Summary
この論文では、ジゴキシゲニン（DIG）標識またはビオチン標識プローブを用いた昆虫アンテナにおいて、特に低レベル発現匂い受容体（OR）遺伝子ならびに他の遺伝子の詳細かつ非常に有効なRNA in situハイブリダイゼーションプロトコルについて記載している。
Abstract
昆虫は、外因性の化学信号を感知するための洗練された嗅覚受容系を進化させてきた。これらの化学シグナルは、アンテナのケモソーム（chemosensilla）と呼ばれる髪のような構造に収容された嗅覚受容器ニューロン（ORN）によって形質導入される。 ORNの膜上で、嗅覚受容器（OR）は匂いのコード化に関与していると考えられている。したがって、OR遺伝子に局在する遺伝子を同定できることは、OR遺伝子を認識するために必要であり、さらなる機能的in situ研究の基礎を提供する。昆虫のアンテナにおける特定のORのRNA発現レベルは非常に低く、組織学的に昆虫組織を保存することは困難である。したがって、RNA in situハイブリダイゼーションを使用して特定タイプの感覚器にORを局在化することは困難である。この論文では、特に昆虫の低発現OR遺伝子のための詳細かつ非常に有効なRNA in situハイブリダイゼーションプロトコールが導入されている。さらに、特定のOR 遺伝子WAOrcoをマーカーとして共発現する受容体遺伝子を用いた二重蛍光蛍光in situハイブリダイゼーション実験を行うことによって同定された。
Introduction
最も重要な化学感覚器官である昆虫のアンテナは、嗅覚受容器ニューロン（ORN）によって神経支配されている多くの髪のような構造（感覚器と呼ばれる）で覆われています。昆虫ORN類の膜上に、嗅覚受容体（ORS）、7つの膜貫通領域を含むタンパク質の種類は、臭気物質依存性イオンチャネル1、2、3として機能するヘテロマーを形成する共受容体（ORCO）で表されます。異なる論理和は、化学化合物4、5、6の異なる組み合わせに応答します。
Locusts（ Locusta migratoria ）は、主に嗅覚の手掛かりに基づいて重要な行動を誘発します7 。 Locust ORは、分子嗅メカニズムを理解するための重要な要素です。特定のイナゴまたは遺伝子をaのニューロンに局在化させるRNAによる形態特異的な感覚型RNA in situハイブリダイゼーション（RNA ISH）は、ORs機能の探索の第一歩である。
RNA ISHは、標識された相補的RNAプローブを使用して、組織、細胞または全身の部位の特定のRNA配列をインサイチュで測定し、局在化させ、生理学的プロセスおよび疾患の病因への洞察を提供する。ジゴキシゲニン標識（DIG標識）およびビオチン標識RNAプローブは、RNAハイブリダイゼーションにおいて広く使用されている。ジゴキシゲニン-11-UTPまたはビオチン-16-UTPによるRNA標識は、SP6およびT7 RNAポリメラーゼを用いたin vitro転写によって調製することができる。 DIGおよびビオチン標識RNAプローブは以下の利点を有する：非放射性;安全;安定した;高感度;非常に特異的。 PCRおよびインビトロ転写を使用して産生が容易である。 DIGおよびビオチン標識されたRNAプローブは、色原体および蛍光で検出することができます。 DIG標識されたRNAプローブは、抗ジゴキシゲニンアルカリ高感度化学発光基質ニトロブルーテトラゾリウムクロライド/ 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル - ホスフェートトルイジン塩（NBT / BCIP）、または光学顕微鏡を使用して2つの視覚化できるホスファターゼ（AP）共存顕微鏡を用いて4-クロロ-2-メチルベンゼンジアゾニウムヘミ - 塩化亜鉛塩（ファストレッド）とカップリングした4-ヒドロキシ-3-ナフトエ酸-2'-フェニルアニリドリン酸塩（HNPP）ビオチン標識RNAプローブは、共焦点顕微鏡を使用してフルオレセイン - チラミドで視覚化することができる抗ビオチンストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP） - コンジュゲート抗体で検出することができる。したがって、二色蛍光in situハイブリダイゼーションを実施して、DIGおよびビオチン標識RNAプローブを用いて、1つのスライス中の2つの標的遺伝子を検出することができる。
DIGおよび/またはビオチン標識プローブを用いたRNA ISHは、嗅覚関連遺伝子、例えばOR 、イオノトロピック受容体、匂い物質結合タンパク質感覚ニューロン膜タンパク質、 キイロショウジョウバエ 、 ハマダラカ 、L.のmigratoriaと砂漠バッタSchistoceraグレガリア 8、9、10、11、12、13、14、15、16、これらに限定され昆虫のアンテナではなく、です。 （1）OR遺伝子（ ORcoを除く）が低レベルで、少数の細胞でのみ発現され、シグナル検出を非常に困難にし、（2）昆虫組織を保存するためのRNA ISHを行う際に、2つの大きな課題がある。形態学が保存され、背景雑音が低いような組織学は、困難であり得る。この論文では、昆虫におけるOR遺伝子の局在化のためのRNA ISHを説明する詳細で効果的なプロトコル発色およびTyramide Signal Amplification（TSA）検出の両方を含むアンテナが提示されます。
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Protocol
注：RNA分解を制限するために、湿式オートクレーブ蒸留水（121℃で60分間）および湿式オートクレーブ材料を使用して溶液を調製します。
RNA ISHアンチセンスプローブおよびセンスプローブの調製
