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Neuroscience

प्रायोगिक मॉडल सेरेब्रल इस्केमिया के खिलाफ एसिडिक पोस्टकंडिशनिंग के न्यूरोप्रॉक्टेशन का अध्ययन करने के लिए

Published: July 31, 2017 doi: 10.3791/55931
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Pharmacology & Toxicology, College of Pharmaceutical Sciences, Department of Pharmacology, Key Laboratory of Medical Neurobiology of The Ministry of Health of China, Zhejiang Province Key Laboratory of Neurobiology, Zhejiang University
* These authors contributed equally

Summary

एसिडिक पोस्टकंडिशनिंग सेरेब्रल इस्किमिया से बचाता है। यहां हम एपीसी निष्पादित करने के लिए दो मॉडल पेश करते हैं। वे इन विट्रो में ऑक्सीजन ग्लूकोज अभाव के बाद अम्लीय बफर करने के लिए corticostriatal स्लाइस स्थानांतरित करके और विवो में मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा के बाद 20% सीओ 2 साँस द्वारा क्रमशः हासिल कर रहे हैं।

Abstract

सीमित चिकित्सीय दृष्टिकोण के साथ स्ट्रोक दुनिया भर में मृत्यु दर और विकलांगता के प्रमुख कारणों में से एक है। न्यूरोप्रॉ्रैक्टेशन के लिए एक अंतर्जात रणनीति के रूप में, पोस्ट-कैनेडिशनिंग उपचार ने मस्तिष्क संबंधी आइकेमिया के खिलाफ होनहार चिकित्सक साबित किया है। हालांकि, जटिल प्रक्रियाएं और संभावित सुरक्षा संबंधी मुद्दों से उनके नैदानिक ​​आवेदन को सीमित किया जाता है। इन नुकसानों से उबरने के लिए, हमने अम्लीय पोस्टकंडिशनिंग (एपीसी) को प्रयोगात्मक फोकल सेरेब्रल इस्केमिया के लिए एक चिकित्सा के रूप में विकसित किया है। एपीसी इस्किमिया के निम्नलिखित रीपरफ्यूज़ेशन के दौरान सीओ 2 में श्वास लेने से हल्के अम्लरोग उपचार का उल्लेख करता है। यहां हम क्रमशः इन विट्रो और विवो में एपीसी निष्पादित करने के लिए दो मॉडल पेश करते हैं। चूहों के ऑक्सीजन-ग्लूकोस अभाव (ओजीडी) के उपचार और कॉर्टिकोस्ट्रियल अवरोधन और मस्तिष्क संबंधी मध्यवर्गीय धमनी (एमसीएओ) चूहों की मस्तिष्क संबंधी आइसकेमिया की नकल करने के लिए कार्यरत थे। एपीसी को मस्तिष्क के स्लाइस को अम्लीय बफर को 20% सीओ 2 , ओ के साथ बुदबुदाह में स्थानांतरित करके आसानी से प्राप्त किया जा सकता हैचूहों द्वारा 20% सीओ 2 inhaling द्वारा एपीसी ने सेरेब्रल इस्किमिया के खिलाफ महत्वपूर्ण सुरक्षात्मक प्रभाव दिखाए, जैसा कि ऊतक व्यवहार्यता और मस्तिष्क अवरक्त मात्रा द्वारा दर्शाया गया है।

