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Immunology and Infection

감염 마우스 모델에서 인플루엔자 A 바이러스 연구

doi: 10.3791/55898 Published: September 7, 2017

Summary

인플루엔자 A 바이러스 (IAVs)는 중요 한 인간의 호흡기 병원 균. IAVs pathogenicity 이해 하 고 새로운 백신 접근의 전 임상 시험 수행 인간의 생리를 흉내 낸 동물 모델은 필요. 여기, 우리가 IAV pathogenesis, 체액 성 반응과 감염 마우스 모델을 사용 하 여 백신 효능을 평가 하는 기법을 설명 합니다.

Abstract

인플루엔자 바이러스 500000 이상의 죽음 전세계1 원인과 관련 된 직접 의료 및 입원 비용 및 직장 결근2를 고려 하 고 혼자 미국에서 십억 12-14 달러의 연간 비용. 동물 모델은 바이러스 성 병 인, 호스트 병원 체 상호 작용, 면역 반응, 평가에 독감 바이러스 (IAV) 연구에 중요 한 그리고 현재 및 새로운 백신의 효능 antivirals 뿐만 아니라 접근. 마우스 유리 작은 동물 모델 때문에 그들의 면역 시스템은 진화론 인간에서 발견 비슷합니다, 그들은 유전으로 동일한 과목으로 상용 공급 업체에서 사용할 수 있습니다, 그리고 평가에 악용 될 수 있는 여러 변종이 있다 감염, 유전으로 그리고 그들은 상대적으로 저렴 하 고 조작 하기 쉬운. 기도 통해 인간 IAV 감염 정리를 마우스는 먼저 적절 한 biosafety 제약 아래 감염 IAVs와 intranasal 접종 전에 마 취. 감염 후 IAVs의 병 인 (몸 무게 손실) 병 적 상태와 사망률 (생존) 매일 모니터링 하 여 결정 됩니다. 또한, 바이러스 성 병 인도 위 (비 강 점 막) 또는 감염 된 쥐의 낮은 (폐) 호흡기 바이러스 복제를 평가 하 여 평가할 수 있습니다. IAV 감염 시 체액 응답 비-침략 적 출혈 및 이차 항 체 검출에 의해 급속 하 게 평가 될 수 분석 실험 목적 총의 존재를 검출 하거나 항 체를 중화. 여기, 우리는 일반적인 방법을 설명 intranasally 생쥐를 감염 하는 데 사용 (도)와 IAV pathogenesis, 체액 성 면역 반응 및 보호 효능 평가.

Introduction

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IAVs 엔벌로프된 바이러스 Orthomyxoviridae 가족3으로 분류 되는. 그들은 부정적인 극성3와 8 개의 단일 가닥 RNA 분자를 포함. 인간에서는, IAVs 소설은 바이러스가 인간의 인구4에 소개 될 때 계절 전염병과 중요 한 결과의 가끔 전염병 발생할. 또한, 계절 IAVs 매우 고 빠르게 전송 됩니다 모든 년2,5는 높은 경제 손실 전세계 생산 인간 사이. IAV 증상은 기침, 코 막힘, 발열, 불쾌, 두통, 거식 증과 근육 통, 하지만 바이러스 또한 immunocompromised 환자6에서 더 심각한 질병을 일으킬 수 있다. 사실, 세계 보건 기구 (WHO)는 계절 독감 바이러스 원인 300000-500, 000 명 전세계 모든 년1계산 합니다. 현재 인플루엔자 예방 및 인 간에 있는 치료에 대 한 식품의 약 청 (FDA)에 의해 승인 된 약물의 두 종류가 있다: 응집 (나) 저 해제 (예를 들어, oseltamivir) 및 차단제 (, M2 이온 채널의 소나); 그러나, 약물 내성 바이러스 변종의 출현은 증가 한 관심사 이다. 예방 접종, 따라서 IAVs 감염 으로부터 인간을 보호 하기 위해 최상의 의료 옵션을 남아 있다. 날짜 하려면, 세 가지 유형의 독감 백신 인간의 사용을 위한 FDA에 의해 허가 사용할 수 있습니다: 재조합 형 바이러스 성 조류 (HA) 단백질 백신을 inactivated 인플루엔자 백신 (IIV), 그리고 라이브-감쇠 인플루엔자 백신 (LAIV)5, 7. 3 백신 바이러스 HA 단백질, IAVs에 대하여 항 체를 중화의 주요 대상에 대 한 적합 한 면역 반응을 유도 하도록 설계 되었습니다.

IAV 감염에서 vivo에서 공부 하는 검증 된 마우스 모델

동물 모델 공부 하 고, 다른 사람, 사이 IAV pathogenesis8,,910,11, 바이러스 성 요인 질병12 또는 바이러스 성 전송13에 기여 하는 데 사용 되었습니다. ,14,9,,1015마약 새로운 백신 또는 항 바이러스 효능을 테스트 하 고. 마우스 (생쥐)는 여러 가지 이유로 IAV 연구를 위한 가장 광범위 하 게 사용 된 동물 모델: 1) 면역 체계가 비슷합니다 진화론 인간;에 존재 하는 2) 저렴 한 비용, 등 동물 구입, 주택 및 재생산; 쉽게 조작 하 고 저장; 3) 작은 크기 균질 응답 및 결과; 4) 최소한의 호스트 가변성 5) 마우스 생물학, 게놈 시퀀스;를 포함 하 여 큰 지식 6) 많은 사용 가능한 분자 생물학 및 면역학 시 약; 7) 사용할 수 노크 바이러스 성 감염;에 주어진된 호스트 단백질의 기여 공부 하 (KO) 마우스 그리고, 8) 감염의 유전 기초를 평가 하기 위해 악용 될 수 있는 여러 마우스 긴장.

여러 마우스 긴장 IAV에서 vivo에서현재 사용할 수 있습니다. 나이, 면역 상태, 섹스, 유전 배경 및 마우스 긴장으로 감염, 복용량 및 바이러스 성 긴장의 쥐에서 IAV 감염의 결과 영향. IAV 연구에 사용 되는 가장 일반적인 마우스 긴장은 BALB/C 그리고, 최근에, DBA.2 마우스 C57BL/6, 그들은 두 전 긴장16,,1718, 보다 IAV 질병에 더 취약 19 , 20. 중요 한 것은, 면역 반응 또한 다를 수 있습니다 마우스 스트레인18,,1920에 따라. 따라서, 매우 IAV 스트레인 실시 하는 실험에 대 한 최상의 옵션을 선택 하 고 마우스에 대 한 사용 가능한 모든 정보를 복구 하는 것이 중요 하다.

마우스 IAV vivo에서 공부에 대 한 감염의 좋은 동물 모델 이지만, 그들은 실험적인 디자인에서 고려해 야 할 몇 가지 제한이 있다. 예를 들어, vivo에서 학문에 대 한 마우스를 사용 하 여의 주요 한계는 IAVs 쥐 중 전송 하지 않습니다. 따라서, 전송에 대 한 연구, 더 허용 동물 모델 (예를 들면, 흰 족제비 또는 기니 피그)는 사용된16,,1721. 또한, 쥐에서 IAV의 발현과 인간 간의 몇 가지 차이점이 있다. 인간과 달리 쥐 IAV 감염; 시 발열 개발 하지 않습니다. 반대로 그들은 저체온증16,17제시. 쥐, IAV 복제 위 항공 보다 더 낮은 호흡 기관 (폐)에 집중. 따라서, 생쥐에서 IAV의 독성은 인간에서 본을 항상 상관 하지. 전부, 장점 보다는 제한 된 단점 큽니다, 때문에 마우스 인플루엔자 바이러스 성 병 인, immunogenicity 백신과 항 바이러스 연구에 보호 효능을 평가 하는 데 사용 하는 첫 번째 동물 모델을 나타냅니다. 또한, 그것은 윤리적으로 IAV IAV 감염의 작은 동물 모델에서 이전 증거 없이 큰 동물 모델을 사용 하 여 함께 연구를 수행 허용 되지 않을 것 이다. 이 원고에서 intranasally 생쥐를 감염 하는 방법 설명 (i.n.) IAV, 심각도 및 바이러스 성 감염의 진행 상황을 모니터링 하는 방법 및 체액 성 면역 반응 및 보호 효능을 평가 하는 데 필요한 실험을 수행 하는 방법.

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Protocol

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여기에 설명 된 모든 동물 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)와 로체스터의과 및 치과 대학에서 기관 Biosafety 위원회 (IBC)에 의해 승인 및 준수 와 관리 및 국가 연구 위원회 22의 실험실 동물의 사용을 위해 가이드에 있는 권장 사항. 시설 및 물고기 및 사단의 실험실 동물 약의의 대학 및 치과의 프로그램 AAALAC 국제 공인 하 고 주법, 연방 법령 및 국립 보건원 (NIH) 정책을 준수 합니다. 비슷한 요구 사항이이 원고에 설명 된 동물 프로토콜을 준수 하는 각 기관에 적용 한다.

1. 작은 척 추가 있는 동물 사용의

참고: 적절 한 개인 보호 장비 (PPE)는 마우스 작업에 필요한. 최소 요구 사항을 포함 머리 모자, 마스크와 장갑, 신발 커버, 일회용 작업복.