- 標的遺伝子増幅および精製
- 断片の両端にアデニンを付加Taq DNAポリメラーゼとLmigOR1の完全長cDNAを含むプラスミドから：まず、L. migratoria OR1（JQ766965 LmigOR1、GenBankの）の387 bpの二本鎖断片を生成します。
- 50μLの2x反応混合物、4μLのセンスおよびアンチセンスプライマー（ 表1 ）、1μLのプラスミドテンプレート、および41μLのRNaseフリーH 2 Oを含む100μLの最終反応容量を使用します。以下のPCRプロトコル：94℃で5分間、続いて94℃で30秒間、55℃で30秒間および72℃で1分間の30サイクル続いて72℃で10分間インキュベートした。
- これらのステップを繰り返して、 LmigOR2 （GenBank：JQ766966）の1,303bp二本鎖フラグメントおよびLmigorco （GenBank：JN989549）の1,251bp二本鎖フラグメントを作製する 。これらの実験で使用したプライマーを表1に示す 。
- 1.2％アガロースゲル上で1×Tris-アセテート-EDTA緩衝液中でPCR産物を泳動し、エチジウムブロマイド染色を用いて視覚化する。
- これらのPCR産物をゲル抽出キットを用いて抽出する。
- 電気泳動後、ゲルからDNAバンドを切り出し、ゲルスライスを1.5mLチューブに入れる。次に、0.1 gのゲルスライスあたり100μLの結合バッファー（Buffer PN）を添加する。ボルテックスし、ゲルスライスが完全に溶解するまで50℃でインキュベートする。
- コレクションチューブにCA2吸着カラムを挿入し、500μLの平衡バッファー（Buffer BL）を添加する。これにより、シリカ膜の吸収能力および安定性が改善される。セントリ12,400×gで1分間フュージします。
- 溶解したゲル混合物を吸着カラムアセンブリに移し、室温で2分間インキュベートする。次に、チューブを12,400 xgで1分間遠心します。フロースルーを捨て、吸着カラムをコレクションチューブに再び挿入します。
- 600μLの洗浄液（エタノール添加、Buffer PW）を2回加える。 12,400×gで1分間遠心分離する。フロースルーを捨て、吸着カラムをコレクションチューブに再び挿入します。
- 回収チューブを空にし、カラムアセンブリを12,400 xgで2分間遠心分離して、残留エタノールを蒸発させます。
- 慎重に、吸着カラムを清潔な1.5 mL遠心チューブに移す。ペレットを5〜10分間空気乾燥させ、ヌクレアーゼフリー水の適切な容量（ 例えば、 30μL）でDNAを再溶解する。
- RTで2分間インキュベートする。 12,400×gで2分間遠心分離する。吸着カラムを捨て、DNAを4℃または-20℃で保存します。
- 断片の両端にアデニンを付加Taq DNAポリメラーゼとLmigOR1の完全長cDNAを含むプラスミドから：まず、L. migratoria OR1（JQ766965 LmigOR1、GenBankの）の387 bpの二本鎖断片を生成します。
- 組換えプラスミドを構築する
- 個別LmigOR1、LmigOR2の1303 bp断片及びT7（上流）及びT4 DNAリガーゼを用いて挿入されたDNAに隣接するSP6（下流）RNAポリメラーゼのためのプロモーターを含有するTベクターへLmigORcoの1,251 bp断片の387 bp断片を連結。以下の10μLの反応液を調製する：2×ライゲーションバッファー5μL、Tベクター1μL、挿入遺伝子DNA3μL（〜100ng）およびT4 DNAリガーゼ1μLを加え、4℃でO / Nインキュベートする。
- LmigOR1の387bp断片、 LmigOR2の1,303bp断片およびLmigorcoの1,251bp断片を、滅菌1.5mLチューブ中の50μLのコンピテントエシェリヒア・コリ DH5α細胞に別々に含む各組換えプラスミド5μLを加える。
- 静かに混合し、30分間氷中にチューブを入れ、42℃で90秒間インキュベートする。℃。それらを3分間氷の中に戻す。
- すべてのチューブにアンピシリンなしルリア-ベルターニ（LB）液体培地450μLを添加し、 大腸菌 DH5αを復元するために、37℃で1時間、150rpmで振とう機でそれらをインキュベートします。
- 50μg/ mLアンピシリン、24μg/ mLイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）、および40μg/ mL 5-ブロモ-4を含むLB固体基質プレートに接種するために、各形質転換体の100μLアリコートを取り、 - クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド（X-gal）である。
- これらのプレートを一定のインキュベーター内で37℃で18時間インキュベートする。青 - 白スクリーニング法を用いて標的組換えプラスミドをスクリーニングする。サンガー配列決定を用いて標的組換えプラスミドを配列決定し、3つのOR遺伝子の挿入方向を同定する。
- 制限エンドヌクレアーゼを選択して組換えプラスミドを線状化する
- 制限エンドヌクレアーゼの使用ベクターは、ベクターの複数のクローニング部位を消化するだけでなく、挿入DNAを切断しない。この実験では、3つの遺伝子すべてが、ベクターの方向に対応する方向でTベクターに挿入される。
- アンチセンスプローブを生成するためにLmigOR1の387 bp断片、LmigOR2の1303 bp断片とLmigORcoの1,251 bpの断片を含む組換えプラスミドを線形化するためのNco I制限エンドヌクレアーゼを使用します。 Spe I制限エンドヌクレアーゼを用いてセンスプローブを作製する。
