Summary
Dieses Papier beschreibt ein detailliertes und hochwirksames RNA- in situ- Hybridisierungsprotokoll, insbesondere für Low-Level-exprimierte Odorant Receptor (OR) -Gen sowie andere Gene in Insektenantennen unter Verwendung von Digoxigenin (DIG) -markierten oder Biotin-markierten Sonden.
Abstract
Insekten haben anspruchsvolle olfaktorische Empfangssysteme entwickelt, um exogene chemische Signale zu erfassen. Diese chemischen Signale werden von Olfactory Receptor Neurons (ORNs), die in haarähnlichen Strukturen, genannt Chemosensilla, der Antennen untergebracht sind, transduziert. Auf den ORNs-Membranen wird angenommen, dass Odorant-Rezeptoren (ORs) an Geruchscodierung beteiligt sind. So ist es möglich, die auf die ORNs lokalisierten Gene zu identifizieren, um OR-Gene zu erkennen und stellt eine fundamentale Grundlage für weitere funktionelle in situ- Studien dar. Die RNA-Expressionsniveaus von spezifischen ODER- S in Insektenantennen sind sehr niedrig und die Erhaltung von Insektengewebe für die Histologie ist eine Herausforderung. Somit ist es schwierig, ein ODER zu einem bestimmten Typ von Sensilla unter Verwendung von RNA in situ Hybridisierung zu lokalisieren. In diesem Papier wird ein detailliertes und hochwirksames RNA- in situ- Hybridisierungsprotokoll speziell für niedrig exprimierte ODER-Gene von Insekten eingeführt. Darüber hinaus ist eine spezifische OR Gen waS identifiziert durch die Durchführung von doppelfarbigen fluoreszierenden in situ- Hybridisierungsexperimenten unter Verwendung eines coexprimierenden Rezeptor-Gens, Orco , als Marker.
Introduction
Insektenantennen, die die bedeutendsten chemosensorischen Organe sind, sind mit vielen haarähnlichen Strukturen - Sensilla - bedeckt, die von Olfactory Receptor Neurons (ORNs) innerviert werden. Auf der Membran von Insekten-ORNs werden Odorant-Rezeptoren (ODER), eine Art von Protein, das sieben Transmembran-Domänen enthält, mit einem Corezeptor (ORco) exprimiert, um ein Heteromer zu bilden, das als ein geruchshemmender Ionenkanal 1 , 2 , 3 fungiert . Verschiedene ODER reagieren auf verschiedene Kombinationen der chemischen Verbindungen 4 , 5 , 6 .
Heuschrecken ( Locusta migratoria ) beruhen vor allem auf olfaktorischen Cues, um wichtige Verhaltensweisen auszulösen 7 . Heuschrecken-ODER sind Schlüsselfaktoren für das Verständnis molekularer olfaktorischer Mechanismen. Lokalisierung eines spezifischen Heuschrecken-ODER-Gens an das Neuron von aMorphologisch spezifischer Sensillum-Typ durch RNA In situ Hybridisierung (RNA ISH) ist der erste Schritt bei der Erforschung der ODER-Funktion.
RNA ISH verwendet eine markierte komplementäre RNA-Sonde zur Messung und Lokalisierung einer spezifischen RNA-Sequenz im Abschnitt von Gewebe, Zellen oder ganzen Mounts in situ und liefert Einblicke in physiologische Prozesse und Krankheitspathogenese. Digoxigenin-markierte (DIG-markierte) und Biotin-markierte RNA-Sonden wurden in der RNA-Hybridisierung weit verbreitet verwendet. Die RNA-Markierung mit Digoxigenin-11-UTP oder Biotin-16-UTP kann durch in vitro- Transkription mit SP6- und T7-RNA-Polymerasen hergestellt werden. DIG- und Biotin-markierte RNA-Sonden haben folgende Vorteile: nicht radioaktiv; Safe; stabil; hochsensibel; Hochspezifisch; Und leicht zu produzieren mit PCR und in vitro Transkription. DIG- und Biotin-markierte RNA-Sonden können chromogen und fluoreszenz nachgewiesen werden. DIG-markierte RNA-Sonden können mit Anti-Digoxigenin-Alkali nachgewiesen werdenNe Phosphatase (AP) -konjugierte Antikörper, die entweder mit den hochempfindlichen chemilumineszierenden Substraten Nitroblau Tetrazoliumchlorid / 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat-toluidinsalz (NBT / BCIP) unter Verwendung eines optischen Mikroskops oder mit 2 sichtbar gemacht werden können -Hydroxy-3-naphtoesäure-2'-phenylanilidphosphat (HNPP), gekoppelt mit 4-Chlor-2-methylbenzendiazonium-hemi-Zinkchloridsalz (Fast Red) unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops. Biotin-markierte RNA-Sonden können mit Anti-Biotin-Streptavidin-Pferd-Rettich-Peroxidase (HRP) -konjugierten Antikörpern nachgewiesen werden, die mit Fluorescein-Tyramiden unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops sichtbar gemacht werden können. Somit kann eine zweifarbige fluoreszierende in situ- Hybridisierung durchgeführt werden, um zwei Zielgene in einer Scheibe unter Verwendung von DIG- und Biotin-markierten RNA-Sonden zu detektieren.