Introduction

स्ट्रोक दुनिया भर में मृत्यु दर और विकलांगता के प्रमुख कारणों में से एक है। पिछले दशकों में स्ट्रोक के लिए प्रभावी उपचार खोजने के लिए महान प्रयास किए गए हैं, हालांकि, उपलब्धि बहुत असंतोषजनक है। पोस्टकंडिशनिंग एक इस्किमिक एपिसोड के बाद उपोक्तक तनाव से छेड़छाड़ की जाने वाली एक प्रक्रिया है। इस्कीमिक, हाइपोक्सिक, लो ग्लूकोज और रिमोट इस्केमिक पोस्टकंडिशनिंग सहित, पोस्टकंडिशनिंग, अंतर्जात अनुकूली तंत्रों को ट्रिगर करती है, और सेरेब्रल ischemia 1 , 2 , 3 , 4 के खिलाफ होनहार चिकित्सा साबित हो रही है। हालांकि, इस्कीमिक पोस्टकंडिशनिंग अतिरिक्त चोट लग सकती है। अंग के रिमोट इस्कीमिक पोस्टकंडिशनिंग को आम तौर पर ipsilateral या द्विपक्षीय हिंद अंग 5 , 6 , 7 पर 5 से 20 मिनट की रोशनी और पुनर्चक्रण के कई चक्रों की आवश्यकता होती है। गुइसलिए, ये पोस्टकंडिशनिंग हेरफेर खतरनाक या नैदानिक ​​अभ्यास में अव्यावहारिक हैं। इन नुकसानों से उबरने के लिए, हमने चूहों 8 में फोकल सेरेब्रल आईस्केमिया के लिए एक चिकित्सा के रूप में एपीसी विकसित किया है। 20% सीओ 2 में प्रवेश करके बस प्रेरित, एपीसी महत्वपूर्ण रूप से महत्वपूर्ण और सुरक्षित तरीके से ischemic मस्तिष्क की चोट कम कर देता है। हाल ही में हमने यह साबित कर दिया है कि एपीसी रीपरफ्यूजन विंडो विस्तारित करती है, स्ट्रोक थेरेपी 9 के लिए एपीसी के महत्व को उजागर करती है।

यहां हम सेरेब्रल इस्केमिया के खिलाफ एपीसी के न्यूरोप्रसंक्षा का अध्ययन करने के लिए दो प्रयोगात्मक मॉडल पेश करते हैं। सबसे पहले चूहों कोर्टेकोस्ट्रियल स्लाइस में ऑक्सीजन ग्लूकोज वंचित (ओजीडी) मॉडल है। मस्तिष्क स्लाइस के एक कृत्रिम वातावरण में तेजी से तैयारी और स्थानांतरण, आमतौर पर कृत्रिम मस्तिष्कमेरु तरल पदार्थ (एएससीएफ), सेल व्यवहार्यता और न्यूरोनल सर्किटरी बनाए रख सकते हैं, जिससे यह इन विट्रो 10 में मस्तिष्क समारोह का अध्ययन करना संभव हो सकता है <Sup>, 11 एएससीएफ में ओजीडी सेरेब्रल इस्केमिया को मिमिक्स करता है और इस्किमिक इजाक 12 , 13 , 14 को प्रेरित करता है। ओजीडी के बाद, रीपरफ्यूजन प्रदान करने के लिए मस्तिष्क के स्लाइस को नियमित एएससीएफ (आर-एएससीएफ) में ताज़ा किया जाता है और उसके बाद एपीसी के साथ इलाज किया जाता है जो एसिडिक एएससीएफ का उपयोग 20% सीओ 2 के साथ होता है । कॉर्टिकोस्ट्रिएटल स्लाइस प्राथमिक सभ्य कोशिकाओं के मुकाबले अक्षुण्ण histological लक्षण वर्णन करता है।

विवो में मस्तिष्क समारोह का अध्ययन करने के लिए, माउस के मध्य सेरेब्रल धमनी रोपण (एमसीएओ) मॉडल को नियोजित किया जाता है। सामान्य मस्तिष्क धमनी के माध्यम से एक ज्वाला-मोनोफिलामेंट डालने से मध्य सेरेब्रल धमनी को अवरुद्ध किया जाता है। सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किए जाने वाले स्ट्रोक मॉडल में से एक के रूप में, एमसीएओ मॉडल नैदानिक ​​प्रासंगिकता दिखाता है और एक मोनोफिलामेंट के आवेदन से रिपरफ्यूजन प्राप्त करना आसान होता है। रीपरफ्यूज़ो की शुरुआत के बाद 20% सीओ 2 युक्त नॉर्मोक्सिक मिश्रित गैस को सांस लेने सेए, एपीसी ने मस्तिष्क संबंधी अवरक्त मात्रा से संकेतित सेरेब्रल ischemia के खिलाफ महत्वपूर्ण सुरक्षात्मक प्रभाव दिखाया।