注：挿入方向がベクターの挿入方向と一致する場合、T7の末端からのユニークな制限部位を選択して組換えプラスミドを線状化し、SP6 RNAポリメラーゼを用いてアンチセンスプローブを調製する。 SP6の末端からのユニークな制限部位を選択して組換えプラスミドを線状化し、T7 RNAポリメラーゼを用いてセンスプローブを調製する。そうでない場合、挿入方向がtに対応しない場合SP6の末端からのユニークな制限部位を選択して組換えプラスミドを線状化し、T7 RNAポリメラーゼを用いてアンチセンスプローブを調製する。 T7の末端からのユニークな制限部位を選択して組換えプラスミドを線状化し、SP6 RNAポリメラーゼを用いてセンスプローブを調製する。
- 線状化された組換えプラスミドの精製
- LmigOR1の387bp断片、 LmigOR2の1,303bp断片およびLmigorcoの1,251bp断片を含む10個の10μLの反応液にNcoI制限エンドヌクレアーゼを用いた3種の組換えプラスミド20μgを10μlの緩衝液、 40μlの0.5μg/μLのプラスミド、 3μLのNcoIおよび47μLのRNaseフリーH 2 Oを添加し、続いて37℃で3時間インキュベートした。
- 同様に、20μgのこれらの3つの組換えプラスミドuSpe I制限エンドヌクレアーゼを歌う。
- これらの消化したプラスミドを1.1.2に記載のゲル抽出キットを用いて精製する。抽出した線状化組換えプラスミドの濃度を分光光度法で測定し、0.5μg/μLに調整する。
- アンチセンスとセンスプローブの準備
- T7 / SP6 RNA転写システムを使用して、アンチセンスプローブおよびセンスプローブを生成する。 SP6 RNAポリメラーゼを使用して、インビトロで鋳型としての線状化組換えプラスミドを用いて、これら3つのOR遺伝子のDIGおよびビオチン標識アンチセンスプローブの二本鎖RNAを転写する。 T7 RNAポリメラーゼを用いてセンスプローブを生成する。 10倍のNTPミックス2μL、10X転写バッファー2μL、RNaseインヒビター1μL、T7またはSP6 RNAポリメラーゼ2μL、0.5μg/μLの線状化プラスミド4μL、および2μLの線状化プラスミドを含む20μLの最終容量で反応を行い、 9μLのRNaseフリーH 2 O、続いて37℃で3時間インキュベーションすることにより実施した。
- DIGおよびビオチン標識したアンチセンスおよびセンスプローブを37℃で1μLのDNaseで30分間インキュベートする。 2.5μLの5 M LiClと75μLの無水エタノールを添加し、反応物を-70°Cで30分間インキュベートする。
- 4℃で30分間、15,000×gで遠心分離する。慎重に上清を傾瀉する。沈殿剤を洗浄するために150μLの70％エタノールを加える。滅菌蒸留水（263.2mL）に95％エタノール（736.8mL）を加えて70％エタノール（1L）を調製する。
- 再び4℃で15,000 xgで30分間遠心分離し、ペレットを室温で5〜10分間風乾します。 25μLのRNaseフリーH 2 Oを添加して、RNAアンチセンスおよびセンスプローブを溶解させます。
- 挿入された遺伝子の長さが1kbより長い場合は、続いて重炭酸塩 - 炭酸塩緩衝液中でのインキュベーションによって〜300bpの平均長さまでプローブRNAアンチセンスおよびセンスプローブを断片化する。 50μLの最終容量で反応を実施する.cRNAプローブのontaining 25μLおよび重炭酸塩-炭酸塩緩衝液25μL（80mMのNaHCO 3を、120mMののNa 2 CO 3、pHは10.2）60℃。必要とされる加水分解時間は、以前に公表された式17によって与えられる。
- 5μLの10％酢酸を加えて反応を停止する。この実験では、 LmigOR2およびLmigORcoのアンチセンスおよびセンスプローブをそれぞれ24および23分間断片化する。
T =（L 0 -LのF）/ KXL O XL F
L oは KB中の初期断片長=
L f = kbでの最終断片長さ
k =加水分解速度定数、約0.11 kb -1 min -1
t = minにおける加水分解時間 - 最後に、250μLのハイブリダイゼーション緩衝液を添加し、-80℃で保存する。
2.クライオスタットセクションの準備
- プレクールフリーズミクロトーム、すなわち-24℃。
- 活発で、元のままのアンテナを持っている新しい脱皮成虫のイナゴを選択してください。滅菌カミソリを使用してアンテナを2〜3mmの部分に切断します。
- 凍結ミクロトームホルダーにOCT化合物を入れ、1〜2個のサンプルを化合物上に水平に置く。次にホルダーを-24℃で凍結ミクロトームに移し、化合物が凍結するまで平衡化させます。ホルダーを取り出し、少量の化合物でサンプルを覆います。ホルダーを凍結ミクロトームに-24℃で少なくとも10分間再度移す（ 図1 ）。
注：化合物に泡が入らないようにしてください。 - サンプルが入ったホルダーを凍結ミクロトームに固定し、凍結したサンプルを-24℃で厚さ12μmの切片に分ける。
- スライスをスライド（25 x 75 mm;ヌクレアーゼフリー）に1枚ずつ解凍し、10分間風乾します。
3.固定部
- クライオスタットを準備した後スライドをプラスチック容器（約100 x 40 x 80 mm）に入れ、スライドを4％パラホルムアルデヒド溶液（PFA）中で4℃で30分間インキュベートすることによって組織を固定する。
- スライドを1Xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で1分間洗浄する。
- アルカリ性タンパク質を除去するために、スライドを0.2M HClに10分間移す。