  1. IACUC 프로토콜에 따라 케이지 당 5 마우스의 최대 배치. 죽은 동물을 안락사 (두 번째는 물리적 방법 이어야 함)의 두 가지 방법으로 마우스를 안락사 IACUC 프로토콜 다음.
    참고: IAV는 병 적 상태와 사망률 평가 실험에서 초기 체중의 20%를 잃은 마우스 실험 끝점에 도달 했습니다 간주 됐다 그리고 CO 2, 그리고 자 궁 경부 전위로 안락사 했다는 실제 보조 방법입니다. 몸 무게의이 비율은 다른 기관에서 달라질 수 있습니다. 쥐 폐와 비 강 점 막 IAV 감염 후 수집 됩니다 절차에서 마우스 2,2,2-tribromoethanol (TBE)의 치명적인 복용량으로 안락사 그리고 물리적 보조 방법으로 정 맥은 키 모 잘라서. 여성 6 하-8-1 주일-오래 된 C57BL/6 마우스 구입 하 고 특정 병원 체 자유로운 조건에서 로체스터의과 및 치과 대학에서 동물 보호 시설에서 유지 했다.

2. Biosafety

참고:이 보고서에서 IAVs 생쥐를 감염 하는 데 사용 되는 A/Puerto 토 리코/8/34 H1N1 인플루엔자 (PR8 WT) 22 , 23의 일반적인 마우스 적응 실험실 긴장 고 온도 민감한 LAIV 변형, PR8 LAIV 8. IAV 감염 (생체 외에서 또는 vivo에서), 세포 배양 및 생물 안전 캐비닛 biosafety 수준 (BSL)-2 아래에서 생물 학적 샘플을 포함 하는 모든 절차를 수행 조건. 높은 악성 IAV 긴장 사용 하는 경우 다른 BSL 정장 또는 제약 조건 활용.

  • 클린 biosafety 염소 이산화 살 균 제 전과이 원고에 설명 된 모든 실험 절차를 수행한 후 캐비닛
      . 적절 한 IBC 권장 사용 전후 모든 해 부 자료 (가 위, 메스 및 해 부 겸)과 Dounce 균질 화기를 소독. 적절 한 IBC와 IACUC 지침에 따라 절차 동안 생산 하는 모든 자료 삭제.

    3. Intranasal 감염

    특정 병원 체 자유로운 조건에서
    1. 장소 여성 6 하-8-1 주일-오래 된 C57BL/6 쥐. 구성 하 고 레이블을 마우스 바이러스와 복용량 사용 감 금 소. 쥐 귀 펀치 코드를 사용 하 여 각 장에 또는 꼬리의 그림 같은 다른 승인 된 방법으로 식별 합니다. 케이지 당 최대 5 마우스를 놓습니다.
    2. 준비 IAV의 희석 (형광 형성 단위 (: FFU) / 마우스) 30 µ L/살 균 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x에서 마우스의 전체 볼륨에 무 균 조건 하에서. 얼음에 바이러스 inoculum을 유지 합니다. 수식으로 바이러스 성 희석에서 추가할 IAV의 양을 계산: ((X: FFU 마우스 당/30 µ L) 마지막 볼륨 x) / 주가 바이러스 titer.
    3. 규모와 마우스 무게 고 각 마우스 (0 일)의 무게를 기록 합니다. 검지 손가락과 엄지손가락 사이의 목의 아저씨에 의해 그것을 선택 하 여 등 쪽 위치에 마우스를 잡아. 핑 키 손가락으로 손을 대 한 꼬리를 잡고.
    4. Anesthetize 마우스 intraperitoneally (i.p.) 240-250 mg/kg의 복 부의 오른쪽 꼬리 2/3에 바늘을 삽입 하 여 TBE와. 바늘을 철수 하기 전에 잠시 일시 중지 합니다. 마우스 케이지를 반환 하 고 5 분을 기다려
    5. 는 마우스 마 취 동안 건조를 방지 하기 위해 눈에 불 임 안과 연 고를 적용 합니다. 마우스 (, 발가락 핀치) 페달 철수 반사의 부족에 의해 anesthetized 경우 확인 하십시오. 마우스는 완전히 취 하지 하는 경우에, 그들은 바이러스 기침 것.
    6. 마우스 완전히 마 취 때 등 recumbency에 마우스를 놓습니다. 피펫으로 팁 바이러스 inoculum는 콧구멍에 천천히의 30 µ L를 포함 하지만 지속적으로 솔루션을 추출. 마우스는 사라지고 드롭 inoculum을 관찰 하 여 준비를 흡입는 다는 것을 반드시.
    7. 는 TBE 온도 호흡 속도 눌러 수 마우스는 호흡을 확인 합니다. 케이지 등 recumbency에 배치 하는 동물을 반환 합니다. 호흡 곤란의 어떤 표시 든 지에 대 한 마우스를 모니터 하 고, 관찰 하는 경우 도움이 마우스를 수직으로 들고 동물에 의해 호흡 및 호흡 24 구동 영향을 유발. 그것은 의식 (30-45 분 그것은 마 취 후)을 차릴 때까지 마우스를 모니터.

