Lokalisering af odorantreceptorgener i locustantennet af RNA<em> I situ</em> Hybridisering
Summary
I dette papir beskrives en detaljeret og yderst effektiv RNA in situ hybridiseringsprotokol, især til lavniveau udtrykte odorantreceptor (OR) gener såvel som andre gener i insektantenner ved anvendelse af digoxigenin (DIG) -mærkede eller biotin-mærkede prober.
Abstract
Insekter har udviklet sofistikerede olfaktoriske modtagelsessystemer til at mærke eksogene kemiske signaler. Disse kemiske signaler transduceres af Olfactory Receptor Neurons (ORN), der er anbragt i hårlignende strukturer, kaldet chemosensilla, af antennerne. På ORN'ernes membraner antages lugtstofreceptorer (OR'er) at være involveret i lugtkodning. Derfor er det nødvendigt at identificere gener, der er lokaliseret til ORN'erne, for at genkende OR-gener og tilvejebringe et grundlæggende grundlag for yderligere funktionelle in situ- undersøgelser. RNA-ekspressionsniveauerne for specifikke OR'er i insektantenner er meget lave, og bevarelse af insektvæv til histologi er udfordrende. Det er således vanskeligt at lokalisere en OR til en bestemt type sensilla ved anvendelse af RNA in situ- hybridisering. I dette papir introduceres en detaljeret og yderst effektiv RNA in situ- hybridiseringsprotokol, især for lavt udtrykte OR-gener af insekter. Derudover er en specifik OR Gen waS identificeret ved at udføre dobbeltfarve fluorescerende in situ hybridiseringsforsøg under anvendelse af et co-ekspressionsreceptorgen, Orco , som en markør.
Introduction
Insektantenner, som er de vigtigste kemosensoriske organer, er dækket af mange hårlignende strukturer – kaldet sensilla – som er inderveret af Olfactory Receptor Neurons (ORNs). På membranet af insekt-ORN'er udtrykkes odorantreceptorer (OR'er), en type protein, der indeholder syv transmembrane domæner, med en coreceptor (ORco) til dannelse af en heteromer, der virker som en lugtgated ionkanal 1 , 2 , 3 . Forskellige OR'er reagerer på forskellige kombinationer af kemiske forbindelser 4 , 5 , 6 .
Locusts ( Locusta migratoria ) er hovedsagelig afhængige af olfaktoriske signaler for at udløse vigtige adfærd 7 . Locust ORs er nøglefaktorer for forståelse af molekylære olfaktoriske mekanismer. Lokalisering af et specifikt locust OR-gen til neuronen af aMorfologisk specifik sensillum type ved RNA In situ Hybridization (RNA ISH) er det første skridt i at udforske ORs-funktionen.
RNA ISH bruger en mærket komplementær RNA-probe til at måle og lokalisere en specifik RNA-sekvens i en del af væv, celler eller hele monteringer in situ , hvilket giver indsigt i fysiologiske processer og sygdomspatogenese. Digoxigenin-mærkede (DIG-mærkede) og biotin-mærkede RNA-prober er blevet anvendt i vid udstrækning i RNA-hybridisering. RNA-mærkning med digoxigenin-11-UTP eller biotin-16-UTP kan fremstilles ved in vitro- transkription med SP6- og T7-RNA-polymeraser. DIG- og biotin-mærkede RNA-prober har følgende fordele: ikke-radioaktive; sikker; stabil; Meget følsomme Meget specifikke; Og nem at producere ved hjælp af PCR og in vitro transkription. DIG- og biotin-mærkede RNA-prober kan være kromogeniske og påvises fluorescens. DIG-mærkede RNA-prober kan detekteres med anti-digoxigeninalkaliNe-fosfatase (AP) -konjugerede antistoffer, der kan visualiseres enten med det højst følsomme kemiluminescerende substrater nitroblue tetrazoliumchlorid / 5-brom-4-chlor-3-indolylphosphattoluinsalt (NBT / BCIP) ved anvendelse af et optisk mikroskop eller med 2 -hydroxy-3-naphthosyre-2'-phenylanilidphosphat (HNPP) koblet med 4-chlor-2-methylbenzenedizoniumhemi-zinkchloridsalt (Fast Red) under anvendelse af et konfokalt mikroskop. Biotin-mærkede RNA-prober kan påvises med anti-biotin streptavidin Hest Radish Peroxidase (HRP) -konjugerede antistoffer, der kan visualiseres med fluorescein-tyramider under anvendelse af et konfokalt mikroskop. Således kan dobbeltfarve fluorescerende in situ hybridisering udføres for at detektere to målgener i et skive ved anvendelse af DIG- og biotin-mærkede RNA-prober.