- 核酸の表面タンパク質を除去するために、スライドを1％Triton X-100を含む1XPBSに2分間移す。
- 1×PBSで30秒間スライドを2回洗浄する。
- 最後に、4℃で10分間ホルムアミド溶液でスライドをすすいでください。
4.ハイブリダイゼーション
- アンチセンスプローブとセンスプローブの準備
- ハイブリダイゼーションバッファーを使用して、1.5 mLのヌクレアーゼフリーチューブでRNAアンチセンスまたはセンスプローブを希釈します。この実験では、すべてのアンチセンスプローブおよびセンスプローブ（ LmigOR1、LmigOR2、およびLmigOrco ）について、 99μにプローブ1μLを添加するLハイブリダイゼーションバッファーを含む。一般に、アンチセンスプローブの1：100希釈物の使用は、このプロトコールを用いて有意な陽性シグナルおよび低いバックグラウンドを産生する。
- 色素産生検出のために、DIG標識プローブを個別に希釈する。
- TSA検出のために、ハイブリダイゼーション緩衝液中で一緒にビオチン標識LmigOR1プローブとビオチン標識LmigOrcoプローブまたはDIG標識LmigOR2とDIG標識LmigOR1を希釈します。
- 希釈液を65℃で10分間加熱し、少なくとも5分間氷上に置く。
- ハイブリダイゼーション
- スライドを排出し、100μLの希釈アンチセンスおよびセンスプローブ（ステップ4.1）を組織切片に加える。次に、組織切片上にカバースリップ（24mm×50mm;ヌクレアーゼフリー）を置く。
- カバーされたスライドを湿ったボックス（〜300 x 180 x 50 mm 3 ; 図2 ）に水平に置き、t 55℃で22時間。箱の底にホルムアミド溶液または1X PBSを加えて湿らせた状態に保ちますが、スライドを液体に浸しないでください。
- 洗濯およびブロッキング。
- ハイブリダイゼーション後、カバーガラスを注意深く取り除きます。 60℃で0.1×生理食塩水（SSC）中で30分間スライドを2回洗浄する。
注：洗浄とは、スライドホルダーにスライドを入れ、プラスチック容器に入れ、ロッカーでゆっくりかき混ぜることです（約50 rpm、 図2 ）。 - スライドを30秒間、1×トリス緩衝食塩水（TBS）ですすいでください。
- 各スライド上の0.03％Triton X-100を添加したTBS中の1％ブロッキング試薬1mLを加え、30分間インキュベートする。次に、ブロッキング溶液を捨てる。
- ハイブリダイゼーション後、カバーガラスを注意深く取り除きます。 60℃で0.1×生理食塩水（SSC）中で30分間スライドを2回洗浄する。
- 免疫組織化学。
- 色素産生検出のために、TBS中のブロッキング試薬を使用して、750単位（U）/ mLの抗ジゴキシゲニンAP結合抗生物質1.5U / mLのAP溶液に希釈する。カバーされたスライド（24mm×50mm）あたり100μLのAP溶液を加える。
- TSA検出のために、750U / mLの抗ジゴキシゲニンAP結合抗体および抗ビオチンストレプトアビジンHRP結合抗体をAP / HRP溶液に希釈するために、TBS中のブロッキング試薬を使用する。カバーされたスライド（24mm×50mm）あたり100μLのAP / HRP溶液を加える。
- スライドを湿った箱（ 図2 ）にインキュベートし、37℃で60分間インキュベートする。ホルムアルデヒド溶液または1X PBSを使用して、箱をしっとりとした状態に保ちます。
5.染色
- カバーガラスを注意深く取り外します。 0.05％Tween-20を添加した1×TBSで5分間スライドを3回洗浄する。スライドをDAP緩衝液（色素生成検出：pH9.5; TSA検出：pH8.0）で5分間すすぐ。
- 染色（発色検出）
- 100μLのNBT（375μg/ mL）/ BCIP（188μg/ mL）基質溶液（DAPで希釈;pH 9.5）を各スライドに添加した。カバーガラス（24 x 50 mm）を注意深くスライドに置きます。
- スライドを、基質溶液を含む湿った箱に10分間インキュベートする（37℃でO / N）。
注：スライドを顕微鏡で随時見ることで開発を確認してください。 - 展開が完了したら、スライドを水に移すことによって反応を停止する。
- 染色（TSA検出）
- シリンジフィルター（0.22μm; 図2 ）からHNPP（100μg/ mL）/ Fast Red（250μg/ mL）基質を移動するためにシリンジを使用してください。
- カバースリップ（24×50mm）で覆われたスライドあたり100μLのHNPP / Fast Red基質を加える。 RTでHNPP / Fast Red基質と30分間スライドをインキュベートする。
- カバーガラスを慎重に取り出し、0.05％Tween-20を添加した1X TBSで5分間スライドを3回洗浄する。
- 100μLのTSA基質/被覆（24×50mm 2 ）スライド。室温で10分間、TSA基質とスライドをインキュベートする。
- カバーガラスを慎重に取り出し、0.05％Tween-20を添加した1×TBSで5分間スライドを3回洗浄する。
- PBS /グリセロール（1：3）にスライドを埋め込みます。
注：これらの手順を完了した後、蛍光シグナルが急速に消光するため、スライドをできるだけ早く観察する必要があります。
6.観測
- クロモジェニック検出
- 組織切片を光学顕微鏡で観察する。 10X、20X、40Xの対物レンズを選択して、発色検出の結果を観察します。
- DP-BSWソフトウェアを使用して結果を解析し、画像をキャプチャします。
- TSA検出
- 共焦点顕微鏡を用いて組織切片を観察する。 DIG標識遺伝子は543nmの光下で観察され、赤色を呈し、ビオチン標識遺伝子は488nm光下で観察され、緑色を呈する。彼らが出現すると、彼らは黄色を呈する。
