Summary

レトロウイルススキャン:細胞特異的調節領域を定義するためのMLV統合サイトのマッピング

Published: May 28, 2017
doi:

Summary

ここでは、ヒト細胞におけるモロニーマウス白血病ウイルスベースのレトロウイルスベクターの組み込み部位のゲノムワイドマッピングのためのプロトコールについて記載する。

Abstract

モロニーマウス白血病(MLV)ウイルスベースのレトロウイルスベクターは、主にアセチル化エンハンサーおよびプロモーターに組み込まれる。この理由から、mLV組込み部位は、活性調節エレメントの機能的マーカーとして使用することができる。ここでは、細胞特異的エンハンサーおよびプロモーターのゲノムワイドな同定を可能にするレトロウイルススキャニングツールを紹介します。簡潔には、標的細胞集団をmLV由来ベクターで形質導入し、ゲノムDNAを頻繁に切断する制限酵素で消化する。適合するDNAリンカーでゲノム断片をライゲーションした後、リンカー媒介ポリメラーゼ連鎖反応(LM-PCR)により、ウィルス – ホストゲノム接合の増幅が可能になる。アンプリコンの大規模な配列決定は、全ゲノムのmLVインテグレーションプロファイルを定義するために使用されます。最後に、細胞型特異的転写プログラムの活性化に関与する細胞特異的調節領域を同定するために、反復インテグレーションのクラスターを定義する。

<p class= "jove_content">レトロウイルススキャニングツールは、前向きに分離された標的細胞集団における細胞特異的プロモーターおよびエンハンサーのゲノムワイド同定を可能にする。注目すべきは、レトロウイルススキャニングは、将来の単離のための強力なマーカーを欠く稀な集団( 例えば、体細胞幹細胞)の遡及的同定のための道具技術を表す。

Introduction

細胞同一性は、特定の遺伝子セットの発現によって決定される。プロモーターおよびエンハンサーのようなシス調節要素の役割は、細胞型特異的転写プログラムの活性化にとって重要である。これらの調節領域は、特異的ヒストン修飾、転写因子および補因子結合、およびクロマチン接近可能性などの特定のクロマチン特徴によって特徴づけられ、いくつかの細胞タイプ1,2,3 においてそのゲノムワイド同定に広く使用されている。特に、ヒストンH3リジン27(H3K27ac)のアセチル化のゲノムワイドプロファイルは、一般に、活性プロモーター、エンハンサーおよびスーパーエンハンサー4,5,6を定義するために使用される。

モロニーマウス白血病ウイルス(MLV)は、遺伝子に広く使用されているガンマ – レトロウイルスである哺乳動物細胞での転移。標的細胞を感染させた後、レトロウイルスRNAゲノムは、ウイルスおよび細胞タンパク質に結合して、前組み込み複合体(PIC)を構築する二本鎖DNA分子に逆転写される。 PICは核に入り、宿主細胞のクロマチンに結合する。ここで、重要なPIC成分であるウィルスインテグラーゼは、プロウイルスDNAの宿主細胞ゲノムへの組み込みを媒介する。ゲノムDNAにおけるmLVの組込みは、ランダムではなく、細胞特異的様式で、プロモーターおよびエンハンサーのような活性なシス調節エレメントにおいて起こる(7,8,9,10)。この特有の組込みプロファイルは、mLVインテグラーゼと細胞ブロモドメインおよび外胚葉ドメイン(BET)タンパク質11,12,13との間の直接的相互作用によって媒介される。 BETタンパク質(BRD2、BRD3、およびBRD4)は、宿主のクロマチンとmLV PICとの間の橋渡しとして作用する:それらのブロモドメインを介して、高度にアセチル化されたシス調節領域を認識するが、外側のドメインはmLVインテグラーゼ11,12,13と相互作用する。