RNA ISH mit DIG- und / oder Biotin-markierten Sonden wurde erfolgreich verwendet, um olfaktorisch verwandte Gene zu lokalisieren, wie OR , ionotroper Rezeptor, geruchsbindendes ProteinUnd sensorisches Neuronenmembranprotein, in Insektenantennen von, aber nicht beschränkt auf Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria und die Wüstenheuschrecke Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Allerdings gibt es zwei wesentliche Herausforderungen bei der Durchführung von RNA ISH für Insekten-ODER: (1) ODER-Gene (außer ORco ) werden auf niedrigem Niveau und nur in wenigen Zellen exprimiert, was die Signaldetektion sehr schwierig macht und (2) das Insektengewebe konserviert Histologie, so dass die Morphologie erhalten bleibt und das Hintergrundgeräusch ist niedrig, kann eine Herausforderung sein. In diesem Papier ein detailliertes und effektives Protokoll beschreibt RNA ISH für die Lokalisierung von ODER-Genen in InsektAntennen präsentiert werden, einschließlich sowohl chromogene und Tyramide Signal Amplification (TSA) Erkennung.
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Protocol
HINWEIS: Zur Begrenzung des RNA-Abbaus werden Lösungen mit nass-autoklaviertem destilliertem Wasser (bei 121 ° C für 60 min) und auch Nass-Autoklaven-Materialien hergestellt.
1. Herstellung von RNA ISH Antisense und Sense Sonden
- Ziel-Gen-Amplifikation und -Reinigung
- Zuerst ein 387 bp doppelsträngiges Fragment von L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) aus dem Plasmid, das die Volllängen -cDNA von LmigOR1 enthält, mit einer Taq- DNA-Polymerase, die Adenine zu beiden Enden der Fragmente hinzufügt, produzieren.
- Verwenden Sie ein 100 μl Endreaktionsvolumen, das 50 μl 2x Reaktionsmischung enthält, jeweils 4 μl Sense- und Antisense-Primer ( Tabelle 1 ), 1 μl Plasmid-Matrize und 41 μl RNase-freies H 2 O. Verwenden Sie die folgende PCR Protokoll: 94 ° C für 5 min, gefolgt von 30 Zyklen von 94 ° C für 30 s, 55 ° C für 30 s und 72 ° C für 1 min, Gefolgt von 72 ° C für 10 min.
- Wiederholen Sie diese Schritte, um das 1,303 bp doppelsträngige Fragment von LmigOR2 (GenBank: JQ766966) und 1,251 bp doppelsträngiges Fragment von LmigORco (GenBank: JN989549) zu produzieren. Die in diesen Experimenten verwendeten Primer sind in Tabelle 1 dargestellt .
- Führen Sie PCR-Produkte auf 1,2% Agarosegele in 1x Tris-Acetat-EDTA-Puffer und visualisieren Sie mit Ethidiumbromid-Färbung.
- Extrahieren Sie diese PCR-Produkte mit einem Gel-Extraktions-Kit.
- Nach der Elektrophorese verbannen Sie die DNA-Banden aus dem Gel und legen die Gelscheiben in ein 1,5-ml-Röhrchen. Dann werden 100 μl Bindungspuffer (Puffer PN) pro 0,1 g Gelscheibe zugegeben. Vortex und inkubieren bei 50 ° C, bis die Gelscheibe vollständig aufgelöst ist.
- Setzen Sie eine CA2-Adsorptionskolonne in das Sammelröhrchen ein und fügen Sie 500 μl Restpuffer (Puffer BL) hinzu. Dies verbessert die Absorptionsfähigkeit und Stabilität der Silicamembran. CentriFuge bei 12.400 xg für 1 min.
- Das gelierte Gelgemisch wird in die Adsorptionskolonnenanordnung überführt und bei Raumtemperatur für 2 min inkubiert. Dann werden die Zentrifugenröhrchen bei 12.400 xg für 1 min zentrifugiert. Verwerfen Sie den Durchfluss und setzen Sie die Adsorptionskolonne wieder in das Sammelrohr ein.
- Füge 600 μl Waschlösung (Ethanol zugesetzt, Puffer PW) zweimal hinzu. Zentrifuge bei 12.400 xg für 1 min. Verwerfen Sie den Durchfluss und setzen Sie die Adsorptionskolonne wieder in das Sammelrohr ein.
- Das Sammelröhrchen entleeren und die Säulenanordnung bei 12.400 xg für 2 min zentrifugieren, um ein Verdampfen von restlichem Ethanol zu ermöglichen.
- Die Adsorptionskolonne sorgfältig auf ein sauberes 1,5 mL Zentrifugenröhrchen überführen. Das Pellet für 5-10 min trocknen und die DNA in einem geeigneten Volumen ( z. B. 30 & mgr; l) nukleasefreies Wasser auflösen.
- Inkubieren bei RT für 2 min. Zentrifuge bei 12.400 xg für 2 min. Die Adsorptionskolonne entsorgen und die DNA bei 4 ° C oder -20 ° C aufbewahren.
- Zuerst ein 387 bp doppelsträngiges Fragment von L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) aus dem Plasmid, das die Volllängen -cDNA von LmigOR1 enthält, mit einer Taq- DNA-Polymerase, die Adenine zu beiden Enden der Fragmente hinzufügt, produzieren.
- Konstruieren Sie die rekombinanten Plasmide
- Individuell das 387 bp-Fragment von LmigOR1 , 1,303 bp Fragment von LmigOR2 und 1,251 bp Fragment von LmigORco in einen T-Vektor ligieren , der Promotoren für T7 (Upstream) und SP6 (stromabwärts) RNA-Polymerasen neben der insertierten DNA unter Verwendung von T4-DNA-Ligase enthält. Bereiten Sie die folgende 10 & mgr; l-Reaktion vor: 5 & mgr; l 2x Ligationspuffer, 1 & mgr; l T-Vektor, 3 & mgr; l (~ 100 ng) der DNA des insertierten Gens und 1 & mgr; l T4-DNA-Ligase und inkubieren O / N bei 4 ° C.