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Protocol

झेजियांग विश्वविद्यालय पशु प्रयोग समिति के सभी नैदानिक ​​दिशानिर्देशों के अनुसार सभी प्रयोगों को मंजूरी दी गई और इन्हें आयोजित किया गया और वे नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हैल्थ गाइड फॉर केयर एंड लैबोरेटरी प्राइजल्स के उपयोग के साथ पूर्ण अनुपालन में थे। किसी भी दर्द या बेचैनी को कम करने के लिए प्रयास किए गए थे, और जानवरों की न्यूनतम संख्या का इस्तेमाल किया गया था।

1. कॉर्टिकोस्ट्रियल स्लाइस के ओजीडी

  1. समाधान तैयार करना:
    1. 1000 एमएल आर-एसीएसएफ (124 एमएमओएल / एल, एनओसीएल, 5 एमएमओएल / एल केसीएल, 1.25 एमएमओएल / एल केएच 2 पीओ 4 , 2 एमएमओएल / एल एमजीएसओ 4 , 26 एमएमओएल / एल एनएचओओ 3 , 2 एमएमओएल / एल कैक्ल 2 , 10 मिमीोल / एल ग्लूकोस, अंतिम पीएच 7.4)। प्रयोग में 5% सीओ 2 और 95% ओ 2 वाला बबल।
    2. ऊपर के रूप में 200 एमएल ग्लूकोज से मुक्त ACSF (जीएफ-एसीएसएफ) तैयार करें, लेकिन ग्लूकोज को छोड़कर 5% सीओ 2 और 95% एन 2 के साथ बुलबुले करें। बीआर को लागू करने से पहले 30 मिनट के लिए गैसों को बबल करेंहल में ऑक्सीजन सामग्री को कम करने के लिए ऐन स्लाइस। ओजीडी प्रक्रिया समाप्त होने तक बुलबुले जारी रखें।
    3. 200 एमएल आर-एसीएसएफ को 20% सीओ 2 और 80% ओ 2 के साथ संतुलित करके अम्लीय एसीएसएफ (ए-एसीएसएफ) तैयार करें। पीएच 6.8 के समाधान के पीएच को कम करने के लिए मस्तिष्क स्लाइस के लिए आवेदन करने से पहले 30 मिनट के लिए गैसों को बबल करें और एपीसी प्रक्रिया समाप्त होने तक बुदबुदाती रहें।
    4. तीन ऊतक धारकों को क्रमशः आर-एसीएसएफ, जीएफ-एसीएसएफ, एएसीएसएफ में रखें।
  2. मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी:
    नोट: इस अध्ययन में 8-हफ्ते का पुराना, पुरुष सी 57 बीएल / 6 जे चूहों का इस्तेमाल किया गया था। जानवरों को नियंत्रित तापमान (22 ± 2 डिग्री सेल्सियस) के तहत रखा गया था, जिसमें 12 घंटे की हल्की-अंधेरे चक्र अवधि और पिलेटेड भोजन और पानी तक पहुंच होती थी।
    1. एक प्रेरण कक्ष में isoflurane अधिक मात्रा के साथ एक माउस बलिदान। माउस काढ़ा छोटे कैंची और संदंश का प्रयोग करके मस्तिष्क को बाहर निकालना। एक पतले आकार के साथ मस्तिष्क निकालें और यह एक गिलास बीकर चोंच में ध्यान से छोड़ देंबर्फ-ठंडा आर-एसीएसएफ को 5% सीओ 2 और 95% ओ 2 के साथ समतल किया जा रहा है
      नोट: इन चरणों को जितनी जल्दी हो सके लेकिन सावधानी से किया जाना चाहिए।
    2. मस्तिष्क को बर्फ के ठंडे आर-एसीएसएफ में 5 मिनट तक रखें। मस्तिष्क के आंदोलनों से बचने के लिए गैस के दबाव को समायोजित करें।