ここでは、mLVの統合特性に基づいて活性なシス調節領域をマッピングするための新規ツールであるレトロウイルススキャニングについて説明します。簡潔に述べると、細胞は、増強緑色蛍光タンパク質(eGFP)レポーター遺伝子を発現するmLV由来レトロウイルスベクターで形質導入される。ゲノムDNA抽出後、mLVベクターの3 '末端反復配列(LTR)とゲノムDNAとの間の接合部をリンカー媒介PCR(LM-PCR)によって増幅し、大量配列決定する。 mLV組み込み部位はヒトゲノムにマッピングされ、mLVによって高度に標的化されるゲノム領域はmLV組み込み部位のクラスターとして定義される。

レトロウイルススキャンいくつかのヒト初代細胞14,15 において、細胞特異的活性調節エレメントを定義するために使用された。エピジェネティックに定義されたプロモーターおよびエンハンサー(ほとんどがH3K27acなどの活性ヒストンマークを有し、細胞特異的である)と共マップされたmLVクラスターである。レトロウイルススキャニングは、前向きに単離された細胞集団7,14、ならびにケラチノサイト幹細胞のような遡及的に規定された細胞集団において、将来の単離のための有効なマーカーを欠くゲノムワイドな同定を可能にする15

Protocol

1.ヒト細胞のMLV形質導入 標的細胞を単離し、eGFPレポーター遺伝子を有し、水疱性口内炎ウイルスG(VSV-G)または両性エンベロープ糖タンパク質16でシュードタイピングしたmLV由来レトロウイルスベクターでそれらを形質導入する。 以下の分析のために、偽形質導入細胞を陰性対照として保つ。 mLVベースのレトロウイルスベクターは効率的に分裂?…

Representative Results

レトロウイルススキャニング手順のワークフローレトロウイルススキャニング手順のワークフローは図1に図式化されています。標的細胞集団を精製し、eGFPレポーター遺伝子を発現するmLV由来のレトロウイルスベクターで形質導入する。導入遺伝子には、2つの同一の長い末端反復…

Discussion

ここでは、クロマチン領域を標的とするレトロウイルスであるmLVの組込み部位のゲノムワイドマッピングのためのプロトコールについて記載し、活性化プロモーターおよびエンハンサーとしてエピジェネティックにマークした。プロトコルの重要なステップおよび/または限界には、(i)標的細胞集団のmLV形質導入; (ii)LM-PCRによるウイルス – 宿主接合部の増幅; (iii)集積部位の高い割合?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、イタリア教育省、大学および研究省(FIRB-Futuro in Ricerca 2010-RBFR10OS4G、FIRB-Futuro in Ricerca 2012-RBFR126B8I_003)の欧州研究評議会(ERC-2010-AdG、GT-SKIN) 、EPIGEN Epigenomics Flagship Project)、イタリア保健省(若手研究者は2011年GR-2011-02352026)、Imagine Institute Foundation(フランス、パリ)があります。