- Füge 5 μl jedes rekombinanten Plasmids hinzu, das das 387 bp-Fragment von LmigOR1 , 1,303 bp Fragment von LmigOR2 und 1,251 bp Fragment von LmigORco getrennt in 50 μl kompetente Escherichia coli DH5α Zellen in sterilen 1,5 mL Röhrchen enthält.
- Mischen Sie sanft und legen Sie die Röhrchen für 30 Minuten in Eis und dann inkubieren sie für 90 s bei 42° C Übertragen Sie sie für 3 min in Eis zurück.
- Füge 450 & mgr; l Luria-Bertani (LB) flüssiges Medium ohne Ampicillin zu jedem Röhrchen hinzu und inkubiere sie in einem Schüttler bei 150 U / min für 1 h bei 37 ° C, um das E. coli DH5 & agr; wiederherzustellen.
- Nehmen Sie ein 100 & mgr; l Aliquot jeder Transformante und verwenden Sie sie, um LB-feste Substratplatten, die 50 & mgr; g / ml Ampicillin, 24 & mgr; g / ml Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) und 40 & mgr; g / ml 5-Brom-4 enthalten, zu inokulieren -chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-gal).
- Diese Platten in einem konstanten Inkubator bei 37 ° C für 18 h inkubieren. Screening der Ziel-rekombinanten Plasmide unter Verwendung der blau-weißen Screening-Methode. Sequenzieren Sie die Ziel-rekombinanten Plasmide unter Verwendung von Sanger-Sequenzierung und identifizieren die Insertionsrichtungen der drei ODER-Gene.
- Wählen Sie Restriktionsendonukleasen, um rekombinante Plasmide zu linearisieren
- Verwenden Sie Restriktionsendonukleasen tHabe nicht nur in der multiplen Klonierungsstelle des Vektors verdauen, sondern auch die Insert-DNA nicht schneiden. In diesem Experiment werden alle 3 Gene in den T-Vektor in der Richtung eingefügt, die der des Vektors entspricht.
- Verwenden Sie die NcoI- Restriktionsendonuklease, um die rekombinanten Plasmide, die das 387 bp-Fragment von LmigOR1 , 1,303 bp-Fragment von LmigOR2 und 1,251 bp-Fragment von LmigORco enthalten, zu linearisieren , um die Antisense-Sonden zu erzeugen. Verwenden Sie Sp e I Restriktionsendonuklease, um die Sense-Sonden zu erzeugen.
HINWEIS: Wenn die Insertionsrichtung dem des Vektors entspricht, wird eine eindeutige Restriktionsstelle vom Ende von T7 ausgewählt, um das rekombinante Plasmid zu linearisieren, und die SP6-RNA-Polymerase wird zur Herstellung der Antisense-Sonde verwendet. Eine einzigartige Restriktionsstelle vom Ende von SP6 wird ausgewählt, um das rekombinante Plasmid zu linearisieren, und die T7-RNA-Polymerase wird verwendet, um die Sense-Sonde herzustellen. Ansonsten, wenn die Einsteckrichtung nicht mit t übereinstimmtDie Richtung des Vektors, dann wird eine einzigartige Restriktionsstelle vom Ende von SP6 ausgewählt, um das rekombinante Plasmid zu linearisieren, und die T7-RNA-Polymerase wird zur Herstellung der Antisense-Sonde verwendet. Die einzigartige Restriktionsstelle vom Ende von T7 wird ausgewählt, um das rekombinante Plasmid zu linearisieren, und die SP6-RNA-Polymerase wird verwendet, um die Sense-Sonde herzustellen.
- Reinigen der linearisierten rekombinanten Plasmide
- 20 μg jedes der drei rekombinanten Plasmide, die das 387 bp-Fragment von LmigOR1 , 1,303 bp-Fragment von LmigOR2 und 1,251 bp-Fragment von LmigORco enthalten, unter Verwendung der NcoI- Restriktionsendonuklease in einer 100 & mgr; l-Reaktion, die 10 & mgr; l 10 × Puffer, 40 & mgr; l enthält, 0,5 μg / μl Plasmid, 3 μl Nco I und 47 μl RNase-freies H 2 O, gefolgt von einer 3- stündigen Inkubation bei 37 ° C.
- In ähnlicher Weise werden 20 & mgr; g von jedem dieser drei rekombinanten Plasmide uSinge die Spe I-Restriktionsendonuklease.
- Diese verdauten Plasmide werden unter Verwendung eines Gel-Extraktionskits, wie in 1.1.2 beschrieben, gereinigt. Bestimmen Sie die Konzentrationen dieser extrahierten linearisierten rekombinanten Plasmide durch Spektrophotometrie und stellen Sie sie auf 0,5 μg / μL ein.
- Antisense und Sense Sonden vorbereiten
- Verwenden Sie das T7 / SP6-RNA-Transkriptionssystem, um Antisense- und Sense-Sonden zu erzeugen. SP6-RNA-Polymerase wird verwendet, um doppelsträngige RNA für DIG- und Biotin-markierte Antisense-Sonden für diese drei ODER-Gene unter Verwendung linearisierter rekombinanter Plasmide als Matrizen in vitro zu transkribieren. Die T7-RNA-Polymerase wird zur Herstellung von Messsonden verwendet. Die Reaktion in einem 20 & mgr; l Endvolumen, enthaltend 2 & mgr; l 10 × NTP-Mischung, 2 & mgr; l 10X Transkriptionspuffer, 1 & mgr; l RNase-Inhibitor, 2 & mgr; l T7 oder SP6-RNA-Polymerase, 4 & mgr; l 0,5 & mgr; g / & mgr; l linearisiertes Plasmid und 9 & mgr; l RNase-freies H 2 O, gefolgt vonDurch eine 3-stündige Inkubation bei 37 ° C.