    4. 바이러스 성 병 인 ( 그림 1)의 특성화

    1. 병 적 상태와 사망률 ( 그림 1 그림 2)의 평가
      1. 감염 i.n. 여성 6 하-8-1 주일-오래 된 C57BL/6 마우스의 3-4 그룹 (그룹, n 당 적어도 5 쥐 = 5) 사진 복용과 함께 (10, 10 2, 10 3, 10 4: FFU/마우스) PR8 WT 섹션 3에에서 설명 된 대로의.
      2. 모니터 약 음식 섭취에 따른 체중 변화를 최소화 하기 위해 동시에 앞으로 14 일 동안 규모와 마우스의 무게. 섹션 1에에서 설명 된 대로 그들의 초기 체중의 20%를 잃고 쥐를 안락사.
      3. 14 일 후 제 1에에서 설명 된 대로 바이러스 성 감염을 살아 나는 마우스를 안락사.
      4. 바이러스 50% 마우스 치 사 량 (MLD 50) 리드와 Muench 25의 메서드를 사용 하 여 얻은 생존 데이터에 따라 계산 합니다. 첫째, 계산 비율 거리 (PD):
        Equation 1
        1. 다음, 다음 수식을 MLD 50 계산:
          Equation 2
    2. 폐와 비 강 점 막 바이러스 titers의 평가 ( 그림 1 그림 2. )
      1. 폐와 비 강 점 막
          복구
        1. i.n. 여성 6 하-8-1 주일-오래 된 C57BL/6 쥐 감염 (n = 6) 10-10 4: FFU PR8 WT 섹션 3에에서 설명 된 대로 테스트 바이러스 성 복용량.
        2. 수집 마우스 폐와 비 강 점 막 일 2 (n = 3) 4 (n = 3).
          1. TBE (500mg/kg)의 치명적인 복용량 (i.p.) 마우스를 안락사. 등 쪽 recumbency에서 동물을 놓고 70% 에탄올과 흉부를 통해 모피를 소독 합니다. 복 부의 기지에 흉 골에서 메스와 함께 피부를 잘라. 가 위 쥐의 측면 부분에 절 개의 기지에서 1 cm 삭감 만들기.
          2. 보조 안락사 방법으로 마우스 피가 위로 간 정 맥을 잘라. 복 부 위치에 동물을 배치 하 고 밖으로 배출 하는 혈액을 있도록 2 분 기다립니다. 이 단계는 폐에 혈액을 줄이기 위해 중요 하다.
          3. 는 마우스 등 머리의 전체 상단 부분에서 첫 번째 절 개 집게와가 위를 해 부의 도움으로 만든 되었다 복 부의 피부를 제거 합니다. 머리는가 위로 잘라내어 건조 멸 균 페 트리 접시에.
          4. 는 maxilla는 mandible 사이 접합은가 위로 잘라 고는 mandible 삭제. 가 위, zygomatic 호 끝에 두 컷 확인 하 고 그들을 제거 합니다. 해 겸의 도움으로 눈 제거.
          5. 해 집게와는 두개골을 보유 하 고 메스와 화살 봉합을 따라 두개골을 잘라. 비 강 점 막 보고 뇌와 두개골의 두 반쪽을 들어올립니다. 비 강 mucosas 코, maxilla, 팔 라틴, zygomatic, 두개골의 앞쪽 뼈와 사 골 뼈에 의해 포위 된다.
          6. 메스를 사용 하 여 뇌와 두개골의 부분 잘라내어 버리고. 장소는 무 균 튜브에 비 강 점 막과 두개골의 다른 부분. 샘플 처리 같은 날, 또는 경우 그들을 신속 하 게 동결 드라이 아이스에는 샘플 것입니다 나중에 처리할 경우 얼음 (4 ° C)에 튜브를 저장.
          7. 샘플의 오염을 피하기 위해, 청소 하 고 소독 해 도구 각 조직 복구, 염소 이산화 살 균 제와 함께 각 동물 해 부.
          8. 폐 수집 등 recumbency에서 동물 놓고 늑은가 위로 잘라. 흉 골의 양쪽에서 1 cm에서 갈비뼈를 절단 하 여 흉 곽을 엽니다. 할 우수한 부분에 흉 곽의 기지에서 상처는가 위.
          9. 흉 곽의 우수한 부분에 두 개의 절 사이 위 크로스 섹션을 만들고 가슴 판 제거. 폐는 집게와 함께, (바로 전에 폐) 기관지의 끝에는 위로 잘라 누른 폐 무 균 튜브에 넣어. 샘플 처리 같은 날, 또는 경우 그들을 신속 하 게 동결 드라이 아이스에는 샘플 것입니다 나중에 처리할 경우 얼음 (4 ° C)에 튜브를 저장.
            참고: 그들은 수집 하 고, 같은 날에 조직 샘플을 균질 하 고 바이러스 titers을 나중에 분석 하기-80 ° C에 저장 합니다. 그 샘플 안 받아야 반복된 동결-해 동 주기 전에 바이러스 titers 결정이 중요 하다. 그들은 처리 될 때까지 또는-80 ° C에서 조직 샘플을 저장.
      2. 폐와 비 강 점 막의 균질
        1. 폐 또는 비 강 점 막 살 균 Dounce 균질 화기에 놓고 감기 감염 미디어의 1 mL을 추가. 폐는 완전히 중단 될 때까지 실 온 (RT)에서 약 1 분 동안은 유 봉을 아래로 이동 하 여 샘플을 균질. 4 무 균 튜브에 게 무 균된 샘플을 넣어 ° C. 사용 각 샘플에 대 한 새로운 Dounce 균질 화기.
        2. 원심 실시간 수집 새로운 무 균 튜브에 상쾌한에 5-10 분에 대 한 300 x g에서 샘플. 바이러스 성 적정 같은 날에 수행 되는 경우 4 ° C에서 상쾌한을 저장 하 고 삭제는 펠 릿. 또는, 바이러스 titers을 나중에 평가를 (-80 ° C)는 무 균의 상쾌한 샘플을 동결.
      3. 간접 면역 형광 검사 하 여 바이러스 적정
        1. 적정, 전날 씨앗 96 잘 접시 Madin-다 비 개 신장 (MDCK) 상피 세포 (4 x 10 4 셀/잘) 조직 문화 미디어 합류 점 ~ 80-90%에 도달. 5% CO 2와 37 ° C 배양 기에서 세포를 놓습니다. 바이러스 성 적정 하루 확인 바이러스 성 감염을 시작 하기 전에 단층을 확인 하려면 현미경 셀.
        2. 준비 1시 10분 희석 96 잘 접시에 감염 미디어에서 무 균된 샘플 (폐 또는 비 강 점 막)의 상쾌한의. Triplicates 바이러스 titers을 정확 하 게 확인 하 여 바이러스 성 적정을 수행 합니다.
        3. 96 잘 접시에 우물의 각 감염 미디어의 추가 90 µ L
            . 웰 스 3 중에 각 샘플의 바이러스 titer를 평가 하는 A1, A2, a 3에 무 균된 샘플의 상쾌한 중의 10 µ L를 추가 합니다. A4, A5 및 A6 웰 스에 무 균된 샘플의 또 다른 상쾌한의 10 µ L를 추가 합니다. 샘플의 나머지 부분으로 연속적으로 동일한 희석 수행.
          1. 추가한 후에 표면에 뜨는 샘플 행 A,를 사용 하 여 멀티 채널 피펫으로 아래로 pipetting으로 혼합. 10 µ L에서에서 전송 행 A 행 B. 변경 팁 희석 사이 섞어 잘. 마지막 행 (H)를 도달할 때까지이 반복 합니다.
        4. 조직 문화 매체 (단계 4.2.3.1) 제거 96 잘 접시와 100 µ L/1 x PBS의 우물으로 두 번 세척에서 MDCK 셀에서 진공 흡 인기 멀티 채널 어댑터를 사용 하 여.
        5. 전송 50 µ L/잘 MDCK와 96 잘 접시에 무 균된 샘플의 순차적으로 희석된 상쾌한의 셀. 더 높은 희석 (행 H) 낮은 희석 (A 행) 전송 시작. 이 경우에, 그것은 다른 행 사이의 팁을 변경 필요가 없습니다.
        6. 바이러스 흡착 수 있도록 RT에 1 시간을 위한 락 플랫폼에 96 잘 접시를 넣어. 바이러스 흡착 후 inoculum 진공 흡 인기 멀티 채널 어댑터를 사용 하 여 제거 하 고 감염 된 후 미디어의 100 µ L/잘 추가 합니다. 8 h 5% CO 2와 33 ° C 또는 37 ° C 배양 기에 감염 된 세포를 품 어. 4.2.3.6 단계에서 설명한 대로 수정, 얼룩, 이미징, 및 바이러스 titer 계산 진행 – 4.2.3.12.
        7. 진공 흡 인기 멀티 채널 어댑터를 사용 하 여 96 잘 접시에서 조직 문화 매체를 제거 합니다. 수정 하 고 실시간에 20 분에 대 한 고정/permeabilization 솔루션의 100 µ L/잘 세포를 permeabilize
          주의:를 사용 하 여 고정/permeabilization 솔루션 증기 두건에서 포름알데히드 노출 방지.
        8. 진공 흡 인기 멀티 채널 어댑터를 사용 하 여 고정/permeabilization 솔루션을 제거, 1 x PBS로 세척 및 차단 솔루션 실시간 점에서 1 시간에 대 한 차단 솔루션 4 ° C에서에 셀 고정된 셀을 품 어 또는 다음 단계를 수행 하십시오.
        9. 차단 솔루션을 제거합니다. 추가 1 µ g/mL 단일 클론 항 체 (mAb) 안티-NP HB의 50 µ L/잘-65 항 체 희석 용액에 희석. 1 h 37 ° C. 다른 mAb 또는 polyclon에서 품 어알 항 체 (pAb) 안티-p r 8을 사용할 수 있습니다.
        10. 한편, 희석 1: 200 fluorescein isothiocyanate (FITC)-항 체 희석 솔루션에서 활용된 보조 반대로 마우스 항 체. 실시간에서 5-10 분 동안 1700 x g에서 솔루션을 원심 다른 fluorophores 함께 활용 된 다른 이차 항 체 사용 될 수 있다.
        11. 1 차적인 항 체를 제거 하 고 3 번 1 x PBS의 100 µ L/잘 씻어. 이차 항 체 희석의 50 µ L/잘 추가 하 고 37 ° C. 제거 이차 항 체 및 세척 3 번 100 µ L/1 x PBS의 우물에서 30-45 분 동안 품 어. 마지막 세척 접시에 두고.
        12. 긍정적인 스테인드 (녹색) 셀의 수를 결정 하기 위해 형광 현미경으로 세포를 관찰 합니다. 바이러스 titer: FFU/mL를 계산 하 여 계산 합니다. 표현: FFU/mL 희석에서 30-50 긍정적인 스테인드 셀 수식을 사용 하 여 바이러스 titer 계산: ((n1 + n2 + n3) / 3) x 20 x 1/희석.