    3. दो स्ट्रिप्स में vibratome प्लेट पर आयनों को क्रियोप्सीसिस्ट करें। मस्तिष्क का समर्थन करने के लिए ब्लेड से दूर गोंद पट्टी पर 3% agarose का एक टुकड़ा रखो।
    4. बर्फ पर 10 सेमी पेट्री डिश करें और फिर डिश पर एक फिल्टर पेपर डालें। बर्फ-ठंडा आर-एसीएसएफ की बूंदों के साथ फिल्टर पेपर को मिलाएं।
    5. संदंश के साथ फिल्टर पेपर में मस्तिष्क को स्थानांतरित करें। ललाट का ध्रुव और ब्लेड और संदंश के साथ सेरिबैल काट दें।
      नोट: अनुप्रस्थ वर्गों को संभव के रूप में चिकनी होना चाहिए और बाण के समान विमान में होना चाहिए।
    6. शेष मस्तिष्क के ऊतकों को गड़बड़ी की दूसरी पट्टी पर खड़ी रखें और एगरोस के खिलाफ झुकाव रखें। बर्फ-ठंडा आर-एसीएसएफ को काटने के जलाशय में जोड़ेंमस्तिष्क को डुबोकर और बर्फ धारक क्षेत्र में बर्फ जोड़ें। जलाशय में आर-एसीएसएफ को 5% सीओ 2 और 95% ओ 2 के साथ रखें ।
    7. जलाशय उठाएं और रेजर की स्थिति को समायोजित करने के लिए रेजर को मस्तिष्क के करीब के रूप में संभव है और मस्तिष्क के ऊपर।
    8. मस्तिष्क वर्गों को लगातार टुकड़े करने के लिए "CONT" मोड चुनें 400 माइक्रोन तक कटाई की मोटाई सेट करें, आवृत्ति को 6 से 8, और 3 से 4 की गति के लिए दबाएं। 4. स्वत: काटना शुरू करने के लिए "प्रारंभ / स्टॉप" बटन दबाएं।
    9. एक 3 एमएल पाश्चर पिपेट की टिप को बंद करके मस्तिष्क के स्लाइस के आकार से मेल खाता खोलें।
      नोट: मस्तिष्क स्लाइस के अतिरिक्त नुकसान से बचने के लिए उद्घाटन काफी बड़ा होना चाहिए।
    10. पांच मस्तिष्क स्लाइसें टिप-कट पीटुर पिपेट के साथ एक-एक करके बाहर निकालें और उन्हें बर्फ के ठंडा आर-एसीएसएफ में 5% सीओ 2 और 95% ओ 2 के साथ ऊतक धारक में रखें। उत्पादित पहले टुकड़ा इकट्ठा न करें। Avoi के लिए गैस का दबाव समायोजित करेंमस्तिष्क स्लाइस के घ आंदोलन
      नोट: मस्तिष्क स्लाइस एक दूसरे को कवर नहीं करना चाहिए।
    11. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर आर-एसीएसएफ के साथ मस्तिष्क के स्लाइस रखें और फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में एक और 10 मिनट के लिए अन्तर्ग्रथनी कार्यों को पुनर्प्राप्त करें।
  3. ओजीडी और एपीसी:
    1. प्लेस जीएफ-एसीएसएफ और ए-एसीएसएफ को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के नहाने में रखें और 1.1.2 और 1.1.3 में 30 मिनट के लिए ऊपर उल्लेखित इसी गैसों के साथ बफर बुलबुले करें।
    2. नियंत्रण के रूप में आर-एसीएसएफ में एक टुकड़ा छोड़ दें दूसरे चार मस्तिष्क स्लाइस को पहले से जीईएफ-एसीएसएफ के साथ ऊतक धारक में ध्यानपूर्वक रखें और 15 मिनट के लिए लें। रीपरफ्यूजन प्राप्त करने के लिए स्लाइस को आर-एसीएसएफ में ऊतक धारक में वापस स्थानांतरित करें