- Inkubieren Sie die DIG- und Biotin-markierten Antisense- und Sense-Sonden für 30 min mit 1 μl DNase bei 37 ° C. Zugabe von 2,5 μl 5 M LiCl und 75 μl absolutem Ethanol, dann inkubieren die Reaktionen für 30 min bei -70 ° C.
- Zentrifugieren bei 15.000 xg für 30 min bei 4 ° C. Den Überstand sorgfältig dekantieren. Füge 150 μl 70% iges Ethanol hinzu, um das Fällungsmittel zu waschen. Das 70% ige Ethanol (1 l) wird durch Zugabe von 95% Ethanol (736,8 ml) zu sterilem destilliertem Wasser (263,2 ml) hergestellt.
- Bei 15.000 xg für 30 min bei 4 ° C erneut zentrifugieren und das Pellet für 5-10 min bei RT lufttrocknen. Füge 25 μl RNase-freies H 2 O hinzu, um die RNA-Antisense- und Sense-Sonden aufzulösen.
- Wenn die Länge des eingefügten Gens länger als 1 kb ist, dann Fragment RNA antisense und Sense-Sonden auf eine durchschnittliche Länge von ~ 300 bp durch Inkubation in einer Bicarbonat-Carbonat-Puffer-Lösungen. Die Reaktion in einem 50 μl Endvolumen durchführen, cWobei 25 & mgr; l der RNA-Sonde und 25 & mgr; l der Bicarbonat-Carbonat-Pufferlösung (80 mM NaHCO 3 , 120 mM Na 2 CO 3 , pH 10,2) bei 60 ° C erhalten wurden. Die erforderliche Hydrolysezeit wird durch eine zuvor veröffentlichte Formel 17 gegeben .
- Füge 5 μl 10% ige Essigsäure hinzu, um die Reaktion zu stoppen. In diesem Experiment, Fragment der LmigOR2 und LmigORco Antisense und Sense Sonden für 24 und 23 min, respectively.
T = (L o -L f ) / kXL o XL f
L o = die Anfangsfragmentlängen in kb
L f = die endgültigen Fragmentlängen in kb
K = die Geschwindigkeitskonstante für die Hydrolyse, etwa 0,11 kb -1 min -1
T = die Hydrolysezeit in min - Schließlich werden 250 μl Hybridisierungspuffer zugegeben und bei -80 ° C aufbewahrt.
2. Vorbereitung der Kryostatabschnitte
- Precool die FreeziNg Mikrotom auf -24 ° C.
- Wählen Sie neue, heutzutage erwachsene Heuschrecken, die aktiv sind und intakte Antennen haben. Schneiden Sie die Antennen in 2-3 mm Stücke mit sterilen Rasiermesser.
- Setzen Sie OCT-Verbindung auf einen gefrierenden Mikrotom-Halter und legen Sie ein oder zwei Proben auf die Verbindung horizontal. Dann den Halter in das Gefriermikrotom bei -24 ° C überführen, um zu äquilibrieren, bis die Verbindung gefriert. Nehmen Sie den Halter heraus und bedecken Sie die Proben mit einer kleinen Verbindung. Übertragen Sie den Halter in das Gefriermikrotom bei -24 ° C für mindestens 10 min ( Abbildung 1 ).
HINWEIS: Vermeiden Sie es, Blasen in der Verbindung zu bekommen. - Fixieren Sie den Halter mit den Proben in das Gefriermikrotom, und schneiden Sie dann die gefrorenen Proben in 12 μm dicke Scheiben bei -24 ° C.
- Tauen Sie die Scheiben eins nach dem anderen auf die Rutschen (25 x 75 mm, nukleasefrei) und die Luft trocknen für 10 min.
3. Befestigung Sektionen
- Nach der Vorbereitung Kryostat(~ 100 x 40 x 80 mm) und fixieren die Gewebe durch Inkubieren der Objektträger in 4% Paraformaldehydlösung (PFA) für 30 min bei 4 ° C.
- Waschen Sie die Objektträger in 1X Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 1 min.
- Um die alkalischen Proteine zu eliminieren, werden die Objektträger für 10 min auf 0,2 M HCl übertragen.
- Um das Oberflächenprotein von Nukleinsäure zu eliminieren, transferieren Sie die Objektträger auf 1XPBS mit 1% Triton X-100 für 2 min.
- Waschen Sie die Folien zweimal für 30 s in 1x PBS.
- Schließlich spülen Sie die Objektträger in Formamidlösung für 10 min bei 4 ° C ab.
4. Hybridisierung
- Bereiten Sie die Antisense- und Sense-Sonden vor
- Verwenden Sie Hybridisierungspuffer, um RNA-Antisense- oder Sense-Sonden in den 1,5 mL-Nuklease-freien Röhrchen zu verdünnen. In diesem Experiment fügen Sie für alle Antisense- und Sense-Sonden ( LmigOR1, LmigOR2 und LmigOrco ) 1 μl Sonde auf 99 μ hinzuL Hybridisierungspuffer pro Folie. Im Allgemeinen erzeugt die Verwendung von 1: 100 Verdünnungen von Antisense-Sonden signifikante positive Signale und niedrige Hintergründe unter Verwendung dieses Protokolls.