RNA ISH med DIG- og / eller biotin-mærkede prober har med succes været anvendt til at lokalisere olfaktorrelaterede gener, såsom OR , ionotrop receptor, lugtstofbindende proteinOg sensorisk neuronmembranprotein i insektantenner af, men ikke begrænset til, Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria og ørkensprutten Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Der er imidlertid to væsentlige udfordringer ved udførelse af RNA ISH for insekt-OR'er: (1) ELLER (undtagen ORco ) udtrykkes i lave niveauer og kun i nogle få celler, hvilket gør signaldetektion meget vanskelig, og (2) bevarelse af insektvæv til Histologi, sådan at morfologien bevares og baggrundsstøjen er lav, kan være udfordrende. I dette papir beskrives en detaljeret og effektiv protokol, der beskriver RNA ISH til lokalisering af OR-gener i insektAntenner er præsenteret, herunder både kromogen og tyramid signalforstærkning (TSA) detektion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er svært at udføre RNA ISH for at lokalisere OR-gener i insektantenner, fordi ekspressionsniveauerne af OR-gener, undtagen ORco , er meget lave og bevaring af histologiske skiver af insektantenner er meget vanskeligt. Derudover er TSA-detektion også meget vanskelig. For at løse disse problemer bør følgende foranstaltninger træffes. Antennene er valgt fra nyligt smeltende voksne græshoppe, der har tynde og bløde antennalskiklinger, som bevarer deres morfologi på glideren. De frosne prøver er snitt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde støttes af et tilskud fra National Natural Science Foundation of China (No.31472037). Omtale af handelsnavne eller kommercielle produkter i denne artikel er udelukkende med det formål at levere specifikke oplysninger og indebærer ikke en anbefaling.
Materials
| Materials | |||
| 2×TSINGKETM Master Mix | TSINGKE, China | TSE004 | |
| RNase-free H2O | TIANGEN, China | RT121-02 | |
| REGULAR AGAROSE G-10 | BIOWEST, SPAIN | 91622 | |
| Binding buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Balance buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Wash solution | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| T Vector | Promega, USA | A362A | |
| T4 DNA Ligase | Promega, USA | M180A | |
| Escherichia coli DH5α | TIANGEN, China | CB101 | |
| Ampicillin | Sigma, USA | A-6140 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Inalco, USA | 1758-1400 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | SBS Genetech, China | GX1-500 | |
| Nco I | BioLabs, New England | R0193S | |
| Spe I | BioLabs, New England | R0133M | |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| Biotin RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11685597910 | |
| DNase | DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| LiCl | Sinopharm, China | 10012718 | |
| Ethanol | Sinopharm, China | 10009257 | |
| Acetic acid | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands | 4583 | |
| Slides | TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China | FISH0010 | |
| HCl | Sinopharm, China | 80070591 | |
| Millex | Millipore, USA | SLGP033RS | |
| Tween 20 | AMRESCO, USA | 0777-500ML | |
| Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt | Roche, Switzerland | 11175041910 | |
| Glycerol | Sinopharm, China | 10010618 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | V900483-1KG | 0.04mol/L Tris-Base |
| 1×Tris-acetate-EDTA | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | 0.12%acetic acid |
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | 03677 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | Sinopharm, China | 10019392 | 10g/L NaCl |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM335231 | 10g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM361526 | 5g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | Sinopharm, China | 10019392 | 10g/L NaCl |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM335231 | 10g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM361526 | 5g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | WISENT ING, Canada | 800-010-CG | 15g/L Agar Bacteriological Grade |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sinopharm, China | 10019392 | 8.5%NaCl |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sigma, USA | V900041-500G | 14mM KH2PO4 |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sigma, USA | V900268-500G | 80mM Na2HPO4 |
| 10×Tris buffered saline (pH7.5) | Sigma, USA | V900483-1KG | 1M Tris-Base |
| 10×Tris buffered saline (pH7.5) | Sinopharm, China | 10019392 | 1.5M NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sigma, USA | V900483-1KG | 100mM Tris-Base |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sinopharm, China | 10019392 | 100mM NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sigma, USA | V900020-500G | 50mM MgCl2·6H2O |
| 20×saline-sodium citrate (pH7.0) | Sinopharm, China | 10019392 | 3M NaCl |
| 20×saline-sodium citrate (pH7.0) | Sigma, USA | V900095-500G | 0.3M Na-Citrate |
| 4% paraformaldehyde solution (pH9.5) | Sigma, USA | V900894-100G | 4% paraformaldehyde |
| 4% paraformaldehyde solution (pH9.5) | Sigma, USA | V900182-500G | 0.1M NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH10.2) | Sigma, USA | V900182-500G | 80mM NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH10.2) | Sigma, USA | S7795-500G | 120mM Na2CO3 |
| Formamide Solution (pH10.2) | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Formamide Solution (pH10.2) | 5×saline-sodium citrate | ||
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1% Blot |
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | AMRESCO, USA | 0694-500ML | 0.03% Triton X-100 |
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | 1×Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase solution | Blocking Buffer in Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Blocking Buffer in Tris buffered saline | ||
| Hybridization Buffer | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Hybridization Buffer | 2×saline-sodium citrate | ||
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D8906-50G | 10% dextran sulphate |
| Hybridization Buffer | invitrogen, USA | AM7119 | 20 µg/ml yeast t-RNA |
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D3159-10G | 0.2 mg/ml herring sperm DNA |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10mg/ml) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25mg/ml) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Detection Buffer | ||
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 2% fluorescein-tyramides |
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | Amplification Diluent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | |||
| Freezing microtome | Leica, Nussloch, Germany | Jung CM300 cryostat | |
| Spectrophotometer | Thermo SCIENTIFIC, USA | NANODROP 2000 | |
| Optical microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus IX71microscope | |
| Confocal microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus BX45 confocal microscope |
References
- Sato, K., et al. Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels. Nature. 452 (7190), 1002-1006 (2008).