    3. एपीसी की समय खिड़की का अध्ययन करने के लिए, एक टुकड़ा सीधे जीएफ-एसीएसएफ से एसीएसएफ तक स्थानांतरित करें। दूसरे तीन स्लाइस को आर-एसीएसएफ पर पहले स्थानांतरित करें, और उसके बाद दो-एक एसीएसएफ 5 और 15 मिनट में ऊतक धारक को क्रमशः दोबारा रिपरफेक्शन के बाद स्थानांतरित करें।
    4. Incubatए-एसीएसएफ में 3 मिनट के लिए दो स्लाइस और फिर उन्हें आर-एसीएसएफ में वापस स्थानांतरित करें। आर-एसीएसएफ में एक और 1 घंटे के लिए तीन स्लाइस को सेते हैं। ओजीडी समूह के रूप में आर-एसीएसएफ में शेष स्लाइस सेट करें।
    5. एक खुराक प्रतिक्रिया अध्ययन के लिए, ओजीडी के बाद पहली बार आर-एसीएसएफ में ऊतक धारक को सभी चार स्लाइस स्थानांतरण और 5 मिनट के लिए सेते हैं। फिर ओजीडी समूह के रूप में आर-एसीएसएफ में एक टुकड़ा छोड़ दें और अन्य तीन स्लाइस को एसीएसएफ में स्थानांतरित करें। क्रमशः 1, 3 और 5 मिनट के लिए एसीएसएफ में स्लाइस को सेते हैं और फिर उन्हें आर-एसीएसएफ में वापस स्थानांतरित करें। आर-एसीएसएफ में एक और 1 घंटे के लिए तीन स्लाइस को सेते हैं।
  4. स्लाइस व्यवहार्यता निर्धारण:
    1. 0.25% 2,3,5-ट्रिपिनेलेटेट्रज़ोलियम हाइड्रोक्लोराइड (टीटीसी) सामान्य खारा समाधान तैयार करें। 1.25 ग्रा। टीटीसी पाउडर को 500 मिलीलीटर सामान्य खारा समाधान में जोड़ें।
      नोट: पाउडर पूरी तरह से घुलने के बाद, समाधान को 24-अच्छी तरह से प्लेट (500 प्रति μL प्रति अच्छी तरह से) में पन्नी में रखकर 4 डिग्री सेल्सियस पर रख दें। टीटीसी और टीटीसी के साथ दाग वाले ऊतक हल्के सेन हैंsitive।
    2. स्लाइस को 24-अच्छी तरह से प्लेट (एक टुकड़ा प्रति अच्छी तरह) में ट्रांसफ़र करें जिसमें टीटीसी समाधान होता है और समाधान में स्लाइस को फैलाना। टीटीसी समाधान में स्लाइस को 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए उथले पानी के स्नान में सेते हैं।
    3. स्लाइस में सूखे 1.5 एमएल की अपकेंद्रित्र ट्यूबों को पन्नी में कवर करें और स्लाइस के सूखे वजन को मापें।
    4. फैटजान को निकालने के लिए एथानोल / डाइमिथाइल सल्फोक्सिड (1: 1) को अपकेंद्रित्र ट्यूबों में जोड़ें (v: w = 10: 1) 24 घंटे के लिए हल्के से कमरे के तापमान पर इथेनॉल / डाइमिथाइल सल्फाक्सिड में स्लाइस को सेते हैं।
    5. ट्यूबों में सभी इथेनॉल / डाइमिथाइल सल्फॉक्सिड को 96-अच्छी तरह से प्लेट में जोड़ें और एक प्लेट रीडर द्वारा 490 एनएम पर अवशोषण को मापें।
    6. कंटेंट स्लाइस के प्रतिशत के रूप में स्लाइस के सूखे वजन और व्यक्त व्यवहार्यता को अवशोषण को सामान्य बनाएं।

