Summary

Escaneo Retroviral: Mapeo de sitios de integración MLV para definir regiones reguladoras específicas de células

Published: May 28, 2017
doi:

Summary

Aquí, describimos un protocolo para el genoma de la cartografía de los sitios de integración Moloney murino leucemia virus basados ​​en retrovirus vectores en células humanas.

Abstract

Los vectores retrovirales basados ​​en virus de la leucemia murina de Moloney (MLV) se integran predominantemente en potenciadores y promotores acetilados. Por esta razón, los sitios de integración mLV pueden usarse como marcadores funcionales de elementos reguladores activos. Aquí, presentamos una herramienta de exploración retroviral, que permite la identificación a nivel genoma de potenciadores y promotores específicos de células. En resumen, la población de células diana se transduce con un vector derivado de mLV y el ADN genómico se digiere con una enzima de restricción de corte frecuente. Después de la ligación de fragmentos genómicos con un enlazador de ADN compatible, la reacción en cadena de polimerasa mediada por enlazador (LM-PCR) permite la amplificación de las uniones genómicas virus-huésped. La secuenciación masiva de los amplicones se utiliza para definir el perfil de integración de mLV en todo el genoma. Finalmente, se definen grupos de integraciones recurrentes para identificar regiones reguladoras específicas de células, responsables de la activación de programas transcripcionales específicos de tipo celular.

<p class= "Jove_content"> La herramienta de exploración retroviral permite la identificación en todo el genoma de promotores y potenciadores específicos de células en poblaciones de células diana prospectivamente aisladas. En particular, el escáner retroviral representa una técnica instrumental para la identificación retrospectiva de poblaciones raras ( por ejemplo, células madre somáticas) que carecen de marcadores robustos para el aislamiento prospectivo.

Introduction

La identidad celular se determina mediante la expresión de conjuntos específicos de genes. El papel de los elementos reguladores cis, tales como promotores y potenciadores, es crucial para la activación de programas de transcripción específicos de tipo celular. Estas regiones reguladoras se caracterizan por características específicas de la cromatina, tales como modificaciones peculiares de las histonas, factores de transcripción y unión de co-factores, y accesibilidad a la cromatina, que han sido ampliamente utilizados para su identificación genómica en varios tipos de células 1 , 2 , 3 . En particular, el perfil genómico de la acetilación de histona H3 lisina 27 (H3K27ac) se utiliza comúnmente para definir promotores activos, potenciadores y super-potenciadores 4 , 5 , 6 .

El virus de la leucemia murina de Moloney (MLV) es un gamma-retrovirus que es ampliamente utilizado para el genTransferencia en células de mamíferos. Después de infectar una célula diana, el genoma del ARN retroviral se retrotranscribe en una molécula de ADN de doble cadena que se une a las proteínas víricas y celulares para ensamblar el complejo de preinteligencia (PIC). El PIC entra en el núcleo y se une a la cromatina de la célula huésped. En este caso, la integrasa viral, un componente clave de PIC, media la integración del ADN proviral en el genoma de la célula huésped. MlV integración en el ADN genómico no es al azar, pero se produce en elementos activos cis-reguladores, tales como promotores y potenciadores, en una célula de forma específica 7 , 8 , 9 , 10 . Este peculiar perfil de integración está mediada por una interacción directa entre la integrasa mLV y las proteínas celulares de bromodominio y dominio extraterminal (BET) 11 , 12 , 13 . Las proteínas BET (BRD2, BRD3 yBRD4) actúan como puente entre la cromatina del huésped y el PIC mlV: a través de sus bromodominios reconocen regiones cis-reguladoras altamente acetiladas, mientras que el dominio extraterminal interactúa con la integrasa mLV 11 , 12 , 13 .