    5. 체액 성 면역 반응 ( 그림 3)의 평가

    1. 감염 여성 6 하-8-1 주일-오래 된 C57BL/6 마우스의 i.n. 3 그룹 (n = 5) 다른 복용량과 (10 2, 10 3, 그리고 10 4: FFU / 마우스) PR8 LAIV의 모의 감염 한 그룹 (n = 5) 부정적인 제어로 살 균 PBS x 1. 도 마우스 감염 섹션 3에에서 설명 된 대로 수행.
      1. 마우스 submandibular 펑크
        1. 14 일에 의해 예방 접종, 후 출혈 쥐 혈액 submandibular 출혈 사용 하 여 수집을 4mm 랜 싯 26 또는 다른 IACUC를 사용 하 여 승인 방법.
        2. 잡고 검지와 엄지 사이 목의 아저씨에 의해 그것을 선택 하 여 마우스
            . 핑 키 손가락 마우스 무력화와 손을 대 한 꼬리를 잡고.
          1. 뺨을 볼 수 있는 측면 위치에 마우스를 넣어. 경 정 맥으로 복고풍 궤도 submandibular 혈관의 시점에는 펑크를 확인 합니다. 바소 (4 m m)를 침 몰 하 고 무 균 튜브에 혈액을 복구 (약 0.2-0.4 mL/마우스 복구). 몇 초 동안 메 마른 냅킨으로 빵 꾸에 압력을 적용 합니다. 감 금 소에 다시 마우스를 놓습니다.
        3. 37 ° C에서 1-2 h에 대 한 튜브를 넣은 다음 혈액에서 혈 청을 분리 하는 RT에 30 분 동안 700 x g에서 원심. 새로운 무 균 튜브에 피펫으로와 혈 청의 구성 된 상위 계층을 전송 합니다. 적혈구 (Rbc)의 펠 릿을 삭제 합니다. -20에서 혈 청을 저장 ° c.
    2. 바이러스 성 단백질에 대 한 총 항 체의 분석
      1. 감염 MDCK 셀 추출 물 준비
        1. 감염, 전날 씨앗 10 6 MDCK 셀 (~ 80-90에 도달 x 4-5와 함께 한 100 mm 접시 % 합류 다음날) 조직 문화 매체에서. 5% CO 2와 37 ° C 배양 기에서 세포를 놓습니다. 바이러스 성 감염의 바이러스 성 감염을 시작 하기 전에 단층을 확인 하려면 현미경 세포 확인.
        2. 4 mL 총 최종 볼륨에서 감염 미디어에서 PR8 WT의 감염 (MOI)의 낮은 (0.001) 다양성을 가진 바이러스 성 희석을 준비합니다. 수식으로 PR8 WT의 양을 계산 ((n ° 셀 x 나 X) 최종 볼륨 x) / 주가 바이러스 titer.
        3. 는 MDCK 셀 접시에서 조직 문화 매체를 발음 하 고 1x PBS의 4 mL로 두 번 씻어. 바이러스 성 inoculum (4 mL)을 추가 하 고 바이러스 흡착 수 있도록 RT에 1 시간을 위한 락 플랫폼에 접시를 넣어. 진공 바이러스 inoculum을 제거 하 고 TPCK 취급 trypsin의 1 µ g/mL를 포함 하는 감염 된 후 미디어의 8-10 mL을 추가. 5% CO 2와 33 ° C 또는 37 ° C 배양 기에서 48-72 h에 대 한 감염 된 세포를 품 어.
        4. 셀 스 크레이 퍼의 도움으로 세포를 분리 하 고 세포와 조직 문화 매체와 15 mL 튜브에 피펫으로 수집. 실시간 Aspirate는 상쾌한에 5-10 분에 대 한 400 x g에서 튜브 원심 RIPA 버퍼의 1 mL에 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 믹스 1.5 mL 무 균 튜브에 넣어. 20-30 분에 대 한 얼음에 품 어
        5. 원심 분리기 1300 x g에서 튜브 4에서 20-30 분에 대 한 ° C. 신중 하 게, 복구는 상쾌한. 게 셀-20에서 100 µ L aliquots에서 추출 ° c.
        6. 적정 셀 추출 물 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 항 체 9 , , 10 11의 존재에 대 한 그들을 평가 하기 전에 설명 된 대로 , 27. 포함 셀 부정적인 제어로 모의 감염 MDCK 셀 (위에 표시 된 대로 준비)에서 추출.
      2. ELISA ( 그림 4)
        1. 96 잘 접시 감염 MDCK 세포의 적절 한 희석 (1: 200-1:1, 000) 사이 보통 1 x PBS에서 추출 하는 폴리스 티 렌 코트. 부정적인 통제로 모의 감염 MDCK 셀 추출의 동일한 희석와 또 다른 접시를 코트. 품 어 오버 나이트 (O/N) 4 ° c.
        2. 는 상쾌한 진공 흡 인기 멀티 채널 어댑터를 사용 하 여 제거 하 고 멀티 채널 피펫으로와 1 x PBS의 100 µ L/잘 한 번 세척. 비 특정 바인딩 추가 100 µ L/잘 실시간에서 1 시간에 대 한 솔루션을 차단 하 여 차단
        3. 한편, 96 잘 접시에 항 체 희석 솔루션에서 단계 5.1에서에서 감염 각 마우스에서는 세라의 2-fold 직렬 희석 (희석 1시 50분 시작)을 확인.
        4. 진공 흡 인기 멀티 채널 어댑터를 사용 하 여 폴리스 티 렌 96 잘 접시에서 차단 솔루션을 제거 합니다. 적절 한 잘 각 마우스 혈 청 희석의 50 µ L을 추가 하 고 37에서 1 시간을 품 어 ° c.
        5. 진공 흡 인기 멀티 채널 어댑터와 마우스 세라를 제거합니다. 증류수 사용 하 여 멀티 채널 피펫으로 우물 3 번 씻어. 반대로 마우스 2 차 항 체 항 체 희석 솔루션에 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 희석 1:2,000와 활용의 50 µ L/잘 추가 합니다. 37 ° c.에 1 시간을 품 어
        6. 진공 흡 인기 멀티 채널 어댑터와 이차 항 체를 제거합니다. 증류수 사용 하 여 멀티 채널 피펫으로 우물 3 번 씻어. 1:1 솔루션 A와 B. 추가 100 µ L/기판의 잘 혼합 하 여 tetramethylbenzidine (TMB) 기판 솔루션을 준비 하 고 어둠 속에서 RT에서 5-10 분 동안 품 어.
        7. 그래서 100 µ L/잘 0.2 N H 2를 추가 하 여 반응을 중지 4. 450에 번호판을 읽기는 ELISA 플레이트 리더에 nm.
        8. 각 희석 MDCK 모의 감염 96 잘 접시의 MDCK 감염 96 잘 접시에서 얻은 값에서에서 얻은 값을 뺍니다. 다른 세라와 각 희석에 대 한 평균 값을 계산 하 고 표준 편차 (SD)를 보여주는 그래프에서 그들을 대표.
    3. 중화 항 체의 분석
      1. Hemagglutination 억제 (하이) 분석 결과 ( 그림 5)
        1. 하이 분석 결과 수행 하기 전에 치료 수용 체와 마우스 세라 파괴 효소 (RDE) 혈 청에 존재 하는 모든 일반적인 억제제를 제거 하. 4 양의 RDE 작업 희석에 마우스 혈 청의 1 볼륨을 추가 (혈 청 희석이 지금 1:5). O/N (12-품 어 18 h) 37 ° C 물 목욕에서.
        2. 는 RDE 비활성화를 30 분 동안 56 ° C에서 혈 청 샘플 열.
        3. 미리 표준 하 분석 결과 28 여 PR8 WT의 hemagglutination 활동 (HAU)을 결정합니다. 바이러스 HAU 결정 되 면 1 x PBS에서 50 µ L 당 8 HAU에 바이러스 성 재고 희석.
        4. 2-fold 직렬 희석 (12 희석) 96-잘 V-하단 플레이트에 세라 RDE 치료의 준비. (예를 들어, A12로 A1) 각 혈 청 샘플에 대 한 한 행을 사용 합니다. A 1에서
          1. 1 x의 추가 25 µ L PBS A12 웰 스 한 행에 각 혈 청 샘플을 테스트 합니다. 열 (A1)의 첫 번째 잘 1 x PBS의 25 µ L를 RDE 취급 세라 (1:5)의 25 µ L를 추가 합니다. 첫 번째 혈 청 희석은 1시 10분.
          2. 일단 모든 RDE 취급 세라 첫 번째 열에 추가 됩니다 (예를 들어, A1, B1, C1), 멀티 채널 피펫으로 아래로 pipetting으로 세라와 1 x PBS를 혼합을 사용 하 여. 첫 번째 열에서 두 번째 열 (예를 들어, A2에 A1에서) 희석된 세라의 25 µ L를 전송. 희석 사이의 팁을 변경 하 고 혼합.
          3. 반복 단계 5.3.1.4.2. 마지막 열 (예를 들어, A12, B12, C12)에 도달할 때까지. 모든 우물 (25 µ L) 볼륨 일관성을 유지 하는 마지막 열에서 25 µ L를 삭제 합니다. 네거티브 제어로 어떤 세라 없이 1 x PBS의만 25 µ L을 포함 하는 우물의 1 행 포함.
        5. 는 IAV의 추가 25 µ L 96 잘 V-바닥판에 세라와 우물의 각 8 우/50 µ L 희석; 각 최종 볼륨 잘 50 µ L, 바이러스의 4 우를 포함 하는. 반복 pipetting으로 내용을 혼합. 실시간에서 1 시간에 대 한 품 어
        6. 우물의 각 0.5% 터키 RBCs의 추가 50 µ L. 반복 pipetting으로 내용을 혼합. 얼음에 30-45 분 동안 접시를 품 어. 제어 웰 스 (1 x PBS)에서 Rbc 형성 우물의 바닥에 붉은 침전 (, 펠 릿) 때 하이 분석 결과 시각적으로 읽기.
          참고: Rbc와 같은 다른 종에서 닭고기, 기니 돼지 또는 말 또한 사용 될 수 있다.
        7. 잘는 Rbc 빨간색 펠 릿을 형성 하 고 hemagglutination에서 발생 하지 않습니다 마지막을 식별 하 여 하이 titers 계산.
          참고:이 희석의 상호 가치 하이 titer입니다. 상호 가치 1시 20분에 대 한 해결 하기 위해 20의 요인에 의해 증식의 첫 번째 행에서 혈 청 희석.
      2. 바이러스 microneutralization 분석 결과 (VNA) ( 그림 6)
        1. VNA, 전날 준비 대로 5.2.1.1 단계에 설명 된 다음 날 80-90% 합류에 도달 하는 96 잘 접시에서 MDCK 셀. 200: FFU/25 µ L를 감염 미디어에서 PR8 WT의 희석을 준비.
        2. 비활성화 1 h. 56 ° C에서 마우스 세라 triplicate 96 잘 접시를 사용 하 여 마우스 세라 당 2-fold 직렬 희석 (12 희석)를 확인 합니다. (예를 들어, A1) 첫 번째 행의 첫 번째 잘에서 감염 미디어의 µ L
          1. 추가 40 µ L 160 혈 청의 (혈 청 희석 1:5). Pipetting으로 혼합. 다른 우물을 감염 미디어의 100 µ L를 추가 (H12 A2).
          2. 1:2 희석 (예를 들어, A2에 A1에서)을 두 번째 행에 첫 번째 행에서 전송 100 µ L. 희석과 혼합 사이 팁 pipetting으로 변경 합니다. 마지막 행 (예를 들어, A12)까지이 반복 합니다. 모든 우물 (100 µ L) 볼륨 일관성을 유지 하는 마지막 행에서 100 µ L를 폐기.
        3. 모든 우물을 IAV 희석의 추가 100 µ L. 실시간에서 1 시간을 품 어 한편, 진공 흡 인기 멀티 채널 어댑터를 사용 하 여 96 잘 접시의 MDCK 세포에서 조직 문화 매체를 제거 하 고 두 번 1 x PBS의 100 µ L/잘 씻어.
        4. MDCK 셀의 96 잘 접시 각 컨트롤에 대 한 두 개의 행을 두고. 한 행 (바이러스와 세라 없이 셀), 부정적인 컨트롤 이며 다른 행 감염 (바이러스 세라 나 모의 감염 마우스에서 세라에에서 셀)의 긍정적인 통제.
        5. 전송 50 µ L/음 바이러스 항 체 접시에서 MDCK 셀의 96 잘 접시를. 바이러스 흡착 수 있도록 RT에 1 시간을 위한 락 플랫폼에 접시를 넣어.
        6. 진공 흡 인기 멀티 채널 어댑터를 사용 하 여 바이러스 항 체 inoculum을 제거 하 고 TPCK 취급 trypsin의 1 µ g/mL를 포함 하는 감염 된 후 미디어의 100 µ L/잘 추가.
        7. Cytopathic 효과 (CPE)는 긍정적인 제어 (또는 제어 혈 세라의 부재에 감염 된 세포)에서 관찰 될 때까지 5% CO 2와 33 ° C 또는 37 ° C 배양 기에서 3-4 일에 대 한 셀을 품 어.
        8. 진공 흡 인기 멀티 채널 어댑터를 사용 하 여 조직 문화 매체를 제거 하 고 추가 0.1% 크리스탈 바이올렛의 100 µ L/잘. 진공 흡 인기 멀티 채널 어댑터를 사용 하 여 크리스탈 바이올렛 솔루션 실시간 제거에 1 시간에 품 어. 씻고 증류수로 3 번 웰 스. 실시간에서 접시 건조
        9. MDCK 셀의 confluent 셀 단층 유지 높은 희석을 식별 하 여 VNA titers 계산.
          참고:이 해당 희석의 상호 가치는 중화 항 체 titer. 상호 가치 1시 10분을 해결 하기 위해 10의 요인에 의해 증식에 행의 첫 번째 잘 세라의 희석.