- 20Xと40Xの対物レンズを選択して、それぞれTSA検出の結果を観察します。
- FV1000ソフトウェアを使用して結果を解析し、画像をキャプチャします。
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Representative Results
色素産生の検出では、すべての成人の触角部分における触角細胞の小さなサブセットを、DIG標識LmigOR1およびLmigOR2アンチセンスプローブで示した（ 図3 ）。 LmigOR1とLmigOR2を局在化するために連続切片上のRNA ISHは、二つの遺伝子を発現する触角細胞が推定LmigOR1とLmigOR2が実際ORN類（ 図4aの -4D）で発現させたことを示す、LmigORcoを発現ORNクラスターに位置していたことを示しました。場合によっては、標識された樹状様構造が視覚化された（ 図 4e〜4f ）。 LmigOR1とLmigOR2は、両方ともbasiconic sensilla（ 図 5a〜5b）のニューロンに局在していたが、個々のsensillaで共発現されず、異なるbasicoに存在していた NIC sensilliumサブタイプ（ 図5c-5 D）。
TSA検出において、二色蛍光in situハイブリダイゼーションは、 LmigOR1発現細胞（赤色）がLmigorco （緑色）を発現するORNクラスターに位置し、推定LmigOR1がORNで発現されたことを示した（ 図6a ）。 図6aのボックス領域の詳細図が図6bに示されている。 LmigOR1発現ニューロン（緑色、 図7a ）およびLmigOR2発現ニューロン（赤色、 図7b ）は、異なるbasiconic sensilliumサブタイプに位置していた（ 図7c ）。
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図1：RNA in situハイブリダイゼーションのための昆虫アンテナセクションの調製。 （ a ）凍結ミクロトーム; （ bc ）試料を凍結OCT化合物に包埋する。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2：RNA in situハイブリダイゼーションの 実験項目 。 （ a ）スライドホルダーとプラスチック容器。 （ b ）湿った箱。 （ c ）ロッカー。 （ d ）メンブレンフィルター。 （ e ）共焦点顕微鏡。 .jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：嗅覚器官におけるLmigOR1 ＆ LmigOR2の細胞局在化。 （ a ）イナゴの触角部におけるLmigOR1発現細胞の概要。 （ b ）イナゴの触角部におけるLmigOR2発現細胞の概要。矢じりはLmigOR1（a）およびLmigOR2（B）を発現する細胞を示します。スケールバー=100μm（aおよびb）。図はXu et al。 12 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4：クロモジェニック検出によるLmigORを発現するアンテナ細胞のニューロンの同一性。 （AB）LmigOR1（a）およびLmigORcoバッタアンテナの連続切片上の（b）は、アンチセンスプローブの標識パターン。 （ cd ） Locustアンテナの連続セクションにおけるLmigORco （ c ）およびLmigOR2 （ d ）アンチセンスプローブのラベリングパターン。 （ ef ）時折標識された樹状様構造（赤い矢印で示される）の図。スケールバー=50μm（広告）; 20μm（eおよびf）。図はXu et al。 12 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 nt "fo：keep-together.within-page =" 1 ">
図5： Basicic Sensillaに収容されたORNでLmigOR1とLmigOR2が表現されています。 （AB）Basiconic感覚子はLmigOR1（a）およびLmigOR2（B）を発現ORN類を収容しました。 （ cd ）連続した切片（CD）において、触角ORNの異なるサブセットにおけるLmigOR1およびLmigOR2の発現が確認された。 矢印は、 LmigOR1 （a、c）およびLmigOR2 （b、d）を発現する触角細胞を示す。 Ba：基底膜感覚。スケールバー=20μm（aおよびb）。 50μm（cおよびd）。図はXu et al。 12 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図6：TSA検出によるLmigOR1を発現するアンテナ細胞のニューロンの同一性。 （ a ） LmigOR1 （赤色）およびLmigorco （緑色）の発現を説明するために、縦の触角部に2色in situハイブリダイゼーションを行った。 LmigORcoを発現する細胞クラスターで細胞を発現性LmigOR1の局在は、その神経の同一性を確認しました。 （ b ） aの囲み領域のクローズドビュー。場合によっては標識された樹状突起様構造を矢印で示した。 円形の領域は、 Lmigorcoを発現し、同じ感覚を共有するORNをクラスター化することを示す。スケールバー=50μm（a）。 20μm（b）。図はXu et al。 12 してくださいこの図のより大きなバージョンを見るにはここを舐めてください。