Aquí, describimos el escaneo retroviral, una herramienta novedosa para mapear regiones reguladoras cis-activas basadas en las propiedades de integración de mLV. Brevemente, las células se transducen con el vector retroviral derivado de mlV que expresa el gen indicador de proteína fluorescente verde (eGFP) mejorada. Después de la extracción del ADN genómico, las uniones entre la repetición terminal larga (LTR) de 3 'del vector mlV y el ADN genómico se amplifican mediante PCR (LM-PCR) mediada por enlazadores y se secuencian masivamente. MlV sitios de integración se asignan al genoma humano y las regiones genómicas altamente objetivo de mLV se definen como grupos de mlV sitios de integración.

Escaneo retroviralNing se utilizó para definir la célula específica de los elementos reguladores activos en varias células primarias humanas [ 14 , 15] . MlV clusters co-mapeados con epigenéticamente definidos promotores y potenciadores, la mayoría de los cuales albergan histonas marcas activas, como H3K27ac, y fueron específicos de células. El escaneo retroviral permite la identificación en todo el genoma de los elementos reguladores del ADN en poblaciones de células purificadas prospectivamente 7,14 , así como en poblaciones celulares definidas de forma retrospectiva, como las células madre de queratinocitos, que carecen de marcadores efectivos para el aislamiento prospectivo 15 .

Protocol

1. Transducción MLV de células humanas Aislar las células diana y transducirlos con un vector retroviral derivado de mlV que alberga el gen reportero eGFP y pseudotipado con el virus de la estomatitis vesicular G (VSV-G) o la glicoproteína de la envoltura anfotrópica 16 . Mantenga las células simuladas transducidas como un control negativo para los siguientes análisis. Dado que los vectores retrovirales basados ​​en mLV pueden transducir células qu…

Representative Results

Flujo de trabajo del procedimiento de exploración retroviral El flujo de trabajo del procedimiento de exploración retroviral se esquematiza en la Figura 1 . La población de células diana se purifica y transduce con un vector retroviral derivado de mlV que expresa un gen informador eGFP. El transgén está flanqueado por las dos repeticiones terminales largas idénticas (5 'y 3' LTR), aseg…

Discussion

Aquí, hemos descrito un protocolo para el genoma de la cartografía de los sitios de integración de mLV, un retrovirus que las regiones de la cromatina objetivo, epigenéticamente marcado como promotores activos y potenciadores. Los pasos críticos y / o limitaciones del protocolo incluyen: (i) transducción mLV de la población de células diana; (Ii) amplificación de las uniones huésped-virus por LM-PCR; (Iii) recuperación de una alta fracción de sitios de integración. Los vectores retrovirales basados ​​en…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Consejo Europeo de Investigación (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), el Ministerio Italiano de Educación, Universidades e Investigación (FIRB-Futuro en Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro en Ricerca 2012-RBFR126B8I_003 , EPIGEN Epigenomics Flagship Project), el Ministerio Italiano de Salud (Jóvenes Investigadores llaman 2011 GR-2011-02352026) y la Imagine Institute Foundation (París, Francia).