    6. 보호 효능 백신 ( 그림 3)의 평가

    1. 예방 접종 i.n. 여성 6 하-8-1 주일-오래 된 C57BL/6 마우스의 그룹 (n = 11) PR8 LAIV 복용량 (: FFU/마우스) 테스트와 모의 접종 생쥐의 또 다른 그룹 (n = 11) 1 살 균 PBS x와 함께. 섹션 3에서에서 앞에서 설명한 마우스 i.n. 예방접종 수행.
    2. 14 일 사후 예방 접종, 쥐 피 고 섹션 3에에서 설명 된 대로 세라를 수집 합니다. 5.1.1 절에서 설명 하는 대로 PR8 WT에 대 한 항 체를 중화 하 고 총의 존재를 분석.
    3. 15 일 사후 예방 접종, 측정 하 고 마우스 몸 무게 (0 일)를 기록 합니다. 섹션 3에서에서 앞에서 설명한 PR8 WT (동종 도전)의 치명적인 복용량을 가진 쥐 i.n. 도전.
    4. 측정 체중과 생존 (n = 5 / 그룹) 도전 병 적 상태와 사망률 PR8 WT 도전 예방 접종된 생쥐 (4.1 단원)에 의해 제작 평가 후 14 일 동안.
    5. 마우스 폐와 비 강 점 막 (n = 3/일) 하루 2에서 4 PR8 WT. 균질과 도전 후 폐 분석 및 비 강 점 막에 섹션 4.2에에서 설명 된 대로 평가 예방 접종 생쥐에서 PR8 WT의 바이러스 성 복제.
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    바이러스 성 병 인 쥐에서의 특성

    IAV의 병 인은 병 적 상태와 사망률의 감염에 의해 발생 관련이 있습니다. 이러한 두 매개 변수 마우스에서 쉽게 계산 될 수 있습니다: IAV 병 적 이며 감염 된 쥐에 있는 몸 무게 손실과 관련 된 생존의 비율 (그림 1) 사망률을 나타낼 것 이다. 몸 무게와 IAV 감염 된 쥐에 있는 생존은 일반적으로 모니터링 매일 감염8,9,,1029후 적어도 2 주 동안. 가져온 생존 데이터 MLD50 리드와 Muench25의 방법을 사용 하 여 계산을 확인할 수 있습니다. IAV pathogenesis의 또 다른 지표는 (그림 1)의 위 (비 강 점 막) 호흡기에 바이러스 성 복제 (폐)에 관련이 있습니다. 이러한 장기에서 바이러스 titer로 얻은 정보는 병 적 상태와 사망률 값에 해당 함께 찍은 및 바이러스 성 병 인에 대 한 좋은 표시를 제공. 그것은 알려져 IAV 복제 마우스 폐에 2-4 일 (파이), 감염 된 후 사이 피크 하 고 그래서 우리는 2-4 일 파이에서 이러한 장기 복구 추천

    Figure 1
    그림 1: 쥐에서 IAV Pathogenesis의 특성: 쥐 병 인 IAV 사망률 (몸 무게 손실) 및 사망 (% 생존), 그리고 또한 위 (비 강 점 막) 및 낮은 호흡기 (폐)에 복제 IAV의 능력에 관련 되어 있습니다. 간단히,에 하루 0 마우스 무게 및 그들은 intranasally IAV 감염 전에 intraperitoneally 2,2,2-tribromoethanol (TBE)와 취. 하루 14 일 1에서에서 쥐 매일 몸 무게 손실 (사망률) 및 마우스 치 사 량 50 (MLD50) 계산 % 생존 (사망) 무게는. 일 2에 감염 된 후 4 일, 쥐 폐와 비 강 점 막 회복 이며 바이러스 성 복제를 평가 하는 무 균. 쥐 실험 IAV pathogenesis PR8 WT를 사용 하 여 하는 BSL-2 조건 하에서 수행 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    그림 2에서는 PR8 WT pathogenesis의 평가에서 얻은 데이터는 표시 됩니다. 6-에-8 주-오래 된 C57BL/6 마우스의 4 개 그룹 (n = 11) 지정 된 복용량과 감염된 i.n. 했다 (10, 102, 103 , 104 : FFU/마우스) PR8 WT의. 몸 무게와 그룹 당 5 쥐의 생존 14 일 파이 (그림 2A-B)에 의해 측정 되었다. 모든 마우스 104 : FFU의 PR8 WT 손실 무게를 신속 하 게 접종 (그림 2A)와 그들의 모든 5와 6 일 파이 (그림 2B)에서 사망 했다. 마우스 접종 103 : FFU의 PR8 WT 손실 체중 탐정 (그림 2A) 시간 나중에 그리고 그들은 모두 7, 8 일 파이 (그림 2B)에 의해 죽 었 다. 모든 마우스 접종만 2 주 9 파이 (그림 2B)에 사망 하지만 10의2 : FFU의 PR8 WT 손실 체중 (그림 2A). 마지막으로, 쥐 10 접종 PR8 WT: FFU 무게 (그림 2A)을 잃지 않 았 어 그리고 그들 모두 살아남은 감염 (그림 2B). MLD50 PR8 WT의 리드와 Muench 방법25 계산이 실험에는 1.5 x 102 : FFU (그림 2C).

    상단에 PR8 복제를 평가 하 고 낮은 호흡기를 쥐의 요로 감염 표시 된 복용량과 i.n. (10, 102, 103, 그리고 104 : FFU/마우스), 폐, 비 강 점 막 2-4 일 파이에서 재기 되었다 (n = 3). 폐 균질 후 바이러스가이 기관에 양은 면역 형광 분석 결과 (그림 2D)으로 분석 했다. 다른 쥐 그룹의 폐에서 발견 하는 바이러스 titer 그들을 면역 하는 데 사용 하는 복용량에와 관련 되었다: 높은 바이러스 titers 10 접종 하는 쥐의 폐에서 발견 된 2와 4 일 탐정, 낮은 바이러스 titers에서 발견 된 반면에4 : FFU PR8 WT PR8 WT의 10: FFU 접종 생쥐의 폐.

