Summary
Este artículo describe un protocolo de hibridación in situ detallado y altamente eficaz, especialmente para los genes de receptores Odorantes expresados de bajo nivel (OR), así como otros genes, en antenas de insectos usando sondas marcadas con biotina o marcadas con digoxigenina (DIG).
Abstract
Los insectos han desarrollado sofisticados sistemas de recepción olfativa para detectar señales químicas exógenas. Estas señales químicas son transducidas por neuronas receptoras olfativas (ORN) alojadas en estructuras similares a los cabellos, llamadas chemosensilla, de las antenas. En las membranas de los ORN, se cree que los receptores de olor (OR) están implicados en la codificación de los olores. Por lo tanto, ser capaz de identificar genes localizados a los ORNs es necesario para reconocer los genes OR, y proporciona una base fundamental para la posterior funcional in situ estudios. Los niveles de expresión de ARN específicos de ORs en las antenas de insectos son muy bajos, y preservar el tejido de insectos para la histología es un reto. Por lo tanto, es difícil localizar un OR a un tipo específico de sensilla utilizando ARN hibridación in situ. En este artículo, se introduce un detallado y altamente eficaz ARN in situ protocolo de hibridación en particular para los genes O poco expresados de insectos. Además, un OR específico Gene waS identificados mediante la realización de dos experimentos de hibridación fluorescente in situ utilizando un gen del receptor coexpresor, Orco , como marcador.
Introduction
Las antenas de insectos, que son los órganos chemosensoriales más importantes, están cubiertas con muchas estructuras similares a los cabellos - llamadas sensilla - que son inervadas por las Neuronas Receptoras Olfativas (ORNs). En la membrana de los ORNs de insectos, los receptores de olor (OR), un tipo de proteína que contiene siete dominios transmembrana, se expresan con un coreceptor (ORco) para formar un heterómero que funciona como un canal iónico odorante 1 , 2 , 3 . Diferentes RUP responden a diferentes combinaciones de compuestos químicos 4 , 5 , 6 .
Las langostas ( Locusta migratoria ) se basan principalmente en señales olfativas para desencadenar comportamientos importantes 7 . Las ER de langostas son factores clave para la comprensión de los mecanismos olfatorios moleculares. Localización de un gen específico de la langosta OR en la neurona de un genMorfológicamente específico sensillum tipo por RNA In Situ Hybridization (RNA ISH) es el primer paso en la exploración de la función de las RUP.
El ARN ISH utiliza una sonda de ARN complementario marcada para medir y localizar una secuencia de ARN específica en una sección de tejido, células o montajes enteros in situ , proporcionando información sobre los procesos fisiológicos y la patogénesis de la enfermedad. Las sondas de ARN marcadas con digoxigenina (marcadas con DIG) y marcadas con biotina se han usado ampliamente en la hibridación de ARN. El marcado de ARN con digoxigenina-11-UTP o biotina-16-UTP puede prepararse mediante transcripción in vitro con ARN polimerasas SP6 y T7. Las sondas de ARN marcadas con DIG y biotina tienen las siguientes ventajas: no radiactivas; seguro; estable; altamente sensible; Altamente específicos; Y fácil de producir utilizando PCR y transcripción in vitro . Las sondas de ARN marcadas con DIG y biotina pueden ser detectadas cromogénicamente y fluorescentemente. Las sondas de ARN marcadas con DIG pueden detectarse con Alkali anti-digoxigeninaNe Se pueden visualizar anticuerpos conjugados con fosfatasa (AP) que pueden visualizarse con los sustratos quimioluminiscentes altamente sensibles cloruro de tetrazolio / sal de toluidina de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (NBT / BCIP) usando un microscopio óptico o con 2 -hidroxi-3-naftoico (HNPP) acoplado con sal de cloruro de hemi-zinc de 4-cloro-2-metilbencenodiazonio (Fast Red) usando un microscopio confocal. Las sondas de ARN marcadas con biotina se pueden detectar con anticuerpos conjugados con anti-biotina streptavidina de rata de caballo peroxidasa (HRP) que se pueden visualizar con fluoresceína-tiramidas usando un microscopio confocal. De este modo, la hibridación in situ fluorescente de doble color puede realizarse para detectar dos genes diana en una rebanada usando sondas de ARN marcadas con DIG y biotina.
