Summary
В этой статье описывается подробный и высокоэффективный протокол гибридизации РНК in situ, в частности, для низкоуровневых экспрессированных генов одорантного рецептора (OR), а также других генов у антенн насекомых с использованием меток дигоксигенина (DIG) или меченых биотином.
Abstract
Насекомые развили сложные системы обонятельного приема, чтобы ощущать экзогенные химические сигналы. Эти химические сигналы трансдуцируются ольфакторными рецепторными нейронами (ORN), расположенными в волоскоподобных структурах, называемых хемосензиллами антенн. На мембранах ORNs, считается, что рецепторы одорантов (ORs) участвуют в кодировании запаха. Таким образом, способность идентифицировать гены, локализованные в ORN, необходима для распознавания OR генов и обеспечивает фундаментальную основу для дальнейших функциональных исследований in situ . Уровни экспрессии РНК специфических OR s в антеннах насекомых очень низки, а сохранение ткани насекомых для гистологии является сложной задачей. Таким образом, трудно локализовать OR на определенный тип сенсиллы, используя гибридизацию РНК in situ. В этой статье вводится подробный и высокоэффективный протокол гибридизации РНК in situ, особенно для слабо выраженных OR генов насекомых. Кроме того, конкретный OR Ген ваИдентифицированных путем проведения двухцветных флуоресцентных экспериментов по гибридизации in situ с использованием ко-экспрессирующего рецепторного гена Orco в качестве маркера.
Introduction
Насекомые-антенны, которые являются наиболее важными хемосенсорными органами, покрыты многими волоскоподобными структурами, называемыми сенсиллами, которые иннервируются обонятельными рецепторными нейронами (ОРН). На мембране ORN насекомых рецепторы одорантов (ORs), тип белка, содержащего семь трансмембранных доменов, экспрессируются с помощью корецептора (ORco) с образованием гетеромера, который функционирует как ионный канал 1 , 2 , 3 с одорантом. Различные ОР реагируют на различные комбинации химических соединений 4 , 5 , 6 .
Саранча ( Locusta migratoria ) в основном полагается на обонятельные сигналы, чтобы вызвать важные формы поведения 7 . Осколки саранчи являются ключевыми факторами для понимания механизмов молекулярного обоняния. Локализация определенного гена ORG саранчи к нейронуМорфологически специфический тип сенсиллиума с помощью РНК In Situ Hybridization (RNA ISH) является первым шагом в изучении функции ORs.
РНК ISH использует меченый комплементарный зонд РНК для измерения и локализации специфической последовательности РНК в секции ткани, клеток или целых опор на месте , обеспечивая понимание физиологических процессов и патогенеза болезни. Меченые дигоксигенином (DIG-меченые) и меченные биотином РНК-зонды широко использовались при гибридизации РНК. РНК-маркировка дигоксигенином-11-UTP или биотин-16-UTP может быть получена путем транскрипции in vitro с помощью РНК-полимераз SP6 и T7. DIG- и биотин-меченные РНК-зонды имеют следующие преимущества: нерадиоактивные; безопасно; стабильная; Высокочувствительный; Высокоспециализированный; И легко производить с использованием ПЦР и транскрипции in vitro . DIG- и биотин-меченные РНК-зонды могут быть хромогенными и флуоресцентными. DIG-меченые РНК-зонды могут быть обнаружены с помощью анти-дигоксигенина щелочиNe Phosphatase (AP) -конъюгированные антитела, которые могут быть визуализированы либо с помощью высокочувствительных хемилюминесцентных субстратов нитроилтетразолия хлорида / 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата толуидиновой соли (NBT / BCIP) с использованием оптического микроскопа или с 2 -гидрокси-3-нафтойной кислоты-2'-фениланилидфосфата (HNPP) в сочетании с хлоридом хлорида 4-хлор-2-метилбензолдиазония (Fast Red) с использованием конфокального микроскопа. Меченые биотином РНК-зонды могут быть обнаружены с анти-биотин-стрептавидином конъюгированной пероксидазой (HRP) -конъюгированными антителами, которые можно визуализировать с помощью флуоресцеин-тирамидов с использованием конфокального микроскопа. Таким образом, двухцветная флуоресцентная гибридизация in situ может быть выполнена для обнаружения двух генов-мишеней в одном срезе с использованием меченых DIG- и биотином РНК-зондов.
РНК ISH с DIG- и / или биотин-мечеными зондами успешно используется для локализации генов, связанных с обонятельной способностью, таких как OR , ионотропный рецептор, связывающий одорант белокИ мембранного белка сенсорной нейроны, в насекомых-антеннах, но не ограничиваясь ими, Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria и пустынной саранчи Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Однако при выполнении РНК ISH для ORS насекомых существуют две существенные проблемы: (1) OR гены (кроме ORco ) выражены на низких уровнях и только в нескольких клетках, что затрудняет обнаружение сигнала и (2) сохранение ткани насекомых для Гистологии, так что морфология сохраняется и фоновый шум является низким, может быть сложным. В этой статье представлен подробный и эффективный протокол, описывающий РНК ISH для локализации генов OR у насекомыхПредставлены антенны, в том числе обнаружение хромогенного и тирамидного сигналов (TSA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы ограничить разложение РНК, подготовьте растворы, используя влажную автоклавированную дистиллированную воду (при 121 ° C в течение 60 минут), а также материалы с мокрым автоклавом.