    Figure 2
    그림 2: 데이터의 표현을 얻은 바이러스 성 병 인의 평가: 병 적 상태와 사망률 PR8 WT, 6 하-8-1 주일-오래 된 여성 C57BL/6 마우스의 분석 (n = 5) 형광 형성의 지정 된 번호와 함께 감염된 i.n. 했다 PR8 WT의 단위 (: FFU) 다음 (A)-체중 감소 (병 적)에 대 한 2 주 동안 매일 모니터링 그리고 (B) 생존 (사망). 데이터 표시 방법 및 개별 마우스에 대 한 결정 결과의 표준 편차 (n = 5). (C) 값 2 주 이상 평가 % 생존의 MLD50 리드와 Muench 방법25를 사용 하 여 계산 하는 데 사용 됩니다. (D) 바이러스 성 복제, 6 하-8-1 주일-오래 된 여성 C57BL/6 마우스 평가 (n = 6) 감염된 i.n.: FFU의 지정 된 번호와 함께 했다. 폐 또는 감염 된 쥐의 비 점 막에서 바이러스 성 복제 2-4 일 탐정 immunofocus 분석 결과 사용 하 여 일반적으로 평가 됩니다. 바이러스 titers: FFU/mL로 기록 됩니다. 데이터는 의미와 각 마우스에서 얻은 결과의 SDs를 나타냅니다. 파선 탐지 (200: FFU/mL)는 분석 결과의 한계를 나타내는 포함 되어 있습니다. 마우스 및 조직 배양 실험 IAV 사망률, 사망 및 p r 8을 사용 하 여 바이러스 titers을 평가 하는 BSL-2 조건 하에서 수행 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    예방 접종 후 유발 체액 응답의 평가

    체액 응답 IAV 감염에 대 한 유발 바이러스 감염 제어에 필수적인 역할을 재생 합니다. 이러한 이유로, 그것은 매우 elicited IAV WT 감염 또는 새로운 IAV 백신 (그림 3)에 의해 체액 응답을 분석 하는 것이 중요. 마우스 모델에서 면역, 후 14 일 마우스는 출혈이 ELISA (그림 4)에 의해 총 바이러스 성 단백질에 대 한 항 체의 존재와 존재의 중화 항 체는 일반적으로 바이러스 HA 단백질을 대상으로 분석 하 이 분석 결과 (같은 일반적인 학적인 접근에 의해 분석ng 클래스 "xfig" = > 그림 5) 또는 VNA (그림 6).

    Figure 3
    그림 3: 안전, Immunogenicity 및 보호는 LAIV의 효 험의 특성에서 다른 단계 체계: 새로운 LAIV 개발 IAV 감염 마우스 모델 immunogenicity 안전과 보호 효능 테스트에 보통 사용 된다. 이 제도, 안전 (A), 평가 하는 실험에서 immunogenicity (B) 및 보호 효능 (C) 후보자 LAIV의 표시 됩니다. (A) 안전성을 평가 하는 LAIV의 그것은 동일한 매개 변수를 분석 하는 데 필요한 (사망률, 사망 및 상단에 바이러스 성 복제 그리고 낮은 호흡기) 그림 1에 설명 된. Immunogenicity를 평가 하려면 마우스는 예방 접종 및 예방 접종 후 14 일 그들은 submandibular 펑크에 의해 피는. 체액 응답 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)와 중화 hemagglutination 억제 시험 (하이) 및/또는 바이러스 항 체의 존재를 평가 하 여 IAV 단백질에 대 한 총 항 체의 존재를 평가 하 여 분석 하 microneutralization 년 분석 결과 (VNA) (C) 마우스 도전 보호 효능, 예방 접종 후 15 일 평가 IAV WT. 보호 효능 평가 쥐 사망률, 사망 및 도전된 쥐의 폐에 바이러스 titers의 측정에 의해 그림 1에에서 설명 된 대로 . 쥐 실험 LAIV 후보자의 immunogenicity 안전과 보호 효능을 특성화 하는 BSL-2 조건 하에서 수행 됩니다. 다른 BSL 정장 또는 제약 조건 사용 예방 접종된 생쥐의도 전에 대 한 IAV 스트레인에 따라 필요할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    PR8 LAIV, 6 하-8-1 주일-오래 된 C57BL/6 마우스의 3 개 그룹의 immunogenicity를 평가 하기 위해 (n = 5) 다른 복용량으로 예방 접종을 했다 (102, 103, 그리고 104 : FFU/마우스) PR8 LAIV 또는 모의 부정적인 컨트롤 1 x PBS와의. 예방 접종 후 14 일 쥐 세라 submandibular 출혈26 (그림 3)에 의해 수집 되었다. 전체 바이러스 성 단백질에 대 한 항 체 응답 ELISA PR8 감염 MDCK 셀 (그림 4)의 세포 추출 물의 1: 200 희석을 사용 하 여에 의해 평가 되었다. 각 혈은 개별적으로 분석 했다. 결과 표시 마우스에서 세라 더 높은 복용량으로 예방 접종 (104 : FFU) PR8 LAIV의 낮은 복용량으로 예방 접종 생쥐의 세라 보다 총 PR8 단백질에 대 한 높은 항 체 titers 했다 (102 : FFU). 세라 컨트롤 (모의 감염 쥐) PR8 항 원에 대 한 반응성을 보여주지 않았다.

    Figure 4
    그림 4: 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 체액 성 항 체 응답을 평가 (ELISA)의 도식 대표: PR8 특정 항 체에 감염 된 쥐의 레벨은 모의 (제어) 또는 PR8 감염 MDCK 셀에서 셀 추출 물과 코팅 96 잘 폴리스 티 렌 격판덮개에 ELISA에 의해 결정 됩니다. 간단히, 14 일 파이 (그림 3), 쥐 PR8 LAIV의 지정 된 복용량과 접종 submandibular 펑크에 의해 피 했다 고 세라 수집 했다. 각 혈 청 총 PR8 단백질에 대 한 IgG 항 체 ELISA에 의해 개별적으로 평가 했다. 그래프 데이터 표시 방법 및 결과의 표준 편차는 개별 생쥐에서 얻은 세라 (n = 6). O.D, 광학 밀도 ELISA 분석 실험 BSL-2 캐비닛에서 수행 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    중화 항 체는 마우스에서의 존재를 분석 하는 사용 하 여 혈 청 분석 결과, 다른 투여로 예방 접종을 하는 쥐의 각 그룹의 (56 ° C에서 비활성화 이전) 세라의 직렬 2-fold 희석 (102, 103, 그리고 104 : FFU) PR8 LAIV의 RT (그림 5)에서 1 h PR8 WT의 4 우와 incubated 했다. 그럼, 터키 RBCs의 0.5 %PR8 세라 혼합물에 추가 되었습니다. 그림 5 의 상부는 가능한 하이 결과의 도식 표현: 항 체 바이러스 HA 단백질에 바인딩된 방지 때문에 우물의 바닥에서 Rbc 강수량을 관찰 중화 항 체는 혈 청에 포함 된 경우 Rbc의 hemagglutination입니다. 다른 한편으로, 항 체를 중화의 부재는 Rbc의 hemagglutination 관찰 됩니다. 다음, 하이 titer 마지막 잘 부족 hemagglutination 혈 청의 희석의 상호로 계산 됩니다. 그림 5 의 아래 부분에서 하이 결과 마우스에서 혈 청 PR8 LAIV의 가장 큰 금액으로 접종을 나타냅니다 (104 : FFU)의 마우스에서 혈 청을 투여 하는 동안 항 체를 중화 더 높은 titer를가지고 낮은 복용량 (102 : FFU)의 p r 8에 대 한 항 체를 중화 최저 titer를가지고. 아니 중화 항 체 혈 청 제어 (모의 감염 쥐)에 참석 했다.

    Figure 5
    그림 5: Hemagglutination 억제 (하이) 분석 결과: 감염 된 쥐에 PR8 WT에 대 한 항 체를 중화의 레벨은이 분석 결과 의해 쉽게 평가할 수 있습니다. 간단히, 세라 PR8 LAIV의 지정 된 복용량과 접종 하는 쥐에서의 (시작 희석 1시 10분) 2-fold 직렬 희석 96 잘 V-하단 플레이트에 RT에 1 h PR8 WT의 4 HAU (1:1) 혼합 했다. 1 h 부 화 후 0.5 %Rbc 얼음에 30-60 분에 대 한 바이러스 혈 청 혼합물에 추가 되었습니다. 하이 titers 잘는 Rbc 형성 빨간 버튼 및 hemagglutination (맨 위) 발생 하지 않습니다 마지막을 식별 하 여 결정 됩니다. PR8 WT와 하이 분석 BSL-2 캐비닛에서 수행 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    그림 6, VNA 마우스 세라 항 체를 중화의 평가에서 얻은 데이터는 표시 됩니다. PR8 WT의 200: FFU 세라 (이전 inactivat의 직렬 2-fold 희석 혼합 했다56 ° C에서에 드) 다른 복용량과 접종 생쥐에서 (102, 103, 그리고 104 : FFU) 실시간에서 1 h PR8 LAIV의 각 혈 청 샘플 3 중에 평가 했다. 바이러스-세라 혼합물 monolayers 96 잘 접시의 MDCK 세포의 감염에 사용 되었다. 그림 6 의 상단 부분은 가능한 VNA 결과의 도식 표현: 약 3-4 일 탐정에 CPE에 혈 청 결과에 항 체를 중화의 부재 반면, 중화 항 체는 존재 (그대로 세포 단층), 그들은 바이러스 성 하를 바인딩할 바이러스 감염 방지 고 거기 아무 CPE. CPE의 존재는 일반적으로 크리스탈 바이올렛과 얼룩 감염 된 세포에 의해 시각 그리고 바이러스 중립화 titers는 감염이 완전히 차단 하는 마지막 희석의 상호로 계산 됩니다. VNA는의 결과 그림 6의 아래쪽에 표시 됩니다. PR8 LAIV의 높은 양을 접종 하는 쥐에서 혈 청 (104 : FFU) 낮은 복용량 또는 PR8 LAIV 접종 생쥐에서 세라 하면서 중화 항 체의 가장 큰 titer를가지고 (102 : FFU)의 중화 항 체, 최저 titer를가지고 이 분석 결과 함께 얻은 결과 유사 합니다. 아니 중화 항 체 모의 감염 마우스에서 혈 청에 존재 했다.