El ARN ISH con sondas marcadas con DIG y / o biotina se ha utilizado con éxito para localizar genes relacionados con el olfato, tales como OR , receptor ionotrópico, proteína de unión al odoranteY la proteína de membrana de la neurona sensorial, en antenas de insectos de, pero sin limitarse a, Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria y la langosta del desierto Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Sin embargo, existen dos desafíos sustanciales al realizar RNA ISH para OR de insectos: (1) OR genes (excepto ORco ) se expresan en niveles bajos y sólo en unas pocas células, dificultando la detección de señales y (2) preservando tejido de insecto para Histología, de modo que la morfología se conserva y el ruido de fondo es bajo, puede ser un reto. En este artículo un protocolo detallado y eficaz que describe el ARN ISH para la localización de genes OR en insectosAntenas, incluyendo tanto la detección cromogénica como la de Tyramide Signal Amplification (TSA).
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Protocol
NOTA: Para limitar la degradación del ARN, preparar soluciones usando agua destilada en autoclave húmedo (a 121 ° C durante 60 min) y también materiales de autoclave en húmedo.
1. Preparación de sondas antisentido y sensorial de ARN ISH
- Amplificación y purificación de genes diana
- En primer lugar, se produce un fragmento de doble cadena de 387 pb de L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) del plásmido que contiene el ADNc de longitud completa de LmigOR1 con una ADN polimerasa Taq que añade adeninas a ambos extremos de los fragmentos.
- Utilizar un volumen de reacción final de 100 mu l que contenga 50 mu l de mezcla de reacción 2x, 4 mu l de cebadores sentido y antisentido ( Tabla 1 ), 1 mu l de molde de plásmido y 41 mu l de H 2 O libre de RNasa. Protocolo: 94ºC durante 5 min, seguido de 30 ciclos de 94ºC durante 30 s, 55ºC durante 30 s y 72ºC durante 1 min, Seguido de 72 ° C durante 10 min.
- Repita estos pasos para producir el fragmento de doble hebra de 1,303 pb de LmigOR2 (GenBank: JQ766966) y fragmento de doble hebra de 1,251 pb de LmigORco (GenBank: JN989549). Los cebadores utilizados en estos experimentos se presentan en la Tabla 1 .
- Ejecutar productos de PCR en geles de agarosa al 1,2% en 1x tampón Tris-acetato-EDTA y visualizar usando tinción con bromuro de etidio.
- Extraer estos productos de PCR utilizando un kit de extracción de gel.
- Después de la electroforesis, extirpar las bandas de ADN del gel y colocar las rodajas de gel en un tubo de 1,5 ml. A continuación, añadir 100 μl de tampón de unión (tampón PN) por 0,1 g de rebanada de gel. Vórtice e incube a 50 ° C hasta que la rebanada de gel se disuelva completamente.
- Insertar una columna de adsorción de CA2 en el tubo de recogida y añadir 500 μl de tampón de equilibrio (tampón BL). Esto mejora la capacidad de absorción y la estabilidad de la membrana de sílice. CentriFuge a 12.400 xg durante 1 min.
- Transferir la mezcla de gel disuelto al conjunto de columna de adsorción e incubar a temperatura ambiente durante 2 min. A continuación, centrifugar los tubos a 12.400 xg durante 1 min. Deseche el flujo y vuelva a insertar la columna de adsorción en el tubo de recogida.
- Añadir 600 μL de solución de lavado (etanol añadido, Buffer PW) dos veces. Centrifugar a 12.400 xg durante 1 min. Deseche el flujo y vuelva a insertar la columna de adsorción en el tubo de recogida.
- Vaciar el tubo de recogida y recentrifugar el conjunto de la columna a 12.400 xg durante 2 min para permitir la evaporación de cualquier etanol residual.
- Transfiera cuidadosamente la columna de adsorción a un tubo de centrífuga limpio de 1,5 ml. Secar al aire el gránulo durante 5-10 minutos y redisolver el ADN en un volumen adecuado ( por ejemplo, 30 μl) de agua libre de nucleasa.
- Incubar a TA durante 2 min. Centrifugar a 12.400 xg durante 2 min. Desechar la columna de adsorción y almacenar el ADN a 4 ° C o -20 ° C.
- En primer lugar, se produce un fragmento de doble cadena de 387 pb de L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) del plásmido que contiene el ADNc de longitud completa de LmigOR1 con una ADN polimerasa Taq que añade adeninas a ambos extremos de los fragmentos.
- Construir los plásmidos recombinantes
- Individualmente ligar el fragmento de 387 pb de LmigOR1, 1303 bp fragmento de LmigOR2 y 1251 bp fragmento de LmigORco en un vector de T que contiene promotores para la T7 (aguas arriba) y ARN polimerasas SP6 (aguas abajo) adyacente al DNA insertado utilizando ADN ligasa de T4. Preparar la siguiente reacción de 10 μl: 5 μl de tampón de ligación 2x, 1 μl de vector T, 3 μL (~100 ng) del ADN del gen insertado y 1 μl de ADN ligasa T4 e incubar O / N a 4 ° C.
