5 ml 100 x 1 % Penicillin (100 Einheiten/ml)-Streptomycin (100 µg/ml) (PS) Shop bei 4 ° C Dieses Medium ist für IAV Infektionen verwendet.
Fixierung/Permeabilisierung Lösung: 4 % Formaldehyd, 0,5 % Triton x-100 in 1 X PBS verdünnt 400 mL Neutral gepufferte Formalin 10 %, 5 ml des Triton x-100 und 595 ml 1 X PBS
d > Store bei RT Diese Lösung wird verwendet, um zu beheben und permeabilize MDCK-Zellen in virale Titration Experimente Bereiten Sie die Lösung in einer Dampfhaube zur Vermeidung der Exposition zu Formaldehyd Blockieren Lösung: 2,5 % Bovine Serum Albumin (BSA) mit 1 X PBS-Puffer 2,5 g der BSA in 97,5 mL 1 X PBS Shop bei 4 ° C Diese Lösung dient als eine blockierende Lösung für Immunfluoreszenz-Assays und ELISAs. Sterilisieren Sie durch Filtration mit 0,2 µm-Filter. Antikörperlösung Verdünnung (1 % BSA mit 1 X PBS-Puffer) 1 g der BSA in 99 mL 1 X PBS Shop bei 4 ° C Diese Lösung wird für die Verdünnung von primären und sekundären Antikörper in Immunfluoreszenz-Assays und ELISAs eingesetzt. Sterilisieren Sie durch Filtration mit 0,2 µm-filter 0,1 % Kristallviolett-Lösung 1 g Kristallviolett in 400 ml Methanol. 600 ml DdH2O hinzufügen Shop bei RT Diese Lösung wird verwendet, um zu beheben und Flecken MDCK-Zellen in virale Neutralisation assays Tosylsulfonyl Phenylalanyl Chloromethyl Keton (TPCK)-Trypsin behandelt Bereiten Sie eine 1.000 X Stammlösung 1 mg/ml in DdH2O Shop bei-20 ° C Die TPCK-Trypsin wird bei IAV Infektionen hinzugefügt. 100 µl-Aliquots zu machen RIPA Puffer 10 mM Tris-Cl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 1 % Triton x-100, 0,1 % Natrium Deoxycholate, 0,1 % SDS, 140 mM NaCl Shop bei 4 ° C Diese Lösung wird verwendet, um die Zelle Extrakten machen

Tabelle 1: Gewebe-Kultur, Medien und Lösungen.

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Discussion

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Die Maus-Modell der IAV ist für in Vivo Studien der IAV Pathogenese, Immunogenität und Schutz Wirksamkeit verbreitet. Die geringe Größe von Mäusen macht sie leicht zu bearbeiten und speichern im Vergleich zu anderen Tiermodellen wie Frettchen oder Meerschweinchen. Darüber hinaus erlauben die Leichtigkeit in Bezug auf Tier Kosten, Gehäuse und Reproduktion ihre Verwendung in präklinischen Impfung-Tests in denen großen Anzahl von Tieren erforderlich sind. Vor allem, da Mäuse verwendet wurden mehrere Forschung Disziplinen, mehrere molekulare und Immunologie murinen Reagenzien stehen zur Verfügung, deren Verwendung für IAV Studien zu erleichtern. Darüber hinaus präsentieren die minimale Host Variabilität und das Vorhandensein des immunen Systems, das evolutionär ähnlich ist Menschen machen sie eine robuste kleine Tiermodell für IAV Studien. Schließlich sind die Untersuchung der Host-virales Protein-Interaktionen und ihren Beitrag zur virale Pathogenese derzeit Machbaren durch den Zugriff auf KO-Mäusen. Neben einige Vorteile der Verwendung von Mäusen für IAV Studien, sind sie jedoch nicht nützlich für Untersuchungen zur Übertragung der IAV. Frettchen oder Meerschweinchen sind daher geeigneter Tiermodelle, IAV Übertragung zu studieren. Klinische Symptome bei Mäusen mit IAV infiziert in der Regel erscheinen 2 bis 3 Tage nach der Infektion, obwohl dies je nach der Maus Alter, Immunstatus, Geschlecht, genetische Hintergrund und Belastung variieren; virale Belastung sowie verwendete Dosis. Die Symptome umfassen Anorexie, Lethargie, kauern, gekräuselte Fell, Verlust der Körper Gewicht und Tod16,17.