図7： LmigOR1とLmigOR2は、TSA検出による異なるBasiconic Sensilla ORNに位置していました。蛍光シグナルは、緑色蛍光（ a ）によるLmigOR1標識されたニューロンおよび赤色蛍光（ b ）によるLmigOR2陽性細胞が異なる塩基性感覚サブタイプ（ c ）で発現されたことを示す検出システムを用いて視覚化された。 矢印は 、 LmigOR1およびLmigOR2を発現する触角細胞を示す。スケールバー=20μm。図はXu et al。 12 ここをクリックしてこの図のより大きなバージョン。
| 名 | シーケンス |
| Lmig OR1-probe-s | 5'-AAGGGGTGGGAGACGGCCTG-3 ' |
| Lmig OR1-probe-as | 5'-CAGCTCCTCCCCAACGACAGC-3 ' |
| Lmig OR2-probe-s | 5'-ATGGGTGAGCGTGGAGAGGC-3 ' |
| Lmig OR2-probe-as | 5'-GGTCATCGCTGTGGACGTGG-3 ' |
| オルミックプローブ | 5'-CTCGTCTGACAGCGTAACTCAC-3 ' |
| Lmig Orco -probe-as | 5'-AAGACGCAGAAGAGGAAGACCT-3 ' |
表1：PCRプライマーの配列。
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Discussion
ORCO以外のOR遺伝子の発現レベルが非常に低く、昆虫アンテナの組織学的スライスを保存することが非常に困難であるため、昆虫のアンテナでOR遺伝子を局在化するRNA ISHを行うことは困難である。さらに、TSAの検出も非常に難しいです。これらの問題に対処するには、以下の措置を講じる必要があります。アンテナは、スライド上に形態を維持する薄く柔らかい触角鞘を有する新しく成虫の成虫から選択される。凍結サンプルを厚さ12μmのスライスに切る。高感度かつ特異的なビオチン標識プローブおよびDIG標識プローブが使用される。 Tween-20およびTriton X-100などの洗剤は、多くの段階でバックグラウンドを減少させるために使用されます。 TSAの検出では、低発現遺伝子と比較して高発現遺伝子をビオチン-16-UTPで標識する必要があります。蛍光シグナルは急速に消光するため、できるだけ早くスライドを観察する必要があります。
DIG- aNDビオチン標識プローブは、放射性プローブ18、19よりも長い貯蔵寿命の利点は、ノイズ比に対してより高い信号およびより良好な細胞の解像度を有しています。この論文で提示されたプロトコールは、全マウントin situハイブリダイゼーションに優るいくつかの利点を有する。このプロトコルは、細胞レベルでの遺伝子の局在を容易に同定するが、遺伝子導入パターンを調べるために容易に使用することはできない。これは、全面的なインシトゥハイブリダイゼーションにより容易に実施される。
OR遺伝子を同定するために、2つのアプローチがとられた。 1つは連続した切片における発色の検出であり、もう1つは1つの切片における蛍光の検出であった。 ORCOは、共発現される特異的でOR ORNマーカー10、20、21のようになります。 LmigOR1またはLmigOR2を発現する細胞は両方ともLmigorco発現細胞のクラスターにそれらを明白にORした（ 図4および図6 ）。同じ手法を用いて、我々はLmigOR1とLmigOR2が1つの感覚器官で同時発現しないことを見出した。これら2つのアプローチの結果は裏付けです。
このプロトコルはまた、正常イナゴアンテナ10、14にLmigORco、SgreORco、SgreIR8aとSgreIR25aを局在化するために使用しました。最近、 LmigOR3はL. migratoriaのトリコイド感覚ニューロンに同じプロトコールを用いて局在化した15 。このプロトコールを用いて、2つの感覚神経膜タンパク質 S. グリアニアのアンテナのSgreSNMP1とSgreSNMP2 16 。したがって、このプロトコルは、ローカストアンテナで化学感覚関連遺伝子を確実に局在化させ、異なる種類の感覚器に収容された特定の細胞にこれらの遺伝子を局在化させた。
結論として、RNA ISHのこの非常に有効なプロトコルは、昆虫アンテナにおいて低レベルで発現されるOR遺伝子および他の遺伝子を局在化するために具体的に記載される。
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Disclosures
著者は開示すべき事項やその他の利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、中国国立自然科学財団（No.31472037）からの助成金によって支えられている。この記事の商号または商用製品についての言及は、特定の情報を提供することのみを目的としており、推薦を意味するものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 2×TSINGKETM Master Mix | TSINGKE, China | TSE004 | |
| RNase-free H2O | TIANGEN, China | RT121-02 | |
| REGULAR AGAROSE G-10 | BIOWEST, SPAIN | 91622 | |
| Binding buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Balance buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Wash solution | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| T Vector | Promega, USA | A362A | |