- Añadir 5 μl de cada plásmido recombinante que contiene el fragmento de 387 pb de LmigOR1 , fragmento de 1.303 pb de LmigOR2 y 1.251 pb de LmigORco por separado en 50 μl de células competentes de Escherichia coli DH5α en tubos estériles de 1,5 mL.
- Mezclar suavemente y poner los tubos en hielo durante 30 min y luego incubarlos durante 90 s a 42DO. Vuelva a colocarlos en hielo durante 3 min.
- Añadir 450 μl de medio líquido Luria-Bertani (LB) sin ampicilina a cada tubo e incubarlos en un agitador a 150 rpm durante 1 h a 37 ° C para restaurar el E. coli DH5α.
- Tomar una alícuota de 100 μl de cada transformante y usarlos para inocular placas de sustrato sólido LB que contengan ampicilina 50 μg / ml, β-D-1-tiogalactopiranósido isopropílico (IPTG) de 24 μg / mL y 40 μg / mL de 5-bromo-4 - cloro - 3 - indolil - beta - D - galactopiranósido (X - gal).
- Incubar estas placas en una incubadora constante a 37 ° C durante 18 h. Se tamizan los plásmidos recombinantes diana usando el método de cribado azul-blanco. Secuencia de los plásmidos recombinantes diana utilizando la secuenciación de Sanger e identificar las tres OR direcciones de los insertos de los genes.
- Seleccionar endonucleasas de restricción para linealizar plásmidos recombinantes
- Utilizar endonucleasas de restricción tNo sólo digieren en el sitio de clonación múltiple del vector, sino que tampoco cortan el ADN del inserto. En este experimento, todos los 3 genes se insertan en el vector T en la dirección correspondiente a la del vector.
- Utilizar endonucleasa de restricción Nco I para linealizar los plásmidos recombinantes que contienen el fragmento de 387 pb de LmigOR1 , fragmento de 1.303 pb de LmigOR2 y fragmento de 1.251 pb de LmigORco para producir las sondas antisentido. Utilice la endonucleasa de restricción Sp e I para producir las sondas de detección.
NOTA: Si la dirección de la inserción corresponde a la del vector, entonces se selecciona un sitio de restricción único desde el extremo de T7 para linealizar el plásmido recombinante y se utiliza ARN polimerasa SP6 para preparar la sonda antisentido. Se selecciona un sitio de restricción único desde el extremo de SP6 para linealizar el plásmido recombinante, y se usa la ARN polimerasa de T7 para preparar la sonda de detección. De lo contrario, si la dirección del inserto no corresponde a tLa dirección del vector, entonces se selecciona un único sitio de restricción desde el extremo de SP6 para linealizar el plásmido recombinante y se usa RNA polimerasa de T7 para preparar la sonda antisentido. El único sitio de restricción desde el extremo de T7 se selecciona para linealizar el plásmido recombinante, y la ARN polimerasa SP6 se usa para preparar la sonda de detección.
- Purificación de los plásmidos recombinantes linealizados
- Digerir 20 μg de cada uno de los tres plásmidos recombinantes que contienen el fragmento de 387 pb de LmigOR1 , fragmento de 1.303 pb de LmigOR2 y fragmento de 1.251 pb de LmigORco usando la endonucleasa de restricción Nco I en una reacción de 100 μL que contiene 10 μl de tampón 10x, 40 μl de 0,5 mu g / mu l de plásmido, 3 mu l de Nco I y 47 mu l de H _ { 2} O libre de RNasa, seguido de una incubación de 3 h a 37ºC.
- De forma similar, digerir 20 μg de cada uno de estos tres plásmidos recombinantes uCantar la endonucleasa de restricción Spe I.
- Purificar estos plásmidos digeridos usando un kit de extracción en gel como se describe en 1.1.2. Determine las concentraciones de estos plásmidos recombinantes linealizados extraídos mediante espectrofotometría y ajuste a 0,5 μg / μl.
- Preparar sondas antisentido y sensorial
- Utilice el sistema de transcripción de ARN T7 / SP6 para generar sondas antisentido y sensorial. La ARN polimerasa SP6 se utiliza para transcribir ARN bicatenario para sondas antisentido marcadas con DIG y biotina para estos tres genes OR usando plásmidos recombinantes linealizados como plantillas in vitro . La ARN polimerasa T7 se utiliza para producir sondas de detección. Realizar la reacción en un volumen final de 20 μL, que contiene 2 μl de mezcla NTP 10x, 2 μl de tampón de transcripción 10X, 1 μl de inhibidor de RNasa, 2 μl de ARN polimerasa T7 o SP6, 4 μl de 0,5 μg / μL de plásmido linealizado y 9 mu l de H _ { 2} O libre de RNasa, seguidoPor una incubación de 3 h a 37ºC.