1. Получение РНК ISH-антисмысловых и чувствительных зондов
- Усиление амплификации гена и его очистка
- Сначала продуцируйте двухцепочечный фрагмент длиной 387 п.о. L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) из плазмиды, содержащей полноразмерную кДНК LmigOR1 с ДНК-полимеразой Taq, которая добавляет аденины к обоим концам фрагментов.
- Используйте Конечный объем реакционной смеси 100 мкл, содержащий 50 мкл реакционной смеси 2x, 4 мкл каждого из смысловых и антисмысловых праймеров (таблица 1), 1 мкл матрицы плазмиды, и 41 мкл РНКазы Н 2 О. Используйте следующие ПЦР Протокол: 94 ° С в течение 5 мин, затем 30 циклов 94 ° С в течение 30 с, 55 ° С в течение 30 с и 72 ° С в течение 1 мин, Затем 72 ° С в течение 10 мин.
- Повторите эти шаги для получения 1303 п.н. двухцепочечной фрагмент LmigOR2 (GenBank: JQ766966) и п.о. тысячу двести пятьдесят одна двухцепочечной фрагмент LmigORco (GenBank: JN989549). Праймеры, используемые в этих экспериментах, представлены в таблице 1 .
- Прогоняют продукты ПЦР на 1,2% агарозных гелях в 1 х буфере Трис-ацетат-ЭДТА и визуализируют, используя окрашивание бромидом этидия.
- Извлеките эти продукты ПЦР с помощью набора для экстракции гелем.
- Следуя электрофорезу, полоски акцизных ДНК из геля и поместите ломтики геля в пробирку объемом 1,5 мл. Затем добавьте 100 мкл связующего буфера (Buffer PN) на 0,1 г ломтика геля. Вихрь и инкубируйте при 50 ° C до полного растворения ломтика геля.
- Вставьте адсорбционную колонку CA2 в трубку для сбора и добавьте 500 мкл буфера баланса (буфер BL). Это улучшает способность абсорбции и стабильность мембраны диоксида кремния. CentriFuge при 12 400 xg в течение 1 мин.
- Перенесите растворенную гелевую смесь в узел адсорбционной колонны и инкубируйте при комнатной температуре в течение 2 мин. Затем центрифужные пробирки при 12 400 мкг в течение 1 мин. Откажитесь от проточной и повторно вставьте адсорбционную колонну в трубку для сбора.
- Добавляют 600 мкл промывочного раствора (добавленный этанол, буферный буфер) дважды. Центрифуга при 12 400 мкг в течение 1 мин. Сбросьте поток и вставьте адсорбционную колонну в сборную трубку.
- Опорожните сборную трубку и повторно центрифугируйте узел колонны на уровне 12 400 xg в течение 2 минут, чтобы дать испарение любого остаточного этанола.
- Тщательно переносите адсорбционную колонну в чистую пробирку для центрифуг 1,5 мл. Высушите на воздухе гранулу в течение 5-10 мин и повторно растворите ДНК в подходящем объеме ( например, 30 мкл) без нуклеазной воды.
- Инкубируйте при комнатной температуре в течение 2 мин. Центрифуга при 12 400 мкг в течение 2 мин. Откажитесь от адсорбционной колонки и храните ДНК при 4 ° C или -20 ° C.
- Сначала продуцируйте двухцепочечный фрагмент длиной 387 п.о. L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) из плазмиды, содержащей полноразмерную кДНК LmigOR1 с ДНК-полимеразой Taq, которая добавляет аденины к обоим концам фрагментов.
- Построить рекомбинантные плазмиды
- Индивидуально лигируют фрагмент 387 п.о. фрагмента LmigOR1 , 1303 пар оснований LmigOR2 и 1,251 bp фрагмента LmigORco в вектор T, который содержит промоторы для РНК-полимераз T7 (вверх по течению) и SP6 (ниже по течению), смежные с вставленной ДНК с использованием ДНК-лигазы T4. Приготовить следующую 10 мкл реакцию: 5 мкл 2х лигирующего буфера, 1 мкл T-вектора, 3 мкл (~ 100 нг) ДНК вставленного гена и 1 мкл ДНК-лигазы T4 и инкубировать O / N при 4 ° C.
- Добавьте 5 мкл каждой рекомбинантной плазмиды, содержащей фрагмент длиной 387 пар оснований LmigOR1 , 1303 bp фрагмента LmigOR2 и 1,251 bp фрагмента LmigORco отдельно в 50 мкл компетентных клеток DH5α Escherichia coli в стерильных пробирках объемом 1,5 мл.
- Смешайте осторожно и помещайте пробирки в лед в течение 30 мин, а затем инкубируйте их в течение 90 с при 42° С. Перенесите их обратно на лед в течение 3 мин.
- Добавьте 450 мкл жидкой среды Luria-Bertani (LB) без ампициллина в каждую пробирку и инкубируйте их в шейкере со скоростью 150 об / мин в течение 1 часа при 37 ° C, чтобы восстановить DH5α E. coli .
- Возьмите 100 мкл аликвоты каждого трансформанта и используйте их для инокуляции пластин с твердым субстратом LB, содержащих 50 мкг / мл ампициллина, 24 мкг / мл изопропил-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) и 40 мкг / мл 5-бром-4 -хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид (X-gal).