In diesem Manuskript beschreiben wir wie bewerten virale Pathogenese in Mäusen infiziert i.n. mit IAV durch die Überwachung der Körper Gewichtsverlust (Morbidität), Prozentsatz des Überlebens (Mortalität) und durch die Bewertung der Virusreplikation in der oberen (Nasenschleimhaut) und senken (Lunge) Atemwege (Abbildung 1 und Abbildung 2). Die Pathogenese der IAV ist ein sehr wichtiger Parameter, nicht nur im Zusammenhang mit der neuen IAV Stämme, sondern auch bei der sicheren Umsetzung der LAIV Impfstoffkandidaten (Abbildung 3). Saisonale IAVs und IAVs, die andere Säugetiere (wie Pferde, Hunde oder Schweine) infizieren produzieren nicht in der Regel Anzeichen einer Krankheit bei Mäusen11,27. In diesem Fall ist die Analyse der viralen Titer in der Lunge oder Nasenschleimhaut von infizierten Mäusen die Hauptparameter, virale Pathogenese der IAV-Stämme zu bewerten. Sobald die Lunge und die Nasenschleimhaut gesammelt, sie sind homogenisiert und die Menge an Viren in diesen Organen durch Plaque-Assay, Immunfluoreszenz-Assay analysiert werden kann, Gewebekultur infektiöse Dosis 50 (TCID50) oder eine andere validierte Methode8 ,29. Es wird empfohlen, Bewertung von viralen Titer über indirekte Immunfluoreszenz, da die Plaque-Assay eine größere Menge an MDCK Zellen (6-Well-Plattenformat erfordert) und, wie der TCID50und mehr Zeit (3-4 Tage) erforderlich ist, um virale Titer zu berechnen. Allerdings um die indirekte Immunfluoreszenz-Assay durchzuführen, ist es notwendig, zu haben: 1) primäre spezifische Antikörper gegen ein IAV-Protein (es empfiehlt sich, einen Antikörper gegen die IAV Nucleoprotein, NP, zu verwenden, da es die häufigste virale Protein produziert wird während der viralen Infektion); (2) sekundäre Antikörper konjugiert zu einem Fluorophor; und 3) ein Fluoreszenzmikroskop, fluoreszierende positivere infizierte Zellen zu zählen.

Da das Immunsystem von Mäusen evolutionär, das Immunsystem des Menschen16 ähnelt und Mäusen eine starke und schützende humorale Antwort gegen IAV Infektionen hervorrufen können, kann die Immunogenität von IAVs (oder Impfstoffkandidaten) bewertet durch die Bestimmung insgesamt (ELISA; Abbildung 4) und neutralisieren (HAI, Abbildung 5) oder Antikörperantworten VNA (Abbildung 6). Um die humoralen Reaktionen nach Immunisierung zu analysieren, können Mäuse durch verschiedene anerkannte Methoden wie Retro-Orbital Punktion, Tail Clip, Stammvenen Punktion oder mandibulären Punktion entlüftet werden. Wir entschieden uns für die submandibulären Punktion Technik26 , weil das Verfahren nicht die Verwendung der Anästhesie erfordert und ermöglicht es uns, einen akzeptablen Volumen des Blutes für immunologische Studien zu erhalten; im Gegensatz zu den Retro-Orbital-Punktion ist wo das Blutvolumen in der Regel wiederhergestellt wo Mäuse betäubt werden sollte, und mit der Rute Clip oder Stammvenen Punktion, gering.