- Incubar las sondas antisentido y sensorial marcadas con DIG y biotina durante 30 min con 1 mu l de DNasa a 37ºC. Añadir 2,5 μL de LiCl 5 M y 75 μL de etanol absoluto, luego incubar las reacciones durante 30 minutos a -70 ° C.
- Centrifugar a 15.000 xg durante 30 minutos a 4 ° C. Cuidadosamente decantar el sobrenadante. Añadir 150 μl de etanol al 70% para lavar el precipitante. Preparar el etanol al 70% (1 L) añadiendo etanol al 95% (736,8 ml) a agua destilada estéril (263,2 ml).
- Centrifugar a 15.000 xg durante 30 min a 4 ° C de nuevo y secar al aire el pellet durante 5-10 min a RT. Añadir 25 μL de H 2 O libre de RNasa para disolver las sondas antisentido y sensorial de ARN.
- Si la longitud del gen insertado es mayor que 1 kb, posteriormente se fragmentan las sondas antisentido y de sentido inverso a una longitud media de ~ 300 pb por incubación en soluciones tampón bicarbonato-carbonato. Realizar la reacción en un volumen final de 50 μl, containing 25 l de la sonda de ARN y 25 l de la solución tampón de bicarbonato-carbonato (mM NaHCO3 80 mM, Na 120 2 CO 3, pH 10,2) a 60 ° C. El tiempo de hidrólisis requerido viene dado por una fórmula 17 previamente publicada.
- Añadir 5 μl de ácido acético al 10% para detener la reacción. En este experimento, se fragmentan las sondas LmigOR2 y LmigORco antisentido y sentido durante 24 y 23 min, respectivamente.
T = (L _ { o } - L _ { f} ) / k _ {X} o _ {XL} f
L o = longitudes de los fragmentos iniciales en kb
L f = longitud de los fragmentos finales en kb
K = la constante de velocidad para la hidrólisis, aproximadamente 0,11 kb -1 min -1
T = tiempo de hidrólisis en min - Por último, añadir 250 μL de tampón de hibridación y almacenar a -80 ° C.
2. Preparación de las secciones del criostato
- Precool el freeziNg hasta -24 ° C.
- Seleccione las nuevas langostas adultos que mueven y están activas y tienen antenas intactas. Cortar las antenas en pedazos de 2-3 milímetros usando maquinillas de afeitar estériles.
- Ponga el compuesto OCT en un soporte de micrótomo congelador y coloque una o dos muestras en el compuesto horizontalmente. Luego, transfiera el soporte al micrótomo de congelación a -24 ° C para equilibrar hasta que el compuesto se congela. Saque el soporte y cubra las muestras con un poco de compuesto. Transfiera el soporte al micrótomo de congelación a -24 ° C de nuevo durante al menos 10 minutos ( Figura 1 ).
NOTA: Evite las burbujas en el compuesto. - Fijar el soporte con las muestras en el microtómulo de congelación, luego seccionar las muestras congeladas en cortes de 12 μm de grosor a -24 ° C.
- Descongelar las rebanadas una por una en los portaobjetos (25 x 75 mm, sin nucleasas) y secar al aire durante 10 min.
3. Secciones de fijación
- Después de preparar el criostato(100 x 40 x 80 mm) y fijar los tejidos por incubación de los portaobjetos en solución de paraformaldehído (PFA) al 4% durante 30 min a 4 ° C.
- Lavar las diapositivas en solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS) durante 1 min.
- Para eliminar las proteínas alcalinas, transferir los portaobjetos a HCl 0,2 M durante 10 min.
- Para eliminar la proteína superficial del ácido nucleico, transferir los portaobjetos a 1XPBS con 1% de Triton X-100 durante 2 min.
- Lavar los portaobjetos dos veces durante 30 s en 1x PBS.
- Finalmente, enjuague los portaobjetos en solución de formamida durante 10 min a 4 ° C.
4. Hibridación
- Preparar las sondas antisentido y de sentido
- Utilizar un tampón de hibridación para diluir las sondas antisentido o sensorial de ARN en los tubos libres de nuclease de 1,5 ml. En este experimento, para todas las sondas antisentido y sensorial ( LmigOR1, LmigOR2 y LmigOrco ), añadir 1 μl de sonda a 99 μL de hibridación por diapositiva. Generalmente, el uso de diluciones 1: 100 de sondas antisentido produce señales positivas significativas y fondos bajos usando este protocolo.
- Para la detección cromogénica, diluir las sondas marcadas con DIG individualmente.
- Para la detección de TSA, diluir DIG-etiquetados LmigOR1 con biotina marcado LmigOrco sondas o DIG-etiquetados LmigOR2 con biotina marcado LmigOR1 sondas en conjunto en el buffer de hibridación.