- Инкубируйте эти пластины в постоянном инкубаторе при 37 ° C в течение 18 часов. Экран целевых рекомбинантных плазмид с использованием сине-белого метода скрининга. Последовательность целевых рекомбинантных плазмид с использованием секвенирования Sanger и определение направлений вставки трех OR генов.
- Выберите рестрикционные эндонуклеазы для линеаризации рекомбинантных плазмид
- Использовать рестрикционные эндонуклеазы tHat не только переваривают в множественном клонирующем участке вектора, но также не режут ДНК-вставку. В этом эксперименте все 3 гена вставляются в Т-вектор в направлении, соответствующем вектору.
- Использовать эндонуклеазу рестрикции Nco I для линеаризации рекомбинантных плазмид, содержащих фрагмент 38mb LmigOR1 , 1303 bp фрагмента LmigOR2 и 1,251 bp фрагмента LmigORco для получения антисмысловых зондов. Используйте Spe I рестрикционную эндонуклеазу для получения зондовых зондов.
ПРИМЕЧАНИЕ. Если направление вставки соответствует направлению вектора, то для линеаризации рекомбинантной плазмиды выбран уникальный сайт рестрикции с конца Т7, а для получения антисмыслового зонда используется РНК-полимераза SP6. Уникальный сайт рестрикции с конца SP6 выбирают для линеаризации рекомбинантной плазмиды и используют РНК-полимеразу T7 для получения зонда. В противном случае, если направление вставки не соответствует tА затем уникальный сайт рестрикции с конца SP6 выбран для линеаризации рекомбинантной плазмиды, а для получения антисмыслового зонда используется РНК-полимераза Т7. Уникальный сайт рестрикции с конца Т7 выбирают для линеаризации рекомбинантной плазмиды, а РНК-полимеразу SP6 используют для получения зонда для зондирования.
- Очистка линеаризованных рекомбинантных плазмид
- Дайтел 20 мкг каждой из трех рекомбинантных плазмид, содержащих фрагмент 387 пар оснований LmigOR1 , 1 303 пар оснований фрагмента LmigOR2 и 1,251 bp фрагмента LmigORco с использованием эндонуклеазы рестрикции Nco I в 100 мкл реакции, которая содержит 10 мкл 10-бутового буфера, 40 мкл 0,5 мкг / мкл Плазмида, 3 мкл Nco I и 47 мкл РНКазы H 2 O, а затем 3 ч инкубации при 37 ° с.
- Аналогичным образом, дайджест 20 мкг каждой из этих трех рекомбинантных плазмид uПейте рестрикционную эндонуклеазу Spe I.
- Очистите эти расщепленные плазмиды с помощью набора для экстракции гелем, как описано в 1.1.2. Определите концентрации этих экстрагированных линеаризованных рекомбинантных плазмид с помощью спектрофотометрии и отрегулируйте до 0,5 мкг / мкл.
- Подготовьте антисмысловые и зондовые зонды
- Используйте транскрипцию транскрипции T7 / SP6 для генерации антисмысловых и сенсорных зондов. РНК-полимеразу SP6 используют для транскрибирования двухцепочечной РНК для меченых DIG- и биотином антисмысловых зондов для этих трех OR-генов с использованием линеаризованных рекомбинантных плазмид в качестве шаблонов in vitro . РНК-полимеразу T7 используют для создания зондовых зондов. Выполните реакцию в конечном объеме 20 мкл, содержащем 2 мкл 10-кратной NTP-смеси, 2 мкл 10X транскрипционного буфера, 1 мкл ингибитора РНКазы, 2 мкл РНК-полимеразы Т7 или SP6, 4 мкл линеаризованной плазмиды 0,5 мкг / мкл и 9 мкл RNase-free H 2 O, затемПри инкубации 3 ч при 37 ° С.
- Инкубируйте DIG- и биотин-меченые антисмысловые и зондовые зонды в течение 30 мин с 1 мкл ДНКазой при 37 ° C. Добавить 2,5 мкл 5 М LiCl и 75 мкл абсолютного этанола, затем инкубировать реакции в течение 30 мин при -70 ° С.
- Центрифугируют при 15000 мкг в течение 30 мин при 4 ° С. Тщательно декантируйте надосадочную жидкость. Добавьте 150 мкл 70% этанола для промывки осадителя. Подготовьте 70% этанол (1 л), добавив 95% этанола (736,8 мл) в стерильную дистиллированную воду (263,2 мл).
- Центрифугируют при 15000 × g в течение 30 мин при 4 ° С и высушивают на воздухе осадок в течение 5-10 мин при комнатной температуре. Добавьте 25 мкл РНКазы H 2 O для растворения РНК антисмысловых зондов.
- Если длина вставленного гена более 1 кб, то фрагменты РНК-антисмысловых и зондовых зондов до средней длины ~ 300 пар оснований путем инкубации в бикарбонатно-карбонатных буферных растворах. Выполните реакцию в конечном объеме 50 мкл, cПолучая 25 мкл зонда РНК и 25 мкл буферного раствора бикарбоната-карбоната (80 мМ NaHCO 3 , 120 мМ Na 2 CO 3 , pH 10,2) при 60 ° C. Требуемое время гидролиза дано ранее опубликованной формулой 17 .