| T4 DNA Ligase | Promega, USA | M180A | |
| Escherichia coli DH5α | TIANGEN, China | CB101 | |
| Ampicillin | Sigma, USA | A-6140 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Inalco, USA | 1758-1400 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | SBS Genetech, China | GX1-500 | |
| Nco I | BioLabs, New England | R0193S | |
| Spe I | BioLabs, New England | R0133M | |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| Biotin RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11685597910 | |
| DNase | DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| LiCl | Sinopharm, China | 10012718 | |
| Ethanol | Sinopharm, China | 10009257 | |
| Acetic acid | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands | 4583 | |
| Slides | TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China | FISH0010 | |
| HCl | Sinopharm, China | 80070591 | |
| Millex | Millipore, USA | SLGP033RS | |
| Tween 20 | AMRESCO, USA | 0777-500ML | |
| Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt | Roche, Switzerland | 11175041910 | |
| Glycerol | Sinopharm, China | 10010618 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | V900483-1KG | 0.04 mol/L Tris-Base |
| 1×Tris-acetate-EDTA | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | 0.12% acetic acid |
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | 03677 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | Sinopharm, China | 10019392 | 10 g/L NaCl |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM335231 | 10 g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM361526 | 5 g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | Sinopharm, China | 10019392 | 10 g/L NaCl |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM335231 | 10 g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM361526 | 5 g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | WISENT ING, Canada | 800-010-CG | 15 g/L Agar Bacteriological Grade |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sinopharm, China | 10019392 | 8.5% NaCl |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sigma, USA | V900041-500G | 14 mM KH2PO4 |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sigma, USA | V900268-500G | 80 mM Na2HPO4 |
| 10×Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5) | Sigma, USA | V900483-1KG | 1 M Tris-Base |