Materials

PBS, pH 7.4 ThermoScientific 10010031 or equivalent
Fetal Bovine Serum ThermoScientific 16000044 or equivalent
0.2 ml tubes general lab supplier
1.5 ml tubes general lab supplier
QIAGEN QIAmp DNA mini Kit  QIAGEN 51306 or equivalent
T4 DNA ligase  New England BioLabs M0202T
T4 DNA Ligase Reaction buffer New England BioLabs M0202T
Linker Plus Strand oligonucleotide general lab supplier 5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’  (Purification grade: SDS-PAGE)
Linker Minus Strand oligonucleotide general lab supplier 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (Purification grade: SDS-PAGE)
Tru9I Roche-Sigma-Aldrich 11464825001
SuRE/Cut Buffer M Roche-Sigma-Aldrich 11417983001
PstI  Roche-Sigma-Aldrich 10798991001
SuRE/Cut Buffer H Roche-Sigma-Aldrich 11417991001
Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity  Invitrogen 11304011
10mM dNTP Mix Invitrogen 18427013 or equivalent
PCR grade water general lab supplier
96-well thermal cycler (with heated lid) general lab supplier
linker primer general lab supplier 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (Purification grade: PCR grade)
MLV-3’ LTR primer general lab supplier 5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (Purification grade: PCR grade)
linker nested primer 454 general lab supplier 5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE)
MLV-3’ LTR nested primer 454 general lab supplier 5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE)
linker nested primer Illumina general lab supplier 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE)
MLV-3’ LTR nested primer Illumina general lab supplier 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE)
Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2 general lab supplier
Ethanol (absolute) for molecular biology Sigma-Aldrich E7023 or equivalent
Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector) Invitrogen K4500-01
QIAquick Gel Extraction kit QIAGEN 28704
Agarose Sigma-Aldrich A9539 or equivalent
Ethidium bromide  Sigma-Aldrich E1510 or equivalent
100 bp DNA ladder Invitrogen 15628019 or equivalent
6X Loading Buffer ThermoScientific R0611 or equivalent
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer ThermoScientific ND-2000
Nextera XT Index kit Illumina FC-131-1001 or FC-131-1002
2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix  KAPA Biosystems KK2601
Dynal magnetic stand for 2 ml tubes Invitrogen 12321D or equivalent
Agencourt AMPure XP 60 ml kit Beckman Coulter Genomics A63881
Tris-HCl 10 mM, pH 8.5 general lab supplier
Agilent 2200 TapeStation system Agilent Technologies G2964AA or equivalent
D1000 ScreenTape Agilent Technologies 5067-5582 or equivalent
D1000 Reagents Agilent Technologies 5067-5583 or equivalent
KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism) KAPA Biosystems KK4835
ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems 4329003
NaOH 1.0 N, molecular biology-grade general lab supplier
HT1 (Hybridization Buffer) Illumina  Provided in the MiSeq Reagent Kit
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles) Illumina MS-102-3001
MiSeq System Illumina SY-410-1003
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001

References

  1. Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
  2. Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nat Rev Genet. 15 (4), 272-286 (2014).
  3. Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  4. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  5. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  6. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  7. Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites identifies active regulatory elements in human multipotent hematopoietic progenitors. Blood. 116 (25), 5507-5517 (2010).
  8. Biasco, L., et al. Integration profile of retroviral vector in gene therapy treated patients is cell-specific according to gene expression and chromatin conformation of target cell. EMBO Mol Med. 3 (2), 89-101 (2011).
  9. De Ravin, S. S., et al. Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration. J Virol. 88 (8), 4504-4513 (2014).
  10. LaFave, M. C., et al. mLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters. Nucleic Acids Res. 42 (7), 4257-4269 (2014).
  11. Gupta, S. S., et al. Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration. J Virol. 87 (23), 12721-12736 (2013).
  12. Sharma, A., et al. BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 12036-12041 (2013).
  13. De Rijck, J., et al. The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites. Cell reports. 5 (4), 886-894 (2013).
  14. Romano, O., et al. Transcriptional, epigenetic and retroviral signatures identify regulatory regions involved in hematopoietic lineage commitment. Sci Rep. 6, 24724 (2016).
  15. Cavazza, A., et al. Dynamic Transcriptional and Epigenetic Regulation of Human Epidermal Keratinocyte Differentiation. Stem Cell Reports. 6 (4), 618-632 (2016).
  16. Miller, A. D., Law, M. F., Verma, I. M. Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene. Mol Cell Biol. 5 (3), 431-437 (1985).
  17. Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites defines the fate of allogeneic T cells after donor lymphocyte infusion. PLoS One. 5 (12), e15688 (2010).
  18. Aiuti, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151 (2013).
  19. Biffi, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy benefits metachromatic leukodystrophy. Science. 341 (6148), 1233158 (2013).
  20. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
  21. Gillet, N. A., et al. The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones. Blood. 117 (11), 3113-3122 (2011).

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Cite This Article
Romano, O., Cifola, I., Poletti, V., Severgnini, M., Peano, C., De Bellis, G., Mavilio, F., Miccio, A. Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions. J. Vis. Exp. (123), e55919, doi:10.3791/55919 (2017).

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