- Добавьте 5 мкл 10% уксусной кислоты, чтобы остановить реакцию. В этом эксперименте фрагментируйте антисмысловые и смысловые зонды LmigOR2 и LmigORco в течение 24 и 23 мин соответственно.
T = (L o -L f ) / kXL o XL f
L o = начальные длины фрагментов в kb
L f = конечные длины фрагментов в kb
K = константа скорости гидролиза, приблизительно 0,11 кб -1 мин -1
T = время гидролиза в мин. - Наконец, добавьте 250 мкл буфера для гибридизации и храните при -80 ° C.
2. Подготовка секций криостата
- Превратить freeziМикротома до -24 ° С.
- Выберите новую линьку взрослых саранчей, которые являются активными и имеют неповрежденные антенны. Разрежьте антенны на 2-3 мм с помощью стерильных бритв.
- Поместите соединение OCT на замораживающий держатель микротома и поместите один или два образца на соединение горизонтально. Затем перенесите держатель в замораживающий микротом при -24 ° C для уравновешивания до тех пор, пока соединение не замерзает. Выньте держатель и накройте образцы небольшим количеством. Переместите держатель в замораживающий микротом при -24 ° C снова в течение как минимум 10 минут ( рис. 1 ).
ПРИМЕЧАНИЕ. Избегайте попадания пузырьков в состав. - Закрепите держатель с образцами в замораживающем микротоме, затем отделите замороженные образцы до 12 μm-ломтиков при -24 ° C.
- Оттаивание монтируйте срезы один за другим на слайдах (25 х 75 мм, без нуклеазы) и сушат на воздухе в течение 10 мин.
3. Фиксация разделов
- После подготовки криостатаСекций, поместите слайды в пластиковый контейнер (~ 100 x 40 x 80 мм) и зафиксируйте ткани, инкубируя слайды в 4% растворе параформальдегида (PFA) в течение 30 минут при 4 ° C.
- Промойте слайды в 1X фосфатно-буферном солевом растворе (PBS) в течение 1 мин.
- Для устранения щелочных белков переносите слайды до 0,2 М HCl в течение 10 мин.
- Чтобы устранить поверхностный белок нуклеиновой кислоты, перенесите слайды в 1XPBS с 1% Triton X-100 в течение 2 мин.
- Промойте слайды дважды в течение 30 с в 1x PBS.
- Наконец, промойте слайды в растворе формамида в течение 10 мин при 4 ° С.
4. Гибридизация
- Подготовьте антисмысловые и зондовые зонды
- Используйте буфер гибридизации для разбавления антисмысловых или зондовых зондов РНК в пробирках, свободных от нуклеазы, объемом 1,5 мл. В этом эксперименте для всех антисмысловых и сенсорных зондов ( LmigOR1, LmigOR2 и LmigOrco ) добавить 1 мкл зонда до 99 μL для каждого слайда. Как правило, использование 1: 100 разведений антисмысловых зондов дает значительные положительные сигналы и низкий фон с использованием этого протокола.
- Для хромогенного обнаружения разводите DIG-меченые зонды индивидуально.
- Для обнаружения TSA разбавьте DIG-меченый LmigOR1 с помощью меченых биотином зондов LmigOrco или DIG-меченых LmigOR2 с мечеными биотином LmigOR1- зондами вместе в буфере для гибридизации.
- Нагреть разведения в течение 10 мин при 65 ° С и положить их на лед в течение не менее 5 мин.
- гибридизация
- Слейте слайды и добавьте 100 мкл разбавленных антисмысловых и зондовых зондов (шаг 4.1) в секции тканей. Затем поместите покровные стекла (24 мм x 50 мм, без нуклеазы) на участки ткани.
- Поместите покрытые горки горизонтально во влажную коробку (~ 300 x 180 x 50 мм 3 , рис. 2 ) и инкубируйтеТ 55 ° С в течение 22 ч. Добавьте раствор формамида или 1X PBS на дно коробки, чтобы сохранить влажность окружающей среды, но не погружайте слайды в жидкость.
- Стирка и блокировка.
- После гибридизации тщательно удалите покровные стекла. Промойте ползунки дважды в течение 30 минут в 0,1x солевом цитрате натрия (SSC) при 60 ° C.
ПРИМЕЧАНИЕ. Моющее средство помещает слайды в держатель слайда, который затем помещается в пластиковый контейнер и осторожно перемешивается на качалке (~ 50 об / мин, рис. 2 ). - Промойте слайды в 1x трис-буферном солевом растворе (TBS) в течение 30 с.
- Добавьте 1 мл 1% -ного блокирующего реагента в TBS, дополненную 0,03% Triton X-100 на каждом слайде, и инкубируйте в течение 30 мин. Затем отбросьте блокирующее решение.
- После гибридизации тщательно удалите покровные стекла. Промойте ползунки дважды в течение 30 минут в 0,1x солевом цитрате натрия (SSC) при 60 ° C.
- Immunohistochemistry.
- Для хромогенного обнаружения используйте блокирующий реагент в TBS для разбавления 750 единиц (U) / мл антидигоксигенина AP-конъюгированного антителаDy до 1,5 ед. / Мл раствора АР. Добавьте 100 мкл раствора АР на покрытый (24 мм x 50 мм) слайд.