Materials

PBS, pH 7.4 ThermoScientific 10010031 or equivalent
Fetal Bovine Serum ThermoScientific 16000044 or equivalent
0.2 ml tubes general lab supplier
1.5 ml tubes general lab supplier
QIAGEN QIAmp DNA mini Kit  QIAGEN 51306 or equivalent
T4 DNA ligase  New England BioLabs M0202T
T4 DNA Ligase Reaction buffer New England BioLabs M0202T
Linker Plus Strand oligonucleotide general lab supplier 5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’  (Purification grade: SDS-PAGE)
Linker Minus Strand oligonucleotide general lab supplier 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (Purification grade: SDS-PAGE)
Tru9I Roche-Sigma-Aldrich 11464825001
SuRE/Cut Buffer M Roche-Sigma-Aldrich 11417983001
PstI  Roche-Sigma-Aldrich 10798991001
SuRE/Cut Buffer H Roche-Sigma-Aldrich 11417991001
Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity  Invitrogen 11304011
10mM dNTP Mix Invitrogen 18427013 or equivalent
PCR grade water general lab supplier
96-well thermal cycler (with heated lid) general lab supplier
linker primer general lab supplier 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (Purification grade: PCR grade)
MLV-3’ LTR primer general lab supplier 5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (Purification grade: PCR grade)
linker nested primer 454 general lab supplier 5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE)
MLV-3’ LTR nested primer 454 general lab supplier 5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE)
linker nested primer Illumina general lab supplier 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE)
MLV-3’ LTR nested primer Illumina general lab supplier 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE)
Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2 general lab supplier
Ethanol (absolute) for molecular biology Sigma-Aldrich E7023 or equivalent
Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector) Invitrogen K4500-01
QIAquick Gel Extraction kit QIAGEN 28704
Agarose Sigma-Aldrich A9539 or equivalent
Ethidium bromide  Sigma-Aldrich E1510 or equivalent
100 bp DNA ladder Invitrogen 15628019 or equivalent
6X Loading Buffer ThermoScientific R0611 or equivalent
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer ThermoScientific ND-2000
Nextera XT Index kit Illumina FC-131-1001 or FC-131-1002
2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix  KAPA Biosystems KK2601
Dynal magnetic stand for 2 ml tubes Invitrogen 12321D or equivalent
Agencourt AMPure XP 60 ml kit Beckman Coulter Genomics A63881
Tris-HCl 10 mM, pH 8.5 general lab supplier
Agilent 2200 TapeStation system Agilent Technologies G2964AA or equivalent
D1000 ScreenTape Agilent Technologies 5067-5582 or equivalent
D1000 Reagents Agilent Technologies 5067-5583 or equivalent
KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism) KAPA Biosystems KK4835
ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems 4329003
NaOH 1.0 N, molecular biology-grade general lab supplier
HT1 (Hybridization Buffer) Illumina  Provided in the MiSeq Reagent Kit
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles) Illumina MS-102-3001
MiSeq System Illumina SY-410-1003
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001

References

  1. Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
  2. Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nat Rev Genet. 15 (4), 272-286 (2014).
  3. Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  4. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  5. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  6. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  7. Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites identifies active regulatory elements in human multipotent hematopoietic progenitors. Blood. 116 (25), 5507-5517 (2010).
  8. Biasco, L., et al. Integration profile of retroviral vector in gene therapy treated patients is cell-specific according to gene expression and chromatin conformation of target cell. EMBO Mol Med. 3 (2), 89-101 (2011).
  9. De Ravin, S. S., et al. Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration. J Virol. 88 (8), 4504-4513 (2014).
  10. LaFave, M. C., et al. mLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters. Nucleic Acids Res. 42 (7), 4257-4269 (2014).
  11. Gupta, S. S., et al. Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration. J Virol. 87 (23), 12721-12736 (2013).
  12. Sharma, A., et al. BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 12036-12041 (2013).
  13. De Rijck, J., et al. The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites. Cell reports. 5 (4), 886-894 (2013).
  14. Romano, O., et al. Transcriptional, epigenetic and retroviral signatures identify regulatory regions involved in hematopoietic lineage commitment. Sci Rep. 6, 24724 (2016).
  15. Cavazza, A., et al. Dynamic Transcriptional and Epigenetic Regulation of Human Epidermal Keratinocyte Differentiation. Stem Cell Reports. 6 (4), 618-632 (2016).
  16. Miller, A. D., Law, M. F., Verma, I. M. Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene. Mol Cell Biol. 5 (3), 431-437 (1985).
  17. Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites defines the fate of allogeneic T cells after donor lymphocyte infusion. PLoS One. 5 (12), e15688 (2010).
  18. Aiuti, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151 (2013).
  19. Biffi, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy benefits metachromatic leukodystrophy. Science. 341 (6148), 1233158 (2013).
  20. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
  21. Gillet, N. A., et al. The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones. Blood. 117 (11), 3113-3122 (2011).

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Romano, O., Cifola, I., Poletti, V., Severgnini, M., Peano, C., De Bellis, G., Mavilio, F., Miccio, A. Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions. J. Vis. Exp. (123), e55919, doi:10.3791/55919 (2017).

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