    Figure 6
    그림 6: 바이러스 Microneutralization 분석 결과 (VNA): 이 분석 결과에 대 안으로, VNA 분석 결과 PR8 WT 중화 항 체의 존재를 평가할 수 있다. 간단히, 쥐 PR8 LAIV의 지정 된 복용량과 접종에서 세라 했다 직렬 2-fold 96 잘 접시에 (시작 희석 1:5)을 희석 하 고 실시간에 1 h PR8 WT의 200: FFU 1:1 혼합 1 시간 후 바이러스 혈 청 혼합물 96 잘 접시 MDCK 세포의 감염에 사용 되었다. 감염 된 세포는 완전 한 cytopathic 효과까지 3-4 일 동안 incubated 했다. 96 잘 접시 다음 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 얼룩이 있었다. VNA titers confluent 셀 단층을 유지 하기 위해 높은 희석을 식별 하 여 결정 됩니다. VNA PR8 WT와 BSL-2 조건 하에서 수행 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    마우스에서 IAV 백신의 보호 효능 평가

    새로운 LAIV 개발 하는 때 그것의 안전, immunogenicity 및 보호 효능 시험 된 vivo에서, 이어야 하며 마우스 모델은 일반적으로 이러한 매개 변수를 분석 하기로 첫 번째 동물 모델. 그림 3 은 마우스에 새로운 LAIV를 특성화 하는 데 필요한 다른 단계 체계 이다. LAIV (그림 3A)의 안전 평가, 쥐 감염된 i.n. pathogenesis 섹션 (4 단원)에서 설명 하는 실험 절차에 유사한 프로토콜을 사용 하 여 그리고 몸 무게와 생존 모니터링에 관련 된 정보를 제공할 것입니다. 병 적 상태와 사망률 LAIV (-그림 2A2B), MLD50를 포함 하 여. 또한, 다른 백신 접종과 접종, 시와 위 (비 강 점 막) 호흡기 (폐)에 LAIV의 복제 해야 평가8,,910, 11,29 (그림 2D). Immunogenicity를 테스트 하려면 마우스는 LAIV와에서 세라 도전은 PR8 WT (동종 도전), (그림 3B) immunogenicity 섹션 (섹션 5)에서 그 설명에 유사한 프로토콜을 사용 하 여 전에 수집 됩니다. 혈 청에서 항 체를 중화 하 고 총의 존재는 ELISA와 하이 및/또는 VNA, 각각 감지할 수 있습니다.

    마지막으로, 보호 효능 테스트, LAIV 접종 생쥐 PR8 WT와 함께 도전 하 고 보호 효능 사망률, 사망 및 이전 섹션 4 ( 에에서 설명 된 대로 폐에 도전 PR8 WT의 존재를 모니터링 하 여 특징입니다. 그림 3C)8,9,,1011. LAIV 유도 PR8 WT 과제에 대 한 보호, 마우스 몸 무게를 잃지 않을 것 이다 그리고 그들은 IAV WT와 치명적인 도전 살아남을 것입니다. 또한, 폐에서 IAV WT 바이러스 titers 감지 되지 것입니다 또는에 비해 크게 줄어들 것입니다 모의 (PBS) 예방 접종을 마우스8,9,,1011.

    조직 배양 및 솔루션 구성 스토리지 사용 코멘트
    조직 문화 미디어: Dulbecco이 글의 중간 (DMEM), 10% 수정의 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1% 페니실린-스-L-글루타민 (PSG) (DMEM 10% FBS 1 %PSG) 445 ml DMEM, FBS와 100 x 1의 5 ml 50 ml % 페니실린 (100 단위/ml)-스 (100 µ g/ml)-L-글루타민 (2 mM) (PSG) 4 ° C에서 저장소 Madin-다 비 개 신장 (MDCK) 상피 세포의 유지 보수에 사용 되는이 미디어
    감염 된 후 미디어: DMEM 0.3% 소 알 부 민 (BA), 1 %PSG (DMEM 0.3% 바 1 %PSG) 491 ml DMEM, 35%의 4.2 ml를 100의 5 ml x PSG 4 ° C에서 저장소 이 미디어는 인플루엔자 A 바이러스 (IAV) 감염 후 MDCK 세포의 유지 보수를 위해 사용 됩니다.
    버퍼링 하는 인산 염 (10 x PBS) x 10 NaCl의 80 g KCl, 나2HPO4.7H2O, KH24의 2 세대의 11.5 g의 2 세대. 7.3 ddH2O 1 L. 조정 산도까지 추가 상 온 (RT)에서 저장 압력솥에 의해 소독
    1 x PBS 10 x PBS ddH2O 1시 10분 희석 RT에 저장소 압력솥에 의해 소독
    감염 미디어: 1 x PBS, 0.3% 바, 1% 페니실린 스 (PS) (PBS/바/PS) 487 ml 1 x PBS 살 균, 35%의 4.2 ml를 100 x 1의 5 ml % 페니실린 (100 단위/ml)-스 (100 µ g/ml) (PS) 4 ° C에서 저장소 이 미디어 IAV 감염에 사용 됩니다.
    고정/permeabilization 솔루션: 4% 포름알데히드 0.5% 트라이 톤 X-100 1 x PBS에 희석 400 mL 중립 버퍼링 포 르 말린 10%, Triton X-100 그리고 1 x PBS의 595 ml 5 ml
    d > RT가 게 이 솔루션은 수정 하 고 바이러스 성 적정 실험에서 MDCK 세포를 permeabilize 사용 포름알데히드에 노출 되지 않도록 하는 증기 두건에서 솔루션 준비 2.5% 차단 솔루션: 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 1 x PBS에서 1 x PBS의 97.5 mL에 BSA의 2.5 g 4 ° C에서 저장소 이 솔루션은 면역 형광 분석 실험 및 ELISAs 차단 솔루션으로 사용 됩니다. 0.2 μ m 필터로 여과 하 여 소독. 항 체 희석 솔루션 (1 x PBS에서 1 %BSA) 1 x PBS의 99 mL에 BSA의 1 g 4 ° C에서 저장소 이 솔루션은 1 차 및 이차 항 체 면역 형광 분석 실험 및 ELISAs의 희석 사용 0.2 µ m 필터 여과 의해 소독 0.1% 크리스탈 바이올렛 용액 1 g 메탄올의 400 ml에 크리스탈 바이올렛의. DdH2O의 600 ml을 추가 RT에 저장소 이 솔루션은 수정 하 고 얼룩 바이러스 중화 분석 실험에서 MDCK 셀 사용 Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl 케 톤 (TPCK)-트립 신 처리 DdH2O 1 mg/ml에서 1000 x 재고 솔루션을 준비 -20 ° C에서 저장소 TPCK-트립 신 IAV 감염에 추가 됩니다. 100 µ l aliquots를 확인 RIPA 버퍼 10 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.1% 나트륨 deoxycholate, 0.1 %SDS, 140 mM NaCl, 1% 트라이 톤 X-100 4 ° C에서 저장소 이 솔루션을 사용 하 여 셀 추출 물

    표 1: 조직 문화 미디어 및 솔루션입니다.

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    Discussion

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    IAV의 마우스 모델 IAV pathogenesis, immunogenicity 및 보호 효능의 학문 vivo에서 널리 사용 됩니다. 쥐의 작은 크기 쉽게 그들을 조작 하 고 흰 족제비 또는 기니 돼지 등 다른 동물 모델에 비해 저장. 또한, 동물 비용 측면에서 용이성, 주택 및 재생 그들의 사용에에서 허용 전 임상 예방 접종 시험 동물의 다 수 필요 하다. 특히, 마우스에서 사용 된 이후 여러 연구 분야, 몇몇 분자 되며 면역학 murine 시 약 사용할 수 IAV 연구에 대 한 그들의 사용을 촉진 하기 위하여. 최소 호스트 변화와 진화론 비슷한 면역 시스템의 존재에 존재 하는 또한, 인 간에 게 그들 IAV 연구에 대 한 강력한 작은 동물 모델. 마지막으로, 호스트 바이러스 성 단백질 상호 작용의 연구 및 바이러스 성 병 인에 그들의 기여는 현재 코 쥐에 접근에 의해 가능. 그러나, IAV 연구에 대 한 마우스를 사용 하 여 여러 가지 이점을 옆에 그들은 유용 하지 않습니다 IAV 전송 연구. 그러므로, 흰 족제비 또는 기니 피그 IAV 전송 연구에 더 적절 한 동물 모델 이다. 이 마우스 나이, 면역 상태, 성, 유전적 배경 및 스트레인;에 따라 다를 수 있지만 마우스 IAV 일반적으로 감염의 임상 증상 감염 된 후 2-3 일, 표시 뿐만 아니라 바이러스 스트레인 그리고 복용량 사용입니다. 증상으로 식욕 부진, 무기력, huddling, 쓸 모피, 몸 무게와 죽음16,17의 손실.