- Для обнаружения TSA используйте блокирующий реагент в TBS для разбавления 750 U / мл анти-дигоксигенина AP-конъюгированного антитела и конъюгированного с HRP-конъюгированного антитела против биотина стрептавидина к раствору AP / HRP. Добавьте 100 мкл раствора AP / HRP на покрытый (24 мм x 50 мм) слайд.
- Инкубируйте слайды во влажной коробке ( рис. 2 ) в течение 60 минут при 37 ° C. Используйте раствор формамида или 1X PBS, чтобы держать коробку влажной, но не сырой.
5. Окрашивание
- Извлеките покровные стекла. Промойте слайды три раза в течение 5 минут в 1x TBS, дополненном 0,05% Tween-20. Промойте слайды в DAP-буфере (хромогенное обнаружение: pH 9,5, обнаружение TSA: pH 8,0) в течение 5 мин.
- Окрашивание (обнаружение хромогена)
- Добавьте 100 мкл раствора субстрата NBT (375 мкг / мл) / BCIP (188 мкг / мл) (разбавленного в DAP;PH 9,5) на каждый предмет слайда. Осторожно поместите покровные стекла (24 x 50 мм) на слайды.
- Инкубируйте слайды во влажной коробке с раствором субстрата в течение 10 минут - O / N при 37 ° C.
ПРИМЕЧАНИЕ. Проверьте разработку, просматривая слайды время от времени под микроскопом. - Когда разработка будет готова, остановите реакцию, переместив слайды в воду.
- Окрашивание (обнаружение TSA)
- Используйте шприц для перемещения субстрата HNPP (100 мкг / мл) / быстрого красного (250 мкг / мл) из фильтра шприца (0,22 мкм, рисунок 2 ).
- Добавьте 100 мкл HNPP / Fast Red субстрата на скольжение, покрытое покровным (24 x 50 мм). Инкубируйте слайды в течение 30 минут с помощью HNPP / Fast Red субстрата при комнатной температуре.
- Снимайте покровные стекла осторожно и три раза стирайте слайды в течение 5 минут в 1X TBS, дополненном 0,05% Tween-20.
- Использовать 100 мкл субстрата TSA / покрытого (24 x 50 мм 2 ). Инкубируйте слайды с субстратом TSA в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Удалите покровные стекла осторожно и промойте слайды три раза в течение 5 минут в 1x TBS, дополненном 0,05% Tween-20.
- Вставьте слайды в PBS / глицерин (1: 3).
ПРИМЕЧАНИЕ. После завершения этих процедур слайды должны соблюдаться как можно скорее, потому что флуоресцентный сигнал быстро гаснет.
6. Наблюдение
- Хромогенное обнаружение
- Соблюдайте участки ткани с помощью оптического микроскопа. Выберите объективы 10X, 20X и 40X для наблюдения за результатами хромогенного обнаружения.
- Используйте программное обеспечение DP-BSW для анализа результатов и получения изображений.
- Обнаружение TSA
- Наблюдайте участки ткани с помощью конфокального микроскопа. DIG-меченные гены должны наблюдаться под светом 543 нм, представляя красный цвет, а гены, маркированные биотином, должны бытьНаблюдаемый под 488 нм светом, представляющий зеленый цвет. Когда они появляются, они представляют желтый цвет.
- Выберите объективы 20X и 40X для наблюдения за результатами обнаружения TSA, соответственно.
- Используйте программное обеспечение FV1000 для анализа результатов и получения изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
При хромогенном обнаружении небольшое подмножество антенных клеток в каждой взрослой антенной секции было обозначено DIG-мечеными антисмысловыми зондами LmigOR1 и LmigOR2 ( рис. 3 ). РНК ISH на последовательных участках для локализации LmigOR1 и LmigOR2 показала, что антеннальные клетки, экспрессирующие два гена, были расположены в кластерах ORN , экспрессирующих LmigORco , что указывает на то, что предполагаемые LmigOR1 и LmigOR2 были фактически выражены в ORN ( рисунок 4a- 4d ). Иногда визуализировали маркированные дендритоподобные структуры ( рис. 4e- 4f ). LmigOR1 и LmigOR2 были локализованы для нейронов в базиликовой сенсилле ( рис. 5a-5b ), но они не были выражены в индивидуальной сенсилле, что указывает на то, что они присутствуют в разных элементарных клетках NIC sensillium подтипов (рис 5с-5 г).
При обнаружении TSA двухцветная флуоресцентная гибридизация in situ показала, что экспрессирующие LmigOR1 клетки (красный цвет) были расположены в кластерах ORN, экспрессирующих LmigORco (зеленый цвет), что указывает на то, что предполагаемый LmigOR1 был выражен в ORN ( рисунок 6a ). На фиг. 6b показан вид сверху на боковые области на фиг. 6а . LmigOR1 - экспрессирующие нейроны (зеленый цвет, рис. 7a ) и LmigOR2-экспрессирующий нейрон (красный цвет, рис. 7b ) были расположены в разных подтипах Basiconic sensillium ( рис. 7c ).