2. एमसीएओ

  1. तैयारी:
    1. लेजर डॉपलर फ्लोमेटर की कार्यक्षेत्र की सतह को हटा देंवाई (एलडीएफ) उपकरण और 70% एथिल अल्कोहल वाले सामान।
    2. आटोक्लेवड यंत्र तैयार करें: दो कैंची, 10 सेमी; दो संदंश, 10 सेमी; एक नेत्र संदंश, 11 सेमी; एक सूक्ष्म नेत्र कैंची, 9 सेमी; एक माइक्रोवस्सेल क्लैंप, 1.8 सेमी; ओनिडेडल ड्राइव, आर 12.5 सेमी; कई सर्जिकल सिग्नेचर (△ 1/2 4 × 10); सूती फाहा।
    3. हाइड्रेटेड ऑपरेशन क्षेत्र को बनाए रखने के लिए खारा समाधान के साथ एक सिरिंज (सुई के बिना) तैयार करें।
    4. संज्ञाहरण गैस (100% हे 2 + आईसोफ्लुरेन) तैयार करें
  2. मस्तिष्क के रक्त प्रवाह की जांच:
    1. एलडीएफ उपकरण सेट करें
    2. दर्दनाशक दवाओं को इंट्राटेरिटीन से माउस में इंजेक्ट करें: मेटैमिसोल 200 मिलीग्राम / किग्रा, कारप्रोफेन 4 मिलीग्राम / किग्रा और बुपरोनोफिन 0.1 मिलीग्राम / किग्रा
    3. ऑक्सीजन में 4% आईसोफ्ल्यरेन के साथ एक प्रेरण कक्ष में माउस को रखें ताकि शरीर का सहज गति और स्पंदना बंद हो जाए।
    4. अपने नाक के साथ प्रवण स्थिति में माउस को वें में लगाएंई नाक शंकु और बाद की प्रक्रिया के लिए 1.5% पर isoflurane को बनाए रखता है।
    5. दोनों आँखों पर डेक्सपेंथेनोल नेत्र मरहम लागू करें।
    6. 70% एथिल अल्कोहल के साथ सिर कीटाणुरहित।
    7. ब्रेग्मा का पर्दाफाश करने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करके आंखों और कानों के बीच सही पैरामेडियन त्वचा चीरा करें।
    8. बाँझ कपास के साथ खोपड़ी रगड़ें
    9. खोपड़ी की सतह पर सर्दी गोंद के एक से दो बूंदों को लागू करें।
    10. फाइब्रिक ऑप्टिक जांच की टिप को 5 मिमी कादोन और गर्दन के लिए 6 मिमी पार्श्व मध्य रेखा तक रखें।
    11. कंप्यूटर सॉफ्टवेयर पर रक्त के प्रवाह को रिकॉर्ड करना शुरू करें एक स्थिर रक्त प्रवाह आधारभूत तब तक प्रतीक्षा करें और फिर जांच को ठीक करने के लिए गोंद पर 20 μL उत्प्रेरक लागू करें।
      नोट: एक आदर्श आधारभूत 500 फ्लक्स से अधिक होना चाहिए।
    12. यदि आधार रेखा 200 से कम प्रवाह है, तो उपयुक्त आधार रेखा प्राप्त करने के लिए स्थिति को समायोजित करें। प्रयोग की अवधि के लिए खोपड़ी से जुड़ी जांच रखें।
    13. आईोडोफोर एपी के साथ सिर कीटाणुरहितटेर फाइबर ऑप्टिक जांच संलग्न
  3. MCAO:
    1. लापरवाह स्थिति में एनेस्थेटिज्ड माउस (एलडीएफ जांच के साथ इसकी खोपड़ी से जुड़ा हुआ) को ठीक करें और उसे सर्जरी के दौरान गर्मी दीपक का उपयोग करके अपने शरीर का तापमान बनाए रखें। 70% एथिल अल्कोहल के साथ गर्दन कीटाणुरहित।
    2. एक स्केलपेल का उपयोग कर गर्दन में एक पैरामेडियन त्वचा चीरा करें; बंटो जहाजों को बेनकाब करने के लिए संदंश के साथ नरम ऊतकों काटना। ऊतकों को खारिज करने के लिए उन्हें खारा होने के लिए एक खंभे जोड़ें।