- Calentar las diluciones durante 10 min a 65 ° C y ponerlas en hielo durante al menos 5 min.
- Hibridación
- Escurrir las diapositivas y añadir 100 μ l de antisentido diluido y sentido sondas (Paso 4.1) a las secciones de tejido. Luego, coloque cubreobjetos (24 mm x 50 mm, sin nucleasa) en las secciones de tejido.
- Coloque los portaobjetos cubiertos horizontalmente en una caja húmeda (~ 300 x 180 x 50 mm 3 , Figura 2 ) e incube unaT 55ºC durante 22 h. Agregue solución de formamida o 1X PBS al fondo de la caja para mantener el ambiente húmedo, pero no sumerja las diapositivas en el líquido.
- Lavado y bloqueo.
- Después de la hibridación, retire los cubreobjetos cuidadosamente. Lavar las diapositivas dos veces durante 30 minutos en 0.1x Citrato de Sodio Salino (SSC) a 60 ° C.
NOTA: El lavado significa colocar los portaobjetos en un soporte de portaobjetos que luego se coloca en un recipiente de plástico y agitar suavemente sobre un balancín (~ 50 rpm; Figura 2 ). - Enjuague los portaobjetos en 1x solución salina tamponada con Tris (TBS) durante 30 s.
- Añadir 1 ml de reactivo de bloqueo al 1% en TBS suplementado con Triton X-100 al 0,03% en cada diapositiva, e incubar durante 30 min. Luego, deseche la solución de bloqueo.
- Después de la hibridación, retire los cubreobjetos cuidadosamente. Lavar las diapositivas dos veces durante 30 minutos en 0.1x Citrato de Sodio Salino (SSC) a 60 ° C.
- Inmunohistoquímica.
- Para la detección cromogénica, utilice un reactivo de bloqueo en TBS para diluir 750 unidades (U) / mL de antibota-anti-digoxigenina conjugada con antiboDy a 1,5 U / mL AP solución. Agregue 100 μl de solución de AP por cada diapositiva cubierta (24 mm x 50 mm).
- Para la detección de TSA, utilice un reactivo de bloqueo en TBS para diluir 750 U / ml de anticuerpo conjugado con anti-digoxigenina AP y anticuerpo conjugado con antipatina de estreptavidina anti-biotina a la solución de AP / HRP. Añadir 100 μl de solución de AP / HRP por una lámina cubierta (24 mm x 50 mm).
- Incubar los portaobjetos en una caja húmeda ( Figura 2 ) durante 60 minutos a 37 ° C. Utilice la solución de formamida o 1X PBS para mantener la caja húmeda pero no empapada.
5. Tinción
- Quite los cubreobjetos cuidadosamente. Lavar las diapositivas tres veces durante 5 min en 1x TBS suplementado con Tween-20 al 0,05%. Enjuagar los portaobjetos en tampón DAP (detección cromogénica: pH 9,5, detección de TSA: pH 8,0) durante 5 min.
- Tinción (detección cromogénica)
- Añadir 100 μl de NBT (375 μg / ml) / BCIP (188 μg / ml) solución de sustrato (diluida en DAP;PH 9,5) a cada diapositiva. Cuidadosamente colocar cubreobjetos (24 x 50 mm) en las diapositivas.
- Incubar los portaobjetos en una caja húmeda con solución de sustrato durante 10 min - O / N a 37 ° C.
NOTA: Compruebe el desarrollo mirando las diapositivas de vez en cuando bajo el microscopio. - Cuando el desarrollo esté listo, detenga la reacción transfiriendo los portaobjetos al agua.
- Tinción (detección de TSA)
- Utilice una jeringa para mover el sustrato HNPP (100 μg / ml) / rojo rápido (250 μg / ml) del filtro de jeringa (0,22 μm, Figura 2 ).
- Agregue 100 μl de sustrato HNPP / Fast Red por cada diapositiva cubierta con un cubreobjetos (24 x 50 mm). Incubar las diapositivas durante 30 min con HNPP / Fast Red sustrato a RT.
- Retire los cubreobjetos cuidadosamente y lave los portaobjetos tres veces durante 5 min en 1X TBS suplementado con Tween-20 al 0,05%.
- Utilizar 100 μl de sustrato TSA / cubierto (24 x 50 mm 2 ) deslizamiento. Incubar los portaobjetos con sustrato TSA durante 10 minutos a TA.
- Retire los cubreobjetos cuidadosamente y lave las diapositivas tres veces durante 5 min en 1x TBS suplementado con Tween-20 al 0,05%.
- Incrustar las diapositivas en PBS / glicerol (1: 3).
NOTA: Después de terminar estos procedimientos, las diapositivas deben ser observadas tan pronto como sea posible porque la señal fluorescente se apagará rápidamente.