4 / 55924fig1.jpg "/>
Рисунок 1: Получение насекомых усиков секций РНК В гибридизация. (А) Замораживание микротома; ( Bc ) Образцы внедряют в замораживающее соединение OCT. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Экспериментальные элементы для РНК В гибридизация. (А) держатель слайдов и пластиковый контейнер. B ) влажный ящик. ( C ) Рокер. D ) мембранный фильтр. ( E ) Конфокальный микроскоп. .jpg «target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Локализация клеток LmigOR1 и LmigOR2 в обонятельных органах. (А) Обзор LmigOR1 -expressing клеток в саранче членика. ( B ) Обзор экспрессирующих LmigOR2 клеток в сегменте антенны саранчи. Стрелки указывают клетки, экспрессирующие LmigOR1 ( a ) и LmigOR2 ( b ). Шкала шкалы = 100 мкм (a и b). Цифры были адаптированы из Xu et al. 12 Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Нейронная идентичность антенных клеток, выражающих LmigOR посредством хромогенных детекций . ( Ab ) Схема маркировки LmigOR1 ( a ) и LmigORco ( b ) антисмыслового зонда на последовательных участках антенны саранчи. ( Cd ) Схема маркировки LmigORco ( c ) и LmigOR2 ( d ) антисмыслового зонда на последовательных участках антенны саранчи. ( Ef ) Иллюстрация иногда помеченных дендритоподобных структур (обозначенных красными стрелками). Шкала шкалы = 50 мкм (объявление); 20 мкм (e и f). Цифры были адаптированы из Xu et al. 12 Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Nt "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Рисунок 5: LmigOR1 & LmigOR2 выражены в ORN, размещенных в Basiconic Sensilla. ( Ab ) Basiconic sensillum содержат ORN, экспрессирующие LmigOR1 ( a ) и LmigOR2 ( b ). ( Cd ). Выражение LmigOR1 и LmigOR2 в отдельном подмножестве усиковых ORN было проверено на последовательных участках (cd). Стрелки обозначают членики усиков, выражающие LmigOR1 (a, c) и LmigOR2 (b, d). Ba: basiconic sensillum. Шкала шкалы = 20 мкм (a и b); 50 мкм (с и d). Цифры были адаптированы из Xu et al. 12 Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Нейронная идентичность антенной клетки, выражающая LmigOR1 с помощью детектирования TSA. (А) Двухцветный in - situ гибридизации проводили на продольном сечении усиков , чтобы проиллюстрировать экспрессию LmigOR1 (красный) и LmigORco (зеленый). Локализация экспрессирующих LmigOR1 клеток в клеточных кластерах, экспрессирующих LmigORco, подтвердила ее нейронную идентичность. ( Б ) Закрыть окно в боковых областях. Иногда меченые дендритные структуры обозначались стрелкой. Окруженные области обозначают кластер ORN, выражающий LmigORco и использующий один и тот же сенсиллум. Шкала шкалы = 50 мкм (а); 20 мкм (b). Цифры были адаптированы из Xu et al. 12 Пожалуйста сЛизать здесь, чтобы просмотреть большую версию этого рисунка.
Рисунок 7: LmigOR1 & LmigOR2 были расположены с различными базальными сенсорными линзами Sensilla с помощью TSA Detection. Флуоресцентные сигналы визуализировались с использованием детектирующих систем, обозначая LmigOR1- меченые нейроны зеленой флуоресценцией ( a ) и положительные клетки LmigOR2 с помощью красной флуоресценции ( b ), были выражены в разных подтипах basiconic sensilla ( c ). Стрелки обозначают членики усиков, выражающие LmigOR1 и LmigOR2 . Шкала шкалы = 20 мкм. Цифры были адаптированы из Xu et al. 12 Нажмите здесь, чтобы посмотретьБолее крупная версия этого рисунка.
| имя | Последовательности |
| Lmig OR1-probe-s | 5'-AAGGGGTGGGAGACGGCCTG-3' |
| Lmig OR1-probe-as | 5'-CAGCTCCTCCCCAACGACAGC-3' |
| Lmig OR2-probe-s | 5'-ATGGGTGAGCGTGGAGAGGC-3' |
| Lmig OR2-probe-as | 5'-GGTCATCGCTGTGGACGTGG-3' |
| Lmig Orco-probe-s | 5'-CTCGTCTGACAGCGTAACTCAC-3' |
| Lmig Orco-probe-as | 5'-AAGACGCAGAAGAGGAAGACCT-3' |
Таблица 1: Последовательности праймеров для ПЦР.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Трудно выполнить РНК ISH локализовать OR гены в антеннах насекомых, потому что уровни экспрессии генов OR, за исключением ORco , очень низки, и сохранение гистологических фрагментов антенн насекомых очень сложно. Кроме того, обнаружение TSA также очень сложно. Для решения этих проблем необходимо принять следующие меры. Антенны выбираются из недавно линяющих взрослых саранчей, которые имеют тонкие и мягкие усиковые кутикулы, которые сохраняют морфологию на слайде. Замороженные образцы секционируют в срезы толщиной 12 мкм. Используются высокочувствительные и специфичные зонды с биотином и DIG. Моющие средства, такие как Tween-20 и Triton X-100, используются для уменьшения фона на многих этапах. При обнаружении TSA высоко экспрессируемый ген относительно другого низко экспрессируемого гена должен быть помечен биотином-16-UTP. Слайды следует наблюдать как можно скорее, потому что флуоресцентные сигналы быстро гасятся.