- Smart, R., et al. Drosophila odorant receptors are novel seven transmembrane domain proteins that can signal independently of heterotrimeric G proteins. Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 770-780 (2008).
- Wicher, D., et al. Drosophila odorant receptors are both ligand-gated and cyclic-nucleotide-activated cation channels. Nature. 452 (7190), 1007-1011 (2008).
- Carey, A. F., Wang, G., Su, C. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464 (7258), 66-71 (2010).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Wang, G., Carey, A. F., Carlson, J. R., Zwiebel, L. J. Molecular basis of odor coding in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4418-4423 (2010).
- Hassanali, A., Njagi, P. G., Bashir, M. O. Chemical ecology of locusts and related acridids. Annu Rev Entomol. 50, 223-245 (2005).
- Schaeren-Wiemers, N., Gerfin-Moser, A. A single protocol to detect transcripts of various types and expression levels in neural tissue and cultured cells: in situ hybridization using digoxigenin-labeled cRNA probes. Histochemistry. 100 (6), 431-440 (1993).
- Vosshall, L. B., Amrein, H., Morozov, P. S., Rzhetsky, A., Axel, R. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96 (5), 725-736 (1999).
- Yang, Y., Krieger, J., Zhang, L., Breer, H. The olfactory co-receptor Orco from the migratory locust (Locusta migratoria) and the desert locust (Schistocerca gregaria): identification and expression pattern. Int J Biol Sci. 8 (2), 159-170 (2012).
- Schultze, A., et al. The co-expression pattern of odorant binding proteins and olfactory receptors identify distinct trichoid sensilla on the antenna of the malaria mosquito Anopheles gambiae. PLoS One. 8 (7), e69412 (2013).
- Xu, H., Guo, M., Yang, Y., You, Y., Zhang, L. Differential expression of two novel odorant receptors in the locust (Locusta migratoria). BMC Neurosci. 14, 50 (2013).
- Saina, M., Benton, R. Visualizing olfactory receptor expression and localization in Drosophila. Methods Mol Biol. 1003, 211-228 (2013).
- Guo, M., Krieger, J., Große-Wilde, E., Mißbach, C., Zhang, L., Breer, H. Variant ionotropic receptors are expressed in olfactory sensory neurons of coeloconic sensilla on the antenna of the desert locust (Schistocerca gregaria). Int J Biol Sci. 10 (1), 1-14 (2013).
- You, Y., Smith, D. P., Lv, M., Zhang, L. A broadly tuned odorant receptor in neurons of trichoid sensilla in locust, Locusta migratoria. Insect Biochem Mol Biol. 79, 66-72 (2016).
- Jiang, X., Pregitzer, P., Grosse-Wilde, E., Breer, H., Krieger, J. Identification and characterization of two “Sensory Neuron Membrane Proteins” (SNMPs) of the desert locust, Schistocerca gregaria (Orthoptera: Acrididae). J Insect Sci. 16 (1), 33 (2016).
- Angerer, L. M., Angerer, R. C., Wilkinson, D. G. In situ. hybridization to cellular RNA with radiolabelled RNA probes. In situ hybridization. , 2 (1992).
- Komminoth, P., Merk, F. B., Leav, I., Wolfe, H. J., Roth, J. Comparison of 35S- and digoxigenin-labeled RNA and oligonucleotide probes for in situ hybridization. Expression of mRNA of the seminal vesicle secretion protein II and androgen receptor genes in the rat prostate. Histochemistry. 98 (4), 217-228 (1992).
- Leary, J. J., Brigati, D. J., Ward, D. C. Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (13), 4045-4049 (1983).
- Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Cell. 117 (7), 965-979 (2004).
- Jones, W. D., Nguyen, T. A., Kloss, B., Lee, K. J., Vosshall, L. B. Functional conservation of an insect odorant receptor gene across 250 million years of evolution. Curr Biol. 15 (4), R119-R121 (2005).