6. Observación
- Detección cromogénica
- Observe las secciones de tejido usando un microscopio óptico. Elija las lentes objetivo 10X, 20X y 40X para observar los resultados de la detección cromogénica.
- Utilice el software DP-BSW para analizar los resultados y capturar las imágenes.
- Detección de TSA
- Observe las secciones de tejido usando un microscopio confocal. Los genes marcados con DIG deben observarse bajo luz de 543 nm, presentando un color rojo, y los genes marcados con biotina deben serObservado bajo luz 488 nm, presentando un color verde. Cuando emergen, presentan color amarillo.
- Elija las lentes objetivo 20X y 40X para observar los resultados de la detección de TSA, respectivamente.
- Utilice el software FV1000 para analizar los resultados y capturar las imágenes.
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Representative Results
Con la detección cromogénica, un pequeño subconjunto de las células de la antena en cada sección de la antena de adultos se denota por DIG-etiquetados LmigOR1 y LmigOR2 antisentido sondas ( Figura 3 ]. RNA ISH en secciones consecutivas para localizar LmigOR1 y LmigOR2 mostró que las células antenales que expresan los dos genes se localizaron en ORN clusters que expresan LmigORco , lo que indica que el supuesto LmigOR1 y LmigOR2 se expresaron en realidad ORNs ( Figura 4a -4d ). Ocasionalmente, etiquetados dendríticas-como las estructuras fueron visualizados ( Figura 4e -4f ). LmigOR1 y LmigOR2 fueron localizados a las neuronas en la sensilla basiconic ( Figura 5a-5b ), pero no fueron coexpresados en sensilla individual, lo que indica que estaban presentes en diferentes basico Nic sensillium subtipos ( Figura 5c-5 d ).
En la detección de TSA, hibridación fluorescente in situ doble color demostró que las células que expresan LmigOR1 (color rojo) se localizaron a los grupos ORN que expresan LmigORco (color verde), lo que indica que el putativo LmigOR1 se expresó en ORNs ( Figura 6a ). Una vista de cerca de las áreas enmarcadas de la Figura 6a se muestra en la Figura 6b. LmigOR1 -expresando las neuronas (color verde, Figura 7a ) y LmigOR2 - expresando la neurona (color rojo, Figura 7b ) se localizaron a diferentes basiconic sensillium subtipos ( Figura 7c ].
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Figura 1: Preparación de secciones de antenas de antenas para la hibridación in situ de ARN. (A) El micrótomo de congelación; ( Bc ) Las muestras se incrustan en el compuesto OCT congelado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Artículos experimentales para la hibridación in situ del ARN . (A) El soporte de diapositivas y el recipiente de plástico. ( B ) La caja húmeda. ( C ) El balancín. ( D ) El filtro de membrana. ( E ) Microscopio confocal. .jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Localización celular de LmigOR1 y LmigOR2 en órganos olfativos. (A) Descripción general de las células que expresan LmigOR1 en un segmento antenal langosta. ( B ) Descripción general de las células que expresan LmigOR2 en un segmento antenal de langostas. Las puntas de flecha indican células que expresan LmigOR1 ( a ) y LmigOR2 ( b ). Barras de escala = 100 μm (ayb). Las figuras fueron adaptadas de Xu et al. 12 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Identidad neuronal de las células antenales que expresan LmigORs por detecciones cromogénicas . ( Ab ) Patrón de etiquetado de la sonda antisentido LmigOR1 ( a ) y LmigORco ( b ) en secciones consecutivas de antenas de langostas. ( Cd ) Patrón de etiquetado de la sonda antisentido LmigORco ( c ) y LmigOR2 ( d ) en secciones consecutivas de la antena de langostas. ( Ef ) Ilustración de estructuras dendríticas ocasionalmente marcadas (indicadas por flechas rojas). Barras de escala = 50 μm (ad); 20 mu m (ey f). Las figuras fueron adaptadas de Xu et al. 12 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Nt "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figura 5: LmigOR1 y LmigOR2 se expresan en ORNs alojados en Basiconic Sensilla. (Ab) basiconic sensillum alojado ORNs expresan LmigOR1 (a) y LmigOR2 (b). ( Cd ) La expresión de LmigOR1 y LmigOR2 en el subconjunto distinto de ORN antenal se verificó en secciones consecutivas (cd). Las puntas de flecha denotan células antenales que expresan LmigOR1 (a, c) y LmigOR2 (b, d). Ba: basiconic sensillum. Barras de escala = 20 μm (ayb); 50 mu m (c y d). Las figuras fueron adaptadas de Xu et al. 12 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Identidad neuronal de la célula antenal que expresa LmigOR1 mediante detecciones de TSA. (A) de dos colores hibridación in situ se realizó en sección longitudinal antenal para ilustrar la expresión de LmigOR1 (Rojo) y LmigORco (verde). La localización de LmigOR1-expresando las células en los grupos de células que expresan LmigORco confirmó su identidad neuronal. ( B ) Vista cercana de las áreas en caja en a. Ocasionalmente, las estructuras dendríticas similares se indican mediante una flecha. Las áreas circundadas indican ORNs agrupando expresando LmigORco y compartiendo el mismo sensillum. Barras de escala = 50 μm (a); 20 mu m (b). Las figuras fueron adaptadas de Xu et al. 12 Por favor CLame aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: LmigOR1 y LmigOR2 se localizaron a diferentes ORNs Sensoria Basiconic por detección de TSA. Las señales fluorescentes se visualizaron usando sistemas de detección, indicando que las neuronas marcadas con LmigOR1 por fluorescencia verde ( a ) y las células LmigOR2 positivas por fluorescencia roja ( b ) se expresaron en diferentes subtipos ( c ) de sensilla básicos. Las puntas de flecha indican las células antenales que expresan LmigOR1 y LmigOR2 . Barras graduadas = 20 μm. Las figuras fueron adaptadas de Xu et al. 12 Haga clic aquí para ver unaVersión más grande de esta figura.