DIG- aИ пробы с меченым биотином имеют преимущества более длительного срока хранения, более высокие отношения сигнал / шум и лучшие сотовые разрешения, чем радиоактивные зонды 18 , 19 . Протокол, представленный в этой статье, имеет некоторые преимущества перед гибридной гибридизацией на месте . Этот протокол легко идентифицирует локализацию генов на клеточном уровне, но не может быть легко использован для исследования закономерностей распределения генов, который легче выполнять с гибридной гибридизацией in situ.
Чтобы идентифицировать ген OR, были приняты два подхода. Одно из них - хромогенное обнаружение в последовательных срезах, а другое - флуоресцентное обнаружение в одном разделе. ORco ко-экспрессируется с определенным OR в качестве маркера ORN 10 , 20 , 21 . Ячейки, выражающие LmigOR1 или LmigOR2, были расположеныК кластерам экспрессирующих LmigORco ячеек, которые однозначно проверяли их как OR ( рис. 4 и рис. 6 ). Используя те же подходы, мы обнаружили, что LmigOR1 и LmigOR2 не ко-экспрессируются в одной сенсиллуме. Результаты этих двух подходов являются подтверждающими.
Этот протокол также был успешно использован для локализации LmigORco, SgreORco, SgreIR8a и SgreIR25a в антеннах саранчи 10 , 14 . Недавно LmigOR3 был локализован в трихоидных нейронах сенсиллы в L. migratoria, используя тот же протокол 15 . Этот протокол был использован для локализации двух сенсорных белков нейронной мембраны SgreSNMP1 и SgreSNMP2 в антеннах S. gregaria 16 . Таким образом, этот протокол надежно локализовал хемосенсорные гены в антеннах саранчи, которые не только подтвердили этиГенов-кандидатов, но также локализовал эти гены в конкретных клетках, размещенных в разных типах сенсиллы.
В заключение, этот высокоэффективный протокол РНК ISH специально описан для локализации OR генов, а также других генов, выраженных на низких уровнях, в антеннах насекомых.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать или каких-либо других конфликтов интересов.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается грантом Национального фонда естественных наук Китая (No.31472037). Упоминание торговых наименований или коммерческих продуктов в этой статье предназначено исключительно для целей предоставления конкретной информации и не подразумевает рекомендации.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 2×TSINGKETM Master Mix | TSINGKE, China | TSE004 | |
| RNase-free H2O | TIANGEN, China | RT121-02 | |
| REGULAR AGAROSE G-10 | BIOWEST, SPAIN | 91622 | |
| Binding buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Balance buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Wash solution | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| T Vector | Promega, USA | A362A | |
| T4 DNA Ligase | Promega, USA | M180A | |
| Escherichia coli DH5α | TIANGEN, China | CB101 | |
| Ampicillin | Sigma, USA | A-6140 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Inalco, USA | 1758-1400 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | SBS Genetech, China | GX1-500 | |
| Nco I | BioLabs, New England | R0193S | |
| Spe I | BioLabs, New England | R0133M | |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| Biotin RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11685597910 | |
| DNase | DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| LiCl | Sinopharm, China | 10012718 | |
| Ethanol | Sinopharm, China | 10009257 | |
| Acetic acid | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands | 4583 | |
| Slides | TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China | FISH0010 | |
| HCl | Sinopharm, China | 80070591 | |
| Millex | Millipore, USA | SLGP033RS | |
| Tween 20 | AMRESCO, USA | 0777-500ML | |
| Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt | Roche, Switzerland | 11175041910 | |
| Glycerol | Sinopharm, China | 10010618 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | V900483-1KG | 0.04 mol/L Tris-Base |
| 1×Tris-acetate-EDTA | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | 0.12% acetic acid |
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | 03677 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | Sinopharm, China | 10019392 | 10 g/L NaCl |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM335231 | 10 g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM361526 | 5 g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | Sinopharm, China | 10019392 | 10 g/L NaCl |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM335231 | 10 g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM361526 | 5 g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | WISENT ING, Canada | 800-010-CG | 15 g/L Agar Bacteriological Grade |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sinopharm, China | 10019392 | 8.5% NaCl |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sigma, USA | V900041-500G | 14 mM KH2PO4 |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sigma, USA | V900268-500G | 80 mM Na2HPO4 |
| 10×Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5) | Sigma, USA | V900483-1KG | 1 M Tris-Base |
| 10×Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5) | Sinopharm, China | 10019392 | 1.5 M NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sigma, USA | V900483-1KG | 100 mM Tris-Base |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sinopharm, China | 10019392 | 100 mM NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sigma, USA | V900020-500G | 50 mM MgCl2·6H2O |
| 20×saline-sodium citrate (pH 7.0) | Sinopharm, China | 10019392 | 3 M NaCl |
| 20×saline-sodium citrate (pH 7.0) | Sigma, USA | V900095-500G | 0.3 M Na-Citrate |
| 4% paraformaldehyde solution (PFA, pH 9.5) | Sigma, USA | V900894-100G | 4% paraformaldehyde |
| Sodium Carbonate Buffer | Sigma, USA | V900182-500G | 0.1 M NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2) | Sigma, USA | V900182-500G | 80 mM NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2) | Sigma, USA | S7795-500G | 120 mM Na2CO3 |
| Formamide Solution (pH 10.2) | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Formamide Solution (pH 10.2) | 5×saline-sodium citrate | ||
| Blocking Buffer in TBS | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1% Blot |
| Blocking Buffer in TBS | AMRESCO, USA | 0694-500ML | 0.03% Triton X-100 |
| Blocking Buffer in TBS | 1×Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase solution | Blocking Buffer in TBS | ||
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Blocking Buffer in TBS | ||
| Hybridization Buffer | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Hybridization Buffer | 2×saline-sodium citrate | ||
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D8906-50G | 10% dextran sulphate |
| Hybridization Buffer | invitrogen, USA | AM7119 | 20 µg/mL yeast t-RNA |
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D3159-10G | 0.2 mg/mL herring sperm DNA |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10 mg/mL) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25 mg/mL) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Detection Buffer | ||
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 2% fluorescein-tyramides |
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | Amplification Diluent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | |||
| Freezing microtome | Leica, Nussloch, Germany | Jung CM300 cryostat | |
| Spectrophotometer | Thermo SCIENTIFIC, USA | NANODROP 2000 | |
| Optical microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus IX71microscope | |
| Confocal microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus BX45 confocal microscope |
References
- Sato, K., et al. Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels. Nature. 452 (7190), 1002-1006 (2008).