- Für den chromogenen Nachweis die DIG-markierten Sonden einzeln verdünnen.
- Für die TSA-Detektion verdünnen Sie DIG-markiertes LmigOR1 mit Biotin-markierten LmigOrco- Sonden oder DIG-markiertem LmigOR2 mit Biotin-markierten LmigOR1- Sonden zusammen im Hybridisierungspuffer.
- Die Verdünnungen 10 min bei 65 ° C erhitzen und mindestens 5 min auf Eis geben.
- Hybridisierung
- Die Folien abtropfen lassen und 100 μl verdünnte Antisense- und Sense-Sonden (Schritt 4.1) zu den Gewebeschnitten hinzufügen. Dann legen Sie Deckellippen (24 mm x 50 mm, nukleasefrei) auf die Gewebeabschnitte.
- Legen Sie die bedeckten Schieber horizontal in eine feuchte Schachtel (~ 300 x 180 x 50 mm 3 , Abbildung 2 ) und inkubieren Sie eineT 55 ° C für 22 h. Füge Formamidlösung oder 1X PBS zum Boden der Schachtel hinzu, um die Umgebung feucht zu halten, aber nicht die Schläuche in die Flüssigkeit eintauchen.
- Waschen und Sperren.
- Nach der Hybridisierung die Deckgläser sorgfältig entfernen. Die Folien zweimal für 30 min in 0,1 × Salzlösung Natriumcitrat (SSC) bei 60 ° C waschen.
HINWEIS: Waschen bedeutet, dass die Objektträger in einen Schiebehalter gelegt werden, der dann in einen Plastikbehälter gelegt wird und sanft auf einer Wippe aufgerührt wird (~ 50 U / min, Abbildung 2 ). - Spülen Sie die Folien in 1x Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) für 30 s.
- Füge 1 ml 1% Blockierungsreagenz in TBS hinzu, ergänzt mit 0,03% Triton X-100 auf jedem Objektträger und inkubieren für 30 min. Verwerfen Sie dann die Sperrlösung.
- Nach der Hybridisierung die Deckgläser sorgfältig entfernen. Die Folien zweimal für 30 min in 0,1 × Salzlösung Natriumcitrat (SSC) bei 60 ° C waschen.
- Immunhistochemie
- Für den chromogenen Nachweis verwenden Sie das Blockierungsreagens in TBS, um 750 Einheiten (U) / ml Anti-Digoxigenin-AP-konjugiertes Antibiotikum zu verdünnenDy bis 1,5 U / ml AP-Lösung. 100 μl AP-Lösung pro abgedeckter (24 mm x 50 mm) Folie zugeben.
- Für die TSA-Detektion verwenden Sie das Blockierungsreagens in TBS, um 750 U / ml Anti-Digoxigenin-AP-konjugierter Antikörper und Anti-Biotin-Streptavidin-HRP-konjugierter Antikörper gegen die AP / HRP-Lösung zu verdünnen. 100 μl AP / HRP-Lösung pro abgedeckter (24 mm x 50 mm) Folie zugeben.
- Inkubieren Sie die Objektträger in einem feuchten Kasten ( Abbildung 2 ) für 60 min bei 37 ° C. Verwenden Sie die Formamidlösung oder 1X PBS, um die Kiste feucht zu halten, aber nicht matschig.
5. Färbung
- Entfernen Sie die Deckgläser sorgfältig. Waschen Sie die Dias dreimal für 5 min in 1x TBS, ergänzt mit 0,05% Tween-20. Spülen Sie die Folien im DAP-Puffer (chromogener Nachweis: pH 9,5, TSA-Nachweis: pH 8,0) für 5 min.
- Färbung (chromogener Nachweis)
- 100 & mgr; l NBT (375 & mgr; g / ml) / BCIP (188 & mgr; g / ml) Substratlösung (verdünnt in DAP;PH 9,5) auf jede Folie. Setzen Sie die Deckgläser (24 x 50 mm) sorgfältig auf die Folien auf.
- Inkubieren Sie die Objektträger in einem feuchten Kasten mit Substratlösung für 10 min - O / N bei 37 ° C.
HINWEIS: Überprüfen Sie die Entwicklung, indem Sie die Folien von Zeit zu Zeit unter dem Mikroskop betrachten. - Wenn die Entwicklung fertig ist, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Objektträger in Wasser übertragen.
- Färbung (TSA-Erkennung)
- Verwenden Sie eine Spritze, um das HNPP (100 μg / ml) / Fast Red (250 μg / mL) Substrat aus dem Spritzenfilter (0,22 μm, Abbildung 2 ) zu bewegen.
- Fügen Sie 100 μl HNPP / Fast Red Substrat pro Folie mit einem Deckglas (24 x 50 mm). Inkubieren Sie die Objektträger für 30 min mit HNPP / Fast Red Substrat bei RT.
- Entfernen Sie die Deckgläser sorgfältig und waschen Sie die Folien dreimal für 5 min in 1X TBS, ergänzt mit 0,05% Tween-20.
- 100 μl TSA-Substrat / überzogen (24 x 50 mm 2 ) rutschen Inkubieren Sie die Objektträger mit TSA-Substrat für 10 min bei RT.
- Entfernen Sie die Deckgläser sorgfältig und waschen Sie die Folien dreimal für 5 min in 1x TBS, ergänzt mit 0,05% Tween-20.
- Die Folien in PBS / Glycerin (1: 3) einbetten.