    3. आंशिक संदंश का उपयोग करते हुए आसपास के ऊतकों और योनस तंत्रिका से आम मन्या धमनी काटना। योनस तंत्रिका को नुकसान पहुंचाने के लिए सावधान रहें आम कैरोटिड धमनी के सामने आईओडॉफ़र के साथ फिर से गर्दन की त्वचा कीटाणुरहित।
    4. आम कैरोटिड धमनी के बाहर के अंत में एक माइक्रोवस्सेल क्लैंप रखें और फिर समीपवर्ती अंत में 6-0 रेशम सिलाई के साथ एक मृत गाँठ को बांधें। बाद के परिचालनों के लिए क्लैंप को यथासंभव समीपस्थ रखें सुनिश्चित करें कि की लंबाईदबाना और मृत गाँठ के बीच के पोत के बाद के कार्यों के लिए संभव के रूप में लंबे समय तक है
    5. एक ढीली गाँठ बांधकर क्लैंप को एक अस्थायी सीवन बनाओ। सुनिश्चित करें कि मोनोफ़िलामेंट प्रविष्टि के लिए दो समुद्री मील के बीच पर्याप्त जगह है।
    6. सूक्ष्म नेत्र कैंची के साथ दो समुद्री मीलों के बीच एक छोटा सा एक छोटा सा चीरा बनाएं। सुनिश्चित करें कि चीरा बाद के कार्यों के लिए संभव के रूप में मृत गाँठ के करीब है। जहाज को काटने के लिए सावधान रहें
    7. धमनी ल्यूमन में प्रवेश करने के लिए 12 मिमी की टिप-ब्लूंडेड मोनोफिल्लामेंटथ्रस डालें और इसे कुछ मिमी में अग्रेषित करें। Monofilament की नोक के आसपास ढीली गाँठ को कस लें और फिर क्लैंप को हटा दें।
    8. एलडीएफ सॉफ्टवेयर में रक्त प्रवाह में तीव्र गिरावट (> आधारभूत रक्त प्रवाह से 80% की कमी) जब तक आंतरिक नेत्रगोलक धमनी में फिनामेंट को आंखों के संदंश के साथ (मध्य सेरेब्रल धमनी को रोकने के लिए 10 मिमी) अग्रिम करें। अवरोधन के प्रारंभ समय को रिकॉर्ड करें
      नोट: एलडीएफ उपकरण सेटअप हैअनुभाग 2.2 में वर्णित है।
    9. 1 घंटे के लिए मध्य मस्तिष्क धमनी को दबाएं एलडीएफ जांच को काट लें और चूहों को अवरोध की अवधि के लिए 30 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में डाल दें।
  4. रेपरफ्यूज़न और एपीसी:
    1. आइसफ्लुरेन के साथ पशुओं को फिर से अनैतिकता के रूप में अवरोध के प्रारंभ समय के 55 मिनट के ऊपर वर्णित है। एक लापरवाह स्थिति में चूहों को रखें और ठीक करें। गर्दन चीरा खोलें और आम मन्या धमनी को फिर से उजागर करें।
    2. रियरफ्यूजन को प्राप्त करने के लिए अवरोधन अवधि के बाद आंखों के संदंश के साथ फिलामेंट को धीरे से खींचें और गाँठ को कसने से अस्थायी सीवन को स्थायी रूप में बदल दें।
    3. एसिडोसिस उपचार के लिए, नाक शंकु से मिश्रित वायु में 20% सीओ 2 , 20% ओ 2 और 60% एन 5 से 5 मिनट, 5, 50 या रिपरफ्यूशन के बाद 100 मिनट वाले गैस को बदल दें। एक बाधित सर्जिकल सिवनी के साथ चीरा को बंद करें