- Smart, R., et al. Drosophila odorant receptors are novel seven transmembrane domain proteins that can signal independently of heterotrimeric G proteins. Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 770-780 (2008).
- Wicher, D., et al. Drosophila odorant receptors are both ligand-gated and cyclic-nucleotide-activated cation channels. Nature. 452 (7190), 1007-1011 (2008).
- Carey, A. F., Wang, G., Su, C. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464 (7258), 66-71 (2010).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Wang, G., Carey, A. F., Carlson, J. R., Zwiebel, L. J. Molecular basis of odor coding in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4418-4423 (2010).
- Hassanali, A., Njagi, P. G., Bashir, M. O. Chemical ecology of locusts and related acridids. Annu Rev Entomol. 50, 223-245 (2005).
- Schaeren-Wiemers, N., Gerfin-Moser, A. A single protocol to detect transcripts of various types and expression levels in neural tissue and cultured cells: in situ hybridization using digoxigenin-labeled cRNA probes. Histochemistry. 100 (6), 431-440 (1993).
- Vosshall, L. B., Amrein, H., Morozov, P. S., Rzhetsky, A., Axel, R. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96 (5), 725-736 (1999).
- Yang, Y., Krieger, J., Zhang, L., Breer, H. The olfactory co-receptor Orco from the migratory locust (Locusta migratoria) and the desert locust (Schistocerca gregaria): identification and expression pattern. Int J Biol Sci. 8 (2), 159-170 (2012).
- Schultze, A., et al. The co-expression pattern of odorant binding proteins and olfactory receptors identify distinct trichoid sensilla on the antenna of the malaria mosquito Anopheles gambiae. PLoS One. 8 (7), e69412 (2013).
- Xu, H., Guo, M., Yang, Y., You, Y., Zhang, L. Differential expression of two novel odorant receptors in the locust (Locusta migratoria). BMC Neurosci. 14, 50 (2013).
- Saina, M., Benton, R. Visualizing olfactory receptor expression and localization in Drosophila. Methods Mol Biol. 1003, 211-228 (2013).
- Guo, M., Krieger, J., Große-Wilde, E., Mißbach, C., Zhang, L., Breer, H. Variant ionotropic receptors are expressed in olfactory sensory neurons of coeloconic sensilla on the antenna of the desert locust (Schistocerca gregaria). Int J Biol Sci. 10 (1), 1-14 (2013).
- You, Y., Smith, D. P., Lv, M., Zhang, L. A broadly tuned odorant receptor in neurons of trichoid sensilla in locust, Locusta migratoria. Insect Biochem Mol Biol. 79, 66-72 (2016).
- Jiang, X., Pregitzer, P., Grosse-Wilde, E., Breer, H., Krieger, J. Identification and characterization of two "Sensory Neuron Membrane Proteins" (SNMPs) of the desert locust, Schistocerca gregaria (Orthoptera: Acrididae). J Insect Sci. 16 (1), 33 (2016).
- Angerer, L. M., Angerer, R. C. In situ. hybridization to cellular RNA with radiolabelled RNA probes. In situ hybridization. Wilkinson, D. G. , IRL Press. Oxford. 2 (1992).
- Komminoth, P., Merk, F. B., Leav, I., Wolfe, H. J., Roth, J. Comparison of 35S- and digoxigenin-labeled RNA and oligonucleotide probes for in situ hybridization. Expression of mRNA of the seminal vesicle secretion protein II and androgen receptor genes in the rat prostate. Histochemistry. 98 (4), 217-228 (1992).
- Leary, J. J., Brigati, D. J., Ward, D. C. Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (13), 4045-4049 (1983).
- Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Cell. 117 (7), 965-979 (2004).
- Jones, W. D., Nguyen, T. A., Kloss, B., Lee, K. J., Vosshall, L. B. Functional conservation of an insect odorant receptor gene across 250 million years of evolution. Curr Biol. 15 (4), R119-R121 (2005).
