Summary

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites zur Definition zellspezifischer Regulierungsregionen

Published: May 28, 2017
doi:

Summary

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur genomweiten Kartierung der Integrationsorte von Moloney murinen Leukämie-Virus-basierten retroviralen Vektoren in menschlichen Zellen.

Abstract

Moloney murine Leukämie (MLV) Virus-basierte retrovirale Vektoren integrieren sich überwiegend in acetylierte Enhancer und Promotoren. Aus diesem Grund können mLV-Integrationsorte als funktionale Marker aktiver regulatorischer Elemente verwendet werden. Hier präsentieren wir ein retrovirales Scan-Tool, das die genomweite Identifizierung von zellspezifischen Enhancern und Promotoren ermöglicht. Kurz gesagt wird die Zielzellpopulation mit einem mLV-abgeleiteten Vektor transduziert und genomische DNA wird mit einem häufig schneidenden Restriktionsenzym verdaut. Nach der Ligation von genomischen Fragmenten mit einem kompatiblen DNA-Linker ermöglicht die Linker-vermittelte Polymerase-Kettenreaktion (LM-PCR) die Amplifikation der Virus-Host-Genom-Übergänge. Die massive Sequenzierung der Ampullen wird verwendet, um das mLV-Integrationsprofil genomweit zu definieren. Schließlich werden Cluster von wiederkehrenden Integrationen definiert, um zellspezifische regulatorische Regionen zu identifizieren, die für die Aktivierung von zelltypspezifischen Transkriptionsprogrammen verantwortlich sind.

<p class= "Jove_content"> Das retrovirale Scan-Tool ermöglicht die genomweite Identifizierung von zellspezifischen Promotoren und Enhancern in prospektiv isolierten Zielzellpopulationen. Bemerkenswerterweise stellt das retrovirale Scannen eine instrumentelle Technik für die retrospektive Identifizierung von seltenen Populationen ( z. B. somatische Stammzellen) dar, die keine robusten Marker für eine prospektive Isolation aufweisen.

Introduction

Die Zellidentität wird durch die Expression spezifischer Gene bestimmt. Die Rolle von cis-regulatorischen Elementen wie Promotoren und Enhancern ist entscheidend für die Aktivierung von zelltypspezifischen Transkriptionsprogrammen. Diese regulatorischen Regionen zeichnen sich durch spezifische Chromatin-Merkmale aus, wie z. B. eigenartige Histon-Modifikationen, Transkriptionsfaktoren und Co-Faktoren-Bindung und Chromatin-Zugänglichkeit, die für ihre genomweite Identifizierung in mehreren Zelltypen 1 , 2 , 3 weit verbreitet sind. Insbesondere wird das genomweite Profil der Acetylierung von Histon H3-Lysin 27 (H3K27ac) üblicherweise zur Definition von aktiven Promotoren, Enhancern und Super-Enhancern 4 , 5 , 6 verwendet.

Moloney murine Leukämie-Virus (MLV) ist ein Gamma-Retrovirus, das weit verbreitet für Gen verwendet wirdTransfer in Säugetierzellen. Nach der Infektion einer Zielzelle wird das retrovirale RNA-Genom in einem doppelsträngigen DNA-Molekül retro-transkribiert, das virale und zelluläre Proteine ​​bindet, um den Vorintegrationskomplex (PIC) zu bilden. Der PIC tritt in den Kern ein und bindet das Wirtszellchromatin. Hier vermittelt die virale Integrase, eine Schlüssel-PIC-Komponente, die Integration der proviralen DNA in das Wirtszellgenom. Die mLV-Integration in die genomische DNA ist nicht zufällig, sondern tritt in aktiven cis-regulatorischen Elementen wie Promotoren und Enhancern in zellspezifischer Weise 7 , 8 , 9 , 10 auf . Dieses eigenartige Integrationsprofil wird durch eine direkte Wechselwirkung zwischen der mLV-Integrase und den zellulären Bromodomain- und extraterminalen Domänen (BET) -Proteinen 11 , 12 , 13 vermittelt. BET – Proteine ​​(BRD2, BRD3 undBRD4) als Brücke zwischen Wirtschromatin und mLV PIC: Durch ihre Bromodomänen erkennen sie hoch acetylierte cis-regulatorische Regionen, während die extraterminalen Domäne mit der mLV-Integrase 11 , 12 , 13 wechselwirkt.

Hier beschreiben wir das retrovirale Scannen, ein neuartiges Werkzeug, um aktive cis-regulatorische Regionen auf der Basis der Integrationseigenschaften von mLV abzubilden. Kurz gesagt werden die Zellen mit einem mLV-abgeleiteten retroviralen Vektor transduziert, der das verstärkte rekonstruierte Gen (EGFP) -Reporter-Gen des grünen fluoreszierenden Proteins exprimiert. Nach der genomischen DNA-Extraktion werden die Übergänge zwischen der 3'-langen terminalen Wiederholung (LTR) des mLV-Vektors und der genomischen DNA durch Linker-vermittelte PCR (LM-PCR) amplifiziert und massiv sequenziert. MLV-Integrationsstandorte werden dem menschlichen Genom zugeordnet, und genomische Regionen, die stark von mLV gezielt sind, werden als Cluster von mLV-Integrationsstellen definiert.

Retroviraler ScanNing wurde verwendet, um zellspezifische aktive regulatorische Elemente in mehreren menschlichen Primärzellen 14 , 15 zu definieren. MLV-Cluster, die mit epigenetisch definierten Promotoren und Enhancern co-mapped waren, von denen die meisten aktive Histonmarken wie H3K27ac enthielten und zellspezifisch waren. Das retrovirale Scannen ermöglicht die genomweite Identifizierung von DNA-regulatorischen Elementen in prospektiv gereinigten Zellpopulationen 7 , 14 sowie in retrospektiv definierten Zellpopulationen wie Keratinozyten-Stammzellen, die keine wirksamen Marker für die prospektive Isolation fehlen 15 .