In dieser Handschrift beschrieben, wie das Vorhandensein von Antikörpern gegen insgesamt virale Proteine von ELISA mit Virus infiziert Zellextrakte bewerten. Da IAV Infektion induziert eine schützende Immunität vermittelt, vor allem durch Antikörper gegen das virale HA (die wichtigsten Antigene viral-Ziel), empfiehlt es zu beurteilen, die Menge an spezifischen Antikörpern gegen HA durch ELISA mit rekombinanten gereinigten HA induziert Proteine-10. Um das Vorhandensein von neutralisierenden Antikörpern zu analysieren, HAI und VNA Methoden werden akzeptiert, aber beide haben vor- und Nachteile. Der HAI ist schnell (ca. 2-3 h) und genehmigt durch das Center for Disease und Control (CDC), das Vorhandensein von IAV neutralisierende Antikörper30zu bewerten. Die VNA ist mehr Zeit in Anspruch nehmen (ca. 3-4 Tage) aber ist genauer, da es nur Antikörper bewertet, die Virusinfektion neutralisieren kann. Vor allem die VNA nachweislich Stiel-reaktives neutralisierende Antikörper31sowie NA neutralisierende Antikörper32HA zu erkennen. Ein weiterer Vorteil der VNA ist der Assay-Empfindlichkeit, da weniger IAV (200 FFU) braucht man im Vergleich zu den HAU-Assay, der ca. 10 ~4-105 FFU erfordert. Darüber hinaus kann der HAI-Test zur Erkennung von neutralisierenden Antikörpern gegen Vogelgrippe IAVs aufgrund von Schwierigkeiten mit der Interpretation der Ergebnisse33,34,35problematisch sein. Darüber hinaus erfordert VNA nicht die Verwendung von Erythrozyten zur Identifizierung von neutralisierenden Antikörpern Influenza.

Schließlich beschreiben wir die experimentellen Verfahren um die drei wichtigsten Aspekte zu bewerten, die bei der Entwicklung neuer Impfstoffe IAV (Abbildung 3) berücksichtigt werden müssen: 1) Sicherheit: die Impfung muss sicher und nicht produzieren Krankheit; (2) Immunogenität: der Impfstoff muss immunogen und induzieren humorale und zelluläre schützende Antworten; (3) Schutz Wirksamkeit: der Impfstoff muss Schutz vor Herausforderung mit WT homologe und heterologe Viren induzieren. Die Maus-Modell ist eine gute Wahl für das erste screening eines neuen IAV Impfstoff in Vivo , weil es diverse Impfung Systeme bewerten kann und Bedingungen, einschließlich verschiedene Adjuvantien, Antigen/Impfdosis, Verwaltung und umfassenden Schutz verwenden gegen die Herausforderung mit Homologen oder heterologe IAVs Stämme16,17. Jedoch sollten Impfstoffkandidaten bevor Sie fortfahren zu klinischen Studien am Menschen, zumindest in einem zweiten in Vivo Modell getestet werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Forschung auf Influenza-Virus im LM-S Labor wird teilweise von The New York Influenza Center of Excellence (GEMON), ein Mitglied des NIAID Centers of Excellence für Influenza-Forschung und Überwachung (CEIRS) finanziert. Wir danken für ihre Unterstützung bei der Korrektur des Manuskripts Wendy Bates.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells ATCC CCL-34
Six- to eight-week-old female C57BL/6 mice National Cancer Institute (NCI) 01XBE
Turckey red blod cells Biolink Inc Store at 4 °C
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Corning Cellgro 15-013-CV Store at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1500-050 Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x Corning 30-009-CI Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x Corning 30-00-CI Store at -20 °C
Bovin Albumin solution (BA) Sigma-Aldrich A7409 Store at 4 °C
Bovin Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9647 Store at 4 °C
Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin Sigma-Aldrich T8802 Store at -20 °C
Neutral Buffered Formalin 10% EMD 65346-85 Store at RT
Triton X-100 J.T.Baker X198-07 Store at RT
Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 ATTC H16-L10-4R5 Store at -20 °C
Polyclonal rabbit anti-mouse immunoglobulins/FITC Dako F0261 Store at 4 °C
ECL Anti-mouse IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody GE Healthcare LNA931V/AG Store at 4 °C
TMB substrate set BioLegend 421101 Store at 4 °C
Vmax Kinetic plate reader Molecular Devices
Dounce Tissue Grinders Thomas Scientific 7722-7
Receptor destroying enzyme, RDE (II) Denka Seiken Co. 370013 Store at -20 °C
Crystal Violet Fisher Scienctific C581-100 Store at RT
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 655-180
Cell Culture dishes 100 mm Greiner Bio-one 664-160
Nunc MicroWell 96-Well Microplates Thermo Fisher Scienctific 269620
Nunc 96-Well Polystyrene Conical Bottom MicroWell Plates Thermo Fisher Scienctific 249570
Puralub Vet Ointment Dechra 9N-76855
Fluorescent microscope Olympus Olympus IX81

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References

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Influenza-A-Virus-Studien in einem Mausmodell der Infektion
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Rodriguez, L., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (127), e55898, doi:10.3791/55898 (2017).More

Rodriguez, L., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (127), e55898, doi:10.3791/55898 (2017).

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