HINWEIS: Nach Beendigung dieser Vorgänge sollten die Folien so schnell wie möglich beobachtet werden, da das Fluoreszenzsignal schnell abschreckt.
6. Beobachtung
- Chromogener Nachweis
- Gewebeabschnitte mit einem optischen Mikroskop beachten. Wählen Sie die 10X, 20X und 40X Objektiv, um die Ergebnisse der chromogenen Erkennung zu beobachten.
- Verwenden Sie DP-BSW Software, um die Ergebnisse zu analysieren und die Bilder zu erfassen.
- TSA-Erkennung
- Gewebeabschnitte mit einem konfokalen Mikroskop beobachten. DIG-markierte Gene sollten unter 543 nm Licht beobachtet werden, die eine rote Farbe aufweisen und Biotin-markierte Gene sein solltenBeobachtet unter 488 nm Licht, präsentiert eine grüne Farbe. Wenn sie auftauchen, präsentieren sie eine gelbe Farbe.
- Wählen Sie die 20X- und 40X-Objektivlinsen, um die Ergebnisse der TSA-Erkennung zu beobachten.
- Verwenden Sie FV1000 Software, um die Ergebnisse zu analysieren und die Bilder zu erfassen.
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Representative Results
Bei der chromogenen Detektion wurde eine kleine Teilmenge der Antennenzellen in jedem erwachsenen Antennenabschnitt mit den DIG-markierten LmigOR1- und LmigOR2- Antisense-Sonden bezeichnet ( Abbildung 3 ). RNA ISH auf aufeinanderfolgenden Abschnitten, um LmigOR1 und LmigOR2 zu lokalisieren, zeigten, dass Antennenzellen, die die beiden Gene exprimieren , in ORN-Clustern lokalisiert wurden, die LmigORco exprimierten , was darauf hinweist, dass die mutmaßlichen LmigOR1 und LmigOR2 tatsächlich in ORNs exprimiert wurden ( Abbildung 4a -4d ). Gelegentlich wurden markierte dendritisch-artige Strukturen visualisiert ( Abbildung 4e -4f ). LmigOR1 und LmigOR2 waren beide lokalisiert auf Neuronen in der basiconischen Sensilla ( Abbildung 5a-5b ), aber sie wurden nicht in der einzelnen sensilla co-exprimiert, was darauf hinweist, dass sie in verschiedenen basico vorhanden waren Nic-Sensillium-Subtypen ( Abbildung 5c-5 d ).
Bei der TSA-Detektion zeigte eine zweifarbige fluoreszierende in situ- Hybridisierung, dass LmigOR1- exprimierende Zellen (rote Farbe) zu ORN-Clustern wurden, die LmigORco (grüne Farbe) exprimierten, was anzeigt, dass das mutmaßliche LmigOR1 in ORNs exprimiert wurde ( Abbildung 6a ). Eine genaue Ansicht der verpackten Bereiche in Fig. 6a ist in Fig. 6b gezeigt . LmigOR1 - exprimierende Neuronen (grüne Farbe, Abbildung 7a ) und LmigOR2-exprimierendes Neuron (rote Farbe, Abbildung 7b ) wurden zu verschiedenen basiconischen Sensilliumsubtypen lokalisiert ( Abbildung 7c ).
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Abbildung 1: Vorbereitung von Insekten-Antennenabschnitten für die RNA- In-situ- Hybridisierung. ( A ) Das Gefriermikrotom; ( Bc ) Die Proben werden in Gefrier-OCT-Verbindung eingebettet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Experimentelle Items für RNA In Situ Hybridisierung . ( A ) Der Schiebehalter und der Kunststoffbehälter. ( B ) Die feuchte Schachtel. ( C ) Die Wippe. ( D ) Der Membranfilter ( E ) Konfokales Mikroskop .jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Zelluläre Lokalisierung von LmigOR1 & LmigOR2 in olfaktorischen Organen. ( A ) Überblick über LmigOR1- exprimierende Zellen in einem Heuschreckenantennensegment. ( B ) Überblick über LmigOR2- exprimierende Zellen in einem Heuschreckenantennensegment. Pfeilspitzen zeigen Zellen an, die LmigOR1 ( a ) und LmigOR2 ( b ) exprimieren . Maßstäbe = 100 μm (a und b). Die Figuren wurden von Xu et al. 12 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Neuronale Identität von Antennenzellen, die Lmigor durch Chromogene Detektionen ausdrücken. ( Ab ) Das Etikettierungsmuster von LmigOR1 ( a ) und LmigORco ( b ) Antisense-Sonde auf aufeinanderfolgenden Abschnitten der Heuschreckenantenne. ( Cd ) Das Markierungsmuster von LmigORco ( c ) und LmigOR2 ( d ) Antisense-Sonde auf aufeinanderfolgenden Abschnitten der Heuschreckenantenne. ( Ef ) Illustration der gelegentlich markierten dendritischen Strukturen (durch rote Pfeile angedeutet). Maßstäbe = 50 μm (ad); 20 μm (e und f). Die Figuren wurden von Xu et al. 12 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Nt "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Abbildung 5: LmigOR1 & LmigOR2 werden in ORNs, die in Basiconic Sensilla untergebracht sind, ausgedrückt. ( Ab ) Basiconic sensillum untergebracht ORNs, die LmigOR1 ( a ) und LmigOR2 ( b ) ausdrücken . ( Cd ) Die Expression von LmigOR1 und LmigOR2 in einer unterschiedlichen Teilmenge von Antennen-ORNs wurde auf aufeinanderfolgenden Abschnitten (cd) verifiziert. Pfeilspitzen bezeichnen Antennenzellen, die LmigOR1 (a, c) und LmigOR2 (b, d) exprimieren . Ba: basiconic sensillum Maßstäbe = 20 μm (a und b); 50 μm (c und d). Die Figuren wurden von Xu et al. 12 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Neuronale Identität der Antennenzelle, die LmigOR1 durch TSA-Nachweise ausdrückt . ( A ) Die Zweifarb- In-situ- Hybridisierung wurde im Längsantennenabschnitt durchgeführt , um die Expression von LmigOR1 (Rot) und LmigORco (Grün) zu veranschaulichen. Die Lokalisierung von LmigOR1- exprimierenden Zellen in Zellclustern , die Lmigorco exprimieren, bestätigte seine neuronale Identität. ( B ) Ansicht der Schachgebiete in a. Gelegentlich markierte dendritische ähnliche Strukturen wurden durch Pfeil angezeigt. Umlaufende Bereiche zeigen den ORNs-Cluster, der LmigORco ausdrückt und das gleiche Sensillum teilt. Maßstäbe = 50 μm (a); 20 μm (b). Die Figuren wurden von Xu et al. 12 Bitte CLecke hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7: LmigOR1 & LmigOR2 waren an verschiedenen Basiconic Sensilla ORNs von TSA Detection. Fluoreszenzsignale wurden unter Verwendung von Nachweissystemen sichtbar gemacht, was auf LmigOR1- markierte Neuronen durch grüne Fluoreszenz ( a ) und LmigOR2- positive Zellen durch rote Fluoreszenz ( b ) zeigte, wurden in verschiedenen basiconischen Sensilla-Subtypen ( c ) exprimiert. Pfeilspitzen bezeichnen Antennenzellen, die LmigOR1 und LmigOR2 exprimieren . Maßstäbe = 20 μm. Die Figuren wurden von Xu et al. 12 Bitte klicken Sie hier um eineGrößere Version dieser Figur.
| Name | Sequenzen |
| Lmig OR1-Sonde-s | 5'-AAGGGGTGGGAGACGGCCTG-3 ' |
| Lmig OR1-Sonde-wie | 5'-CAGCTCCTCCCCAACGACAGC-3 ' |
| Lmig OR2-Sonde-s | 5'-ATGGGTGAGCGTGGAGAGGC-3 ' |
| Lmig OR2-Sonde-wie | 5'-GGTCATCGCTGTGGACGTGG-3 ' |
| Lmig Orco-Sonde-s | 5'-CTCGTCTGACAGCGTAACTCAC-3 ' |
| Lmig Orco-Sonde-wie | 5'-AAGACGCAGAAGAGGAAGACCT-3 ' |
Tabelle 1: Die Sequenzen der PCR-Primer.
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Discussion
Es ist schwer, RNA ISH zu lokalisieren, um ODER-Gene in Insektenantennen zu lokalisieren, da die Expressionsniveaus von ODER-Genen, außer ORco , sehr niedrig sind und die Histologie von Insektenantennen bewahrt wird, ist sehr schwierig. Darüber hinaus ist TSA-Erkennung auch sehr schwierig. Um diese Probleme zu lösen, sollten folgende Maßnahmen ergriffen werden. Die Antennen werden aus neu gemahlenen erwachsenen Heuschrecken ausgewählt, die dünne und weiche, natürliche Nagelhaut haben, die ihre Morphologie auf der Folie aufrechterhalten. Die gefrorenen Proben werden in 12 μm dicke Scheiben geschnitten. Es werden hochempfindliche und spezifische Biotin- und DIG-markierte Sonden verwendet. Detergenzien wie Tween-20 und Triton X-100 werden verwendet, um den Hintergrund in vielen Schritten zu verringern. Bei der TSA-Detektion sollte ein hoch exprimiertes Gen, bezogen auf ein anderes, niedrig exprimiertes Gen, mit Biotin-16-UTP markiert werden. Die Folien sollten so schnell wie möglich beobachtet werden, da die fluoreszierenden Signale schnell abschrecken.
DIG- aNd Biotin-markierte Sonden haben die Vorteile längerer Haltbarkeitszeiten, höhere Signal-zu-Rausch-Verhältnisse und bessere zelluläre Auflösungen als radioaktive Sonden 18 , 19 . Das in diesem Papier vorgestellte Protokoll hat einige Vorteile gegenüber der gesamten In-situ- Hybridisierung. Dieses Protokoll identifiziert leicht die Lokalisierungen von Genen auf zellulärer Ebene, kann aber nicht leicht verwendet werden, um Genverteilungsmuster zu untersuchen, was leichter mit einer vollständigen In-situ- Hybridisierung durchgeführt wird.
Um ein OR-Gen zu identifizieren, wurden zwei Ansätze genommen. Einer war der chromogene Nachweis in aufeinanderfolgenden Abschnitten, und der andere war eine Fluoreszenzdetektion in einem Abschnitt. ORco wird mit einem spezifischen ODER als ORN-Marker 10 , 20 , 21 ausgedrückt. Zellen, die LmigOR1 oder LmigOR2 ausdrücken, waren beide lokalisiertZu Clustern von LmigORco- exprimierenden Zellen, die sie als ORs eindeutig verifiziert haben ( Abbildung 4 und Abbildung 6 ). Mit den gleichen Ansätzen fanden wir, dass LmigOR1 und LmigOR2 nicht in einem Sensillum co-exprimiert werden. Die Ergebnisse dieser beiden Ansätze sind korrosiv.