Protocol

1. MLV-Transduktion von menschlichen Zellen Isolieren Sie die Zielzellen und transduzieren sie mit einem mVV-abgeleiteten retroviralen Vektor, der das eGFP-Reportergen beherbergt und mit dem vesikulären Stomatitisvirus G (VSV-G) oder dem amphotropen Hüllglykoprotein 16 pseudotypisiert ist. Halten Sie mock-transduzierte Zellen als Negativkontrolle für die folgenden Analysen. Da mVV-basierte retrovirale Vektoren effizient transduzierende Zellen transduzieren …

Representative Results

Arbeitsablauf des retroviralen Scanvorgangs Der Arbeitsablauf des retroviralen Abtastvorgangs ist in Abbildung 1 schematisiert. Die Zielzellpopulation wird gereinigt und mit einem mLV-abgeleiteten retroviralen Vektor transduziert, der ein eGFP-Reportergen exprimiert. Das Transgen wird von den beiden identischen langen terminalen Wiederholungen (5 'und 3' LTR) flankiert, was die Synthese, die …

Discussion

Hier haben wir ein Protokoll zur genomweiten Kartierung der Integrationsstellen von mLV beschrieben, ein Retrovirus, das Chromatinregionen anspricht, epigenetisch als aktive Promotoren und Enhancer markiert. Kritische Schritte und / oder Einschränkungen des Protokolls umfassen: (i) mLV-Transduktion der Zielzellpopulation; (Ii) Amplifikation von Virus-Host-Übergängen durch LM-PCR; (Iii) Abrufen eines hohen Anteils an Integrationsstellen. MLV-basierte retrovirale Vektoren effizient transduzierende Zellen. Die geringe E…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch Stipendien des Europäischen Forschungsrates (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), des italienischen Ministeriums für Bildung, Universitäten und Forschung (FIRB-Futuro in Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro in Ricerca 2012-RBFR126B8I_003) unterstützt , EPIGEN Epigenomics Flagship Project), das italienische Gesundheitsministerium (Young Researchers Call 2011 GR-2011-02352026) und die Imagine Institute Foundation (Paris, Frankreich).

Materials

PBS, pH 7.4 ThermoScientific 10010031 or equivalent
Fetal Bovine Serum ThermoScientific 16000044 or equivalent
0.2 ml tubes general lab supplier
1.5 ml tubes general lab supplier
QIAGEN QIAmp DNA mini Kit  QIAGEN 51306 or equivalent
T4 DNA ligase  New England BioLabs M0202T
T4 DNA Ligase Reaction buffer New England BioLabs M0202T
Linker Plus Strand oligonucleotide general lab supplier 5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’  (Purification grade: SDS-PAGE)
Linker Minus Strand oligonucleotide general lab supplier 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (Purification grade: SDS-PAGE)
Tru9I Roche-Sigma-Aldrich 11464825001
SuRE/Cut Buffer M Roche-Sigma-Aldrich 11417983001
PstI  Roche-Sigma-Aldrich 10798991001
SuRE/Cut Buffer H Roche-Sigma-Aldrich 11417991001
Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity  Invitrogen 11304011
10mM dNTP Mix Invitrogen 18427013 or equivalent
PCR grade water general lab supplier
96-well thermal cycler (with heated lid) general lab supplier
linker primer general lab supplier 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (Purification grade: PCR grade)
MLV-3’ LTR primer general lab supplier 5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (Purification grade: PCR grade)
linker nested primer 454 general lab supplier 5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE)
MLV-3’ LTR nested primer 454 general lab supplier 5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE)
linker nested primer Illumina general lab supplier 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE)
MLV-3’ LTR nested primer Illumina general lab supplier 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE)
Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2 general lab supplier
Ethanol (absolute) for molecular biology Sigma-Aldrich E7023 or equivalent
Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector) Invitrogen K4500-01
QIAquick Gel Extraction kit QIAGEN 28704
Agarose Sigma-Aldrich A9539 or equivalent
Ethidium bromide  Sigma-Aldrich E1510 or equivalent
100 bp DNA ladder Invitrogen 15628019 or equivalent
6X Loading Buffer ThermoScientific R0611 or equivalent
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer ThermoScientific ND-2000
Nextera XT Index kit Illumina FC-131-1001 or FC-131-1002
2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix  KAPA Biosystems KK2601
Dynal magnetic stand for 2 ml tubes Invitrogen 12321D or equivalent
Agencourt AMPure XP 60 ml kit Beckman Coulter Genomics A63881
Tris-HCl 10 mM, pH 8.5 general lab supplier
Agilent 2200 TapeStation system Agilent Technologies G2964AA or equivalent
D1000 ScreenTape Agilent Technologies 5067-5582 or equivalent
D1000 Reagents Agilent Technologies 5067-5583 or equivalent
KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism) KAPA Biosystems KK4835
ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems 4329003
NaOH 1.0 N, molecular biology-grade general lab supplier
HT1 (Hybridization Buffer) Illumina  Provided in the MiSeq Reagent Kit
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles) Illumina MS-102-3001
MiSeq System Illumina SY-410-1003
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001

References

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Cite This Article
Romano, O., Cifola, I., Poletti, V., Severgnini, M., Peano, C., De Bellis, G., Mavilio, F., Miccio, A. Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions. J. Vis. Exp. (123), e55919, doi:10.3791/55919 (2017).

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