| 10×Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5) | Sinopharm, China | 10019392 | 1.5 M NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sigma, USA | V900483-1KG | 100 mM Tris-Base |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sinopharm, China | 10019392 | 100 mM NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sigma, USA | V900020-500G | 50 mM MgCl2·6H2O |
| 20×saline-sodium citrate (pH 7.0) | Sinopharm, China | 10019392 | 3 M NaCl |
| 20×saline-sodium citrate (pH 7.0) | Sigma, USA | V900095-500G | 0.3 M Na-Citrate |
| 4% paraformaldehyde solution (PFA, pH 9.5) | Sigma, USA | V900894-100G | 4% paraformaldehyde |
| Sodium Carbonate Buffer | Sigma, USA | V900182-500G | 0.1 M NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2) | Sigma, USA | V900182-500G | 80 mM NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2) | Sigma, USA | S7795-500G | 120 mM Na2CO3 |
| Formamide Solution (pH 10.2) | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Formamide Solution (pH 10.2) | 5×saline-sodium citrate | ||
| Blocking Buffer in TBS | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1% Blot |
| Blocking Buffer in TBS | AMRESCO, USA | 0694-500ML | 0.03% Triton X-100 |
| Blocking Buffer in TBS | 1×Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase solution | Blocking Buffer in TBS | ||
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Blocking Buffer in TBS | ||
| Hybridization Buffer | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Hybridization Buffer | 2×saline-sodium citrate | ||
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D8906-50G | 10% dextran sulphate |
| Hybridization Buffer | invitrogen, USA | AM7119 | 20 µg/mL yeast t-RNA |
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D3159-10G | 0.2 mg/mL herring sperm DNA |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10 mg/mL) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25 mg/mL) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Detection Buffer | ||
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 2% fluorescein-tyramides |
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | Amplification Diluent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | |||
| Freezing microtome | Leica, Nussloch, Germany | Jung CM300 cryostat | |
| Spectrophotometer | Thermo SCIENTIFIC, USA | NANODROP 2000 | |
| Optical microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus IX71microscope | |
| Confocal microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus BX45 confocal microscope |
References
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