| Nombre | Secuencias |
| Lmig OR1-sonda-s | 5'-AAGGGGTGGGAGACGGCCTG-3 ' |
| Lmig OR1-probe-as | 5'-CAGCTCCTCCCCAACGACAGC-3 ' |
| Lmig OR2-sonda-s | 5'-ATGGGTGAGCGTGGAGAGGC-3 ' |
| Lmig OR2-probe-as | 5'-GGTCATCGCTGTGGACGTGG-3 ' |
| Lmig Orco-sonda-s | 5'-CTCGTCTGACAGCGTAACTCAC-3 ' |
| Lmig Orco-probe-as | 5'-AAGACGCAGAAGAGGAAGACCT-3 ' |
Tabla 1: Secuencias de los cebadores de PCR.
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Discussion
Es difícil realizar ARN ISH para localizar los genes OR en las antenas de insectos porque los niveles de expresión de los genes OR, excepto ORco , son muy bajos y preservar cortes histológicos de antenas de insectos es muy difícil. Además, la detección de TSA es también muy difícil. Para abordar estos problemas, deben tomarse las siguientes medidas. Las antenas se seleccionan de las langostas adultas de nueva mutación que tienen cutículas antenales finas y suaves, que mantienen su morfología en la diapositiva. Las muestras congeladas se seccionan en rebanadas de 12 μm de grosor. Se utilizan sondas altamente sensibles y específicas marcadas con biotina y DIG. Detergentes, tales como Tween-20 y Triton X-100, se utilizan para disminuir el fondo en muchos pasos. En la detección de TSA, un gen altamente expresado, en relación con otro gen poco expresado, debe ser marcado con biotina-16-UTP. Las diapositivas deben ser observadas tan pronto como sea posible porque las señales fluorescentes se apagarán rápidamente.
DIGAY las sondas marcadas con biotina tienen las ventajas de una vida útil más larga, mayores relaciones señal / ruido y mejores resoluciones celulares que las sondas radiactivas 18 , 19 . El protocolo presentado en este documento tiene algunas ventajas sobre toda la hibridación in situ de montaje. Este protocolo identifica fácilmente las localizaciones de genes a nivel celular pero no puede ser fácilmente utilizado para investigar los patrones de distribución génica, que se realiza más fácilmente con hibridación in situ de montaje completo.
Para identificar un gen OR se tomaron dos enfoques. Una fue la detección cromogénica en secciones consecutivas, y la otra fue detección fluorescente en una sección. ORco se co-expresa con un OR específico como un marcador ORN 10 , 20 , 21 . Las células que expresan LmigOR1 o LmigOR2 se localizaronA los grupos de LmigORco que expresan las células que inequívocamente verificado como OR ( Figura 4 y Figura 6 ]. Usando los mismos enfoques, encontramos que LmigOR1 y LmigOR2 no se co-expresan en un sensillum. Los resultados de estos dos enfoques son corroborativos.
Este protocolo también se utilizó con éxito para localizar LmigORco, SgreORco, SgreIR8a y SgreIR25a en las antenas de langosta 10 , 14 . Recientemente LmigOR3 se localizó en neuronas tricino sensilla en L. migratoria utilizando el mismo protocolo [ 15] . Este protocolo se utilizó para localizar dos proteínas sensoriales de la membrana neural SgreSNMP1 y SgreSNMP2 en las antenas de S. gregaria [ 16] . Por lo tanto, este protocolo localizó de manera fiable genes relacionados con quimiosensores en antenas de langostas, que no sólo verificaron estosGenes candidatos, pero también localizó estos genes a células específicas alojadas en diferentes tipos de sensilla.