    이 원고에서 우리 몸 체중 감소 (병 적), 생존 (사망)의 위 (비 강 점 막)에 바이러스 성 복제를 평가 하 여 비율을 모니터링 하 여 IAV와 감염 쥐 i.n.에 바이러스 성 병 인을 평가 하 고 낮은 (폐) 하는 방법을 설명합니다 호흡기 (그림 1 그림 2). IAV의 pathogenesis 신형 IAV의 맥락에서 뿐만 아니라 LAIV 백신 후보자 (그림 3)의 안전한 구현에 매우 중요 한 매개 변수입니다. 계절 IAVs와 (같은 말, 개 또는 돼지) 다른 포유동물을 감염 IAVs 생산 하지 않습니다 일반적으로 마우스11,27질병의 표시. 이 경우에, 폐에 바이러스 titers 분석 또는 감염 된 쥐의 비 점 막 IAV 긴장의 바이러스 성 병 인을 평가 하는 주요 매개 변수입니다. 일단 폐와 비 강 점 막 수집, 그들은 무 균 하 고 이러한 기관에 바이러스 양의 면역 형광 분석 결과, 분석 결과 플 라크에 의해 분석 될 수 있다 조직 문화 감염 복용량 50 (TCID50) 또는 다른 검증된 방법8 ,29. 이후 패 분석 결과 필요 MDCK 셀 (6 잘 플레이트 형식)의 높은 수량, TCID50과 같은 더 많은 시간 (3-4 일) 하는 데 필요한 계산 바이러스 titers 간접 면역 형광 검사를 사용 하 여 바이러스 titers을 평가 하는 것이 좋습니다. 그러나, 간접 면역 형광 분석을 수행 하기 위해 그것이 필요: 1) (그것 때문에 그것은 가장 풍부한 바이러스 성 단백질 생산 IAV nucleoprotein, NP에 대 한 항 체를 사용 하 여 권장은 IAV 단백질에 대 한 기본 특정 항 체 바이러스 성 감염); 시 2) 2 차 항 체는 fluorophore;를 활용 그리고 3) 형광 긍정적인 감염 된 세포를 형광 현미경.

    때문에 쥐의 면역 체계 진화론 인간16 의 면역 체계에 유사한 IAVs (또는 백신 후보자)의 immunogenicity를 쉽게 수 쥐 IAV 감염에 대 한 강력 하 고 보호 체액 반응 유도 수 있습니다, 때문에 총 (ELISA; 확인 하 여 평가 그림 4) (하이, 그림 5) 중화 또는 VNA (그림 6) 항 체 응답. 예방 접종 후 체액 응답을 분석 하 쥐 복고풍 궤도 펑크, 꼬리 클립, saphenous 정 맥 펑크 submandibular 펑크 등 다른 승인 된 방법으로 없어져야 될 수 합니다. 우리 선택 submandibular 빵 꾸 기술26 절차 마 취의 사용을 필요로 하지 않습니다 그리고 면역학 연구; 대 한 혈액의 허용 볼륨을 얻을 수 있습니다. 복고풍 궤도 펑크, 반대로 마우스를 취 해야 합니다, 그리고 꼬리 클립 또는 saphenous 정 맥 빵 꾸, 어디 혈액 볼륨 복구 일반적으로 낮습니다.

    이 원고에서 우리는 ELISA 바이러스 감염 세포 추출 물을 사용 하 여 전체 바이러스 성 단백질에 대 한 항 체의 존재를 평가 하는 방법을 설명 합니다. IAV 감염 바이러스 성 하 (주요 항 원 바이러스 성 대상)에 대 한 항 체에 의해, 주로, 중재 보호 면역을 유도 하는 이후이 좋습니다 ELISA를 사용 하 여 순화 된 재조합 하 여 HA에 대 한 유도 하는 특정 항 체의 양을 평가 하 단백질10. 중화 항 체의 존재를 분석, 하이 고 VNA 메서드 허용 하지만 둘 다 장점과 단점이 있다. 하이 급속 하다 (2-3 h) 질병 및 제어 (CDC) IAV 중화 항 체30의 존재를 평가를 위한 센터에 의해 승인. VNA는 더 많은 시간이 소요 (3-4 일) 하지만 그것은 바이러스 성 감염을 중화 시킬 수 있는 항 체만을 평가 하므로 보다 구체적인입니다. 특히, VNA는 중화 항 체31, 뿐만 아니라 나 중화 항 체32줄기 반응 하 감지 표시 되었습니다. VNA는의 또 다른 장점은 적은 IAV 이후 분석 결과 감도 필요한 약 10 ~4-105 : FFU HAU 분석 결과 비교 (200: FFU) 필요 하다. 또한, 하이 분석 결과 해석 결과33,,3435와 어려움으로 인해 조류 IAVs에 대 한 중화 항 체 검출에 대 한 문제가 될 수 있습니다. 또한, VNA는 인플루엔자 항 체를 중화의 식별에 대 한 Rbc 사용 하 여가 필요 하지 않습니다.

    마지막으로, 우리는 새로운 IAV 백신 (그림 3) 개발에 고려해 야 할 세 가지 주요 측면을 평가 하는 실험 절차 설명: 1) 안전: 백신 안전 하 고 생산 하지 질병; 이어야 합니다. 2) immunogenicity: 백신 면역성 되어야 하며 유도 체액과 세포 보호 응답; 3) 보호 효능: 백신 WT 동종 및 분리 바이러스와 문제에 대 한 보호를 유도 해야 합니다. 마우스 모델은 적합 한 그것 다양 한 예방 접종 계획을 평가할 수 있는 조건을 포함 한 광범위 한 보호, 관리, 항 원/백신 복용량, 다른 adjuvants의 사용 때문에는 새로운 IAV 백신에서 vivo에서 의 첫 상영 에 대 한 동종 또는 분리 IAVs 긴장16,17에 도전 합니다. 그러나, 인간 임상 시험을 진행 하기 전에 백신 후보자는 최소한 테스트 해야 두 번째 vivo에서 모델.

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    Disclosures

    저자는 공개 없다.

    Acknowledgments

    LM-S 실험실에서 인플루엔자 바이러스에 대 한 연구는 부분적으로 뉴욕 인플루엔자의 우수 센터 (NYICE), 인플루엔자 연구 및 감시 (CEIRS)의 NIAID 센터의 회원에 의해 자금. 원고 수정에 그녀의 지원에 감사 웬디 베이츠 하 고.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells ATCC CCL-34
    Six- to eight-week-old female C57BL/6 mice National Cancer Institute (NCI) 01XBE
    Turckey red blod cells Biolink Inc Store at 4 °C
    Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Corning Cellgro 15-013-CV Store at 4 °C
    Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1500-050 Store at -20 °C
    Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x Corning 30-009-CI Store at -20 °C
    Penicillin/Streptomycin (PS) 100x Corning 30-00-CI Store at -20 °C
    Bovin Albumin solution (BA) Sigma-Aldrich A7409 Store at 4 °C
    Bovin Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9647 Store at 4 °C
    Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin Sigma-Aldrich T8802 Store at -20 °C
    Neutral Buffered Formalin 10% EMD 65346-85 Store at RT
    Triton X-100 J.T.Baker X198-07 Store at RT
    Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 ATTC H16-L10-4R5 Store at -20 °C
    Polyclonal rabbit anti-mouse immunoglobulins/FITC Dako F0261 Store at 4 °C
    ECL Anti-mouse IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody GE Healthcare LNA931V/AG Store at 4 °C
    TMB substrate set BioLegend 421101 Store at 4 °C
    Vmax Kinetic plate reader Molecular Devices
    Dounce Tissue Grinders Thomas Scientific 7722-7
    Receptor destroying enzyme, RDE (II) Denka Seiken Co. 370013 Store at -20 °C
    Crystal Violet Fisher Scienctific C581-100 Store at RT
    96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 655-180
    Cell Culture dishes 100 mm Greiner Bio-one 664-160
    Nunc MicroWell 96-Well Microplates Thermo Fisher Scienctific 269620
    Nunc 96-Well Polystyrene Conical Bottom MicroWell Plates Thermo Fisher Scienctific 249570
    Puralub Vet Ointment Dechra 9N-76855
    Fluorescent microscope Olympus Olympus IX81

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    References

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    감염 마우스 모델에서 인플루엔자 A 바이러스 연구
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    Rodriguez, L., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (127), e55898, doi:10.3791/55898 (2017).More

    Rodriguez, L., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (127), e55898, doi:10.3791/55898 (2017).

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