    4. चूहों को 30 डिग्री सेल्सियस गर्मी पिंजरे में रखें, जब तक चूहों की चेतना ठीक हो जाएऔर फिर चूहों को साफ करने के लिए, व्यक्तिगत पिंजरों को वापस। पेट्री डिश के पानी के साथ चूहों को प्रदान करें और भोजन को सिक्त करें। अत्यधिक दर्द और मृत्यु के लिए सर्जरी के बाद चूहों की निगरानी करें।
  5. मस्तिष्क इन्फ़र्क्ट वॉल्यूम माप:
    1. रीपरफ्यूजन के बाद टीटीसी धुंधला 24 घंटे का उपयोग करके मस्तिष्क अवरक्त मात्रा को मापें।
    2. बलिदान के निर्दिष्ट समय से पहले चरण 1.4.1 में उल्लिखित 0.25% टीटीसी समाधान तैयार करें। समाधान 24-अच्छी तरह से प्लेट (1 एमएल प्रति अच्छी तरह से) में पन्नी में ढंकें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रख दें।
      नोट: टीटीसी और टीटीसी के साथ दाग वाले ऊतक हल्के संवेदनशील होते हैं।
    3. रिपरफ्यूज के बाद 24 घंटे में, एक प्रेरण कक्ष में isoflurane अधिक मात्रा के साथ जानवरों का त्याग करें। चूहों को खिसकाना छोटे कैंची और संदंश का उपयोग कर दिमाग काटना विलिस के सर्किल में उपराणुकाशीय रक्तस्राव के तहत चूहों को बाहर करने के लिए मस्तिष्क पर खूनी अंक की जांच करें।
    4. मस्तिष्क को -20 डिग्री पर साफ गिलास स्लाइड पर रखें ; सी आइस पैक मस्तिष्क और कांच की स्लाइड को -20 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में 5 मिनट के लिए रखें ताकि मस्तिष्क को टुकड़ा करना आसान हो।
    5. मस्तिष्क और कांच की स्लाइड -20 डिग्री सेल्सियस से बाहर निकालें और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस आइस पैक पर वापस लाएं। लहराल पोल और ब्लेड और संदंश के साथ सेरिबैल काटना।
    6. 5 स्लाइस बनाने के लिए एक ब्लेड के साथ 1 मिमी मोटाई के लिए क्षैतिज रूप से मस्तिष्क वर्गों को स्लाइस करें। स्लाइस को 24-अच्छी तरह से प्लेट में रखें जिसमें टीटीसी समाधान युक्त (1 टुकड़ा प्रति अच्छी तरह से) संदंश के साथ होता है और समाधान में स्लाइस को फैलाना। टीटीसी समाधान में स्लाइस को 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए उथले पानी के स्नान में सेते हैं।
    7. टीटीसी समाधान की तरक्की करें 10% फॉर्मलाडेहाइड (1 एमएल प्रति अच्छी तरह से) जोड़ें और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते रहें स्लाइस को क्रम में रखें, जिसमें उन्हें सिलोफ़न शीट पर काट दिया गया था और फोटो प्लेटलेट इमेजर में सेगमेंट को स्कैन कर दिया गया था।
    8. ImageJ विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर पूरे मस्तिष्क टुकड़े के प्रतिशत के रूप में infarct आकार का विश्लेषण करेंLass = "xref"> 8 दृश्य पहचान के आधार पर; चित्रा 2 (बाएं) देखें

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Representative Results

ऊपर वर्णित कॉर्टिकोस्ट्रिएटल स्लाइस मॉडल में, रीपरफ्यूजन के बाद कॉर्टिकोस्ट्