Dieses Protokoll wurde auch erfolgreich verwendet, um LmigORco, SgreORco, SgreIR8a und SgreIR25a in den Heuschreckenantennen 10 , 14 zu lokalisieren. Vor kurzem wurde LmigOR3 auf Trichoid-Sensilla-Neuronen in L. migratoria unter Verwendung des gleichen Protokolls 15 lokalisiert. Dieses Protokoll wurde verwendet, um zwei sensorische neuronale Membranproteine zu lokalisieren SgreSNMP1 und SgreSNMP2 in den Antennen von S. gregaria 16 . So lokalisierte dieses Protokoll zuverlässig chemosensorische Gene in Heuschreckenantennen, die diese nicht nur verifiziert habenKandidaten-Gene, sondern auch lokalisiert diese Gene auf bestimmte Zellen in verschiedenen Arten von Sensilla untergebracht.
Abschließend wird dieses hochwirksame Protokoll von RNA ISH spezifisch beschrieben, um ODER-Gene zu lokalisieren, sowie andere Gene, die auf niedrigem Niveau exprimiert werden, in Insektenantennen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren oder andere Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird durch einen Stipendium der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung von China (Nr.31472037) unterstützt. Die Erwähnung von Handelsnamen oder kommerziellen Produkten in diesem Artikel dient ausschließlich der Bereitstellung spezifischer Informationen und bedeutet keine Empfehlung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 2×TSINGKETM Master Mix | TSINGKE, China | TSE004 | |
| RNase-free H2O | TIANGEN, China | RT121-02 | |
| REGULAR AGAROSE G-10 | BIOWEST, SPAIN | 91622 | |
| Binding buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Balance buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Wash solution | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| T Vector | Promega, USA | A362A | |
| T4 DNA Ligase | Promega, USA | M180A | |
| Escherichia coli DH5α | TIANGEN, China | CB101 | |
| Ampicillin | Sigma, USA | A-6140 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Inalco, USA | 1758-1400 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | SBS Genetech, China | GX1-500 | |
| Nco I | BioLabs, New England | R0193S | |
| Spe I | BioLabs, New England | R0133M | |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| Biotin RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11685597910 | |
| DNase | DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| LiCl | Sinopharm, China | 10012718 | |
| Ethanol | Sinopharm, China | 10009257 | |
| Acetic acid | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands | 4583 | |
| Slides | TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China | FISH0010 | |
| HCl | Sinopharm, China | 80070591 | |
| Millex | Millipore, USA | SLGP033RS | |
| Tween 20 | AMRESCO, USA | 0777-500ML | |
| Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt | Roche, Switzerland | 11175041910 | |
| Glycerol | Sinopharm, China | 10010618 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | V900483-1KG | 0.04 mol/L Tris-Base |
| 1×Tris-acetate-EDTA | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | 0.12% acetic acid |
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | 03677 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | Sinopharm, China | 10019392 | 10 g/L NaCl |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM335231 | 10 g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM361526 | 5 g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | Sinopharm, China | 10019392 | 10 g/L NaCl |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM335231 | 10 g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM361526 | 5 g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | WISENT ING, Canada | 800-010-CG | 15 g/L Agar Bacteriological Grade |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sinopharm, China | 10019392 | 8.5% NaCl |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sigma, USA | V900041-500G | 14 mM KH2PO4 |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sigma, USA | V900268-500G | 80 mM Na2HPO4 |
| 10×Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5) | Sigma, USA | V900483-1KG | 1 M Tris-Base |
| 10×Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5) | Sinopharm, China | 10019392 | 1.5 M NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sigma, USA | V900483-1KG | 100 mM Tris-Base |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sinopharm, China | 10019392 | 100 mM NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sigma, USA | V900020-500G | 50 mM MgCl2·6H2O |
| 20×saline-sodium citrate (pH 7.0) | Sinopharm, China | 10019392 | 3 M NaCl |
| 20×saline-sodium citrate (pH 7.0) | Sigma, USA | V900095-500G | 0.3 M Na-Citrate |
| 4% paraformaldehyde solution (PFA, pH 9.5) | Sigma, USA | V900894-100G | 4% paraformaldehyde |
| Sodium Carbonate Buffer | Sigma, USA | V900182-500G | 0.1 M NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2) | Sigma, USA | V900182-500G | 80 mM NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2) | Sigma, USA | S7795-500G | 120 mM Na2CO3 |
| Formamide Solution (pH 10.2) | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Formamide Solution (pH 10.2) | 5×saline-sodium citrate | ||
| Blocking Buffer in TBS | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1% Blot |
| Blocking Buffer in TBS | AMRESCO, USA | 0694-500ML | 0.03% Triton X-100 |
| Blocking Buffer in TBS | 1×Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase solution | Blocking Buffer in TBS | ||
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Blocking Buffer in TBS | ||
| Hybridization Buffer | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Hybridization Buffer | 2×saline-sodium citrate | ||
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D8906-50G | 10% dextran sulphate |
| Hybridization Buffer | invitrogen, USA | AM7119 | 20 µg/mL yeast t-RNA |
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D3159-10G | 0.2 mg/mL herring sperm DNA |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10 mg/mL) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25 mg/mL) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Detection Buffer | ||
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 2% fluorescein-tyramides |
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | Amplification Diluent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | |||
| Freezing microtome | Leica, Nussloch, Germany | Jung CM300 cryostat | |
| Spectrophotometer | Thermo SCIENTIFIC, USA | NANODROP 2000 | |
| Optical microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus IX71microscope | |
| Confocal microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus BX45 confocal microscope |
References
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