En conclusión, este protocolo altamente efectivo de ARN ISH se describe específicamente para localizar los genes OR, así como otros genes expresados en niveles bajos, en antenas de insectos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar o cualquier otro conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por una subvención de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No.31472037). La mención de nombres comerciales o productos comerciales en este artículo es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 2×TSINGKETM Master Mix | TSINGKE, China | TSE004 | |
| RNase-free H2O | TIANGEN, China | RT121-02 | |
| REGULAR AGAROSE G-10 | BIOWEST, SPAIN | 91622 | |
| Binding buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Balance buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Wash solution | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| T Vector | Promega, USA | A362A | |
| T4 DNA Ligase | Promega, USA | M180A | |
| Escherichia coli DH5α | TIANGEN, China | CB101 | |
| Ampicillin | Sigma, USA | A-6140 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Inalco, USA | 1758-1400 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | SBS Genetech, China | GX1-500 | |
| Nco I | BioLabs, New England | R0193S | |
| Spe I | BioLabs, New England | R0133M | |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| Biotin RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11685597910 | |
| DNase | DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| LiCl | Sinopharm, China | 10012718 | |
| Ethanol | Sinopharm, China | 10009257 | |
| Acetic acid | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands | 4583 | |
| Slides | TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China | FISH0010 | |
| HCl | Sinopharm, China | 80070591 | |
| Millex | Millipore, USA | SLGP033RS | |
| Tween 20 | AMRESCO, USA | 0777-500ML | |
| Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt | Roche, Switzerland | 11175041910 | |
| Glycerol | Sinopharm, China | 10010618 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | V900483-1KG | 0.04 mol/L Tris-Base |
| 1×Tris-acetate-EDTA | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | 0.12% acetic acid |
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | 03677 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | Sinopharm, China | 10019392 | 10 g/L NaCl |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM335231 | 10 g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM361526 | 5 g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | Sinopharm, China | 10019392 | 10 g/L NaCl |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM335231 | 10 g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM361526 | 5 g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | WISENT ING, Canada | 800-010-CG | 15 g/L Agar Bacteriological Grade |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sinopharm, China | 10019392 | 8.5% NaCl |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sigma, USA | V900041-500G | 14 mM KH2PO4 |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sigma, USA | V900268-500G | 80 mM Na2HPO4 |
| 10×Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5) | Sigma, USA | V900483-1KG | 1 M Tris-Base |
| 10×Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5) | Sinopharm, China | 10019392 | 1.5 M NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sigma, USA | V900483-1KG | 100 mM Tris-Base |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sinopharm, China | 10019392 | 100 mM NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sigma, USA | V900020-500G | 50 mM MgCl2·6H2O |
| 20×saline-sodium citrate (pH 7.0) | Sinopharm, China | 10019392 | 3 M NaCl |
| 20×saline-sodium citrate (pH 7.0) | Sigma, USA | V900095-500G | 0.3 M Na-Citrate |
| 4% paraformaldehyde solution (PFA, pH 9.5) | Sigma, USA | V900894-100G | 4% paraformaldehyde |
| Sodium Carbonate Buffer | Sigma, USA | V900182-500G | 0.1 M NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2) | Sigma, USA | V900182-500G | 80 mM NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2) | Sigma, USA | S7795-500G | 120 mM Na2CO3 |
| Formamide Solution (pH 10.2) | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Formamide Solution (pH 10.2) | 5×saline-sodium citrate | ||
| Blocking Buffer in TBS | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1% Blot |
| Blocking Buffer in TBS | AMRESCO, USA | 0694-500ML | 0.03% Triton X-100 |
| Blocking Buffer in TBS | 1×Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase solution | Blocking Buffer in TBS | ||
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Blocking Buffer in TBS | ||
| Hybridization Buffer | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Hybridization Buffer | 2×saline-sodium citrate | ||
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D8906-50G | 10% dextran sulphate |
| Hybridization Buffer | invitrogen, USA | AM7119 | 20 µg/mL yeast t-RNA |
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D3159-10G | 0.2 mg/mL herring sperm DNA |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10 mg/mL) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25 mg/mL) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Detection Buffer | ||
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 2% fluorescein-tyramides |
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | Amplification Diluent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | |||
| Freezing microtome | Leica, Nussloch, Germany | Jung CM300 cryostat | |
| Spectrophotometer | Thermo SCIENTIFIC, USA | NANODROP 2000 | |
| Optical microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus IX71microscope | |
| Confocal microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus BX45 confocal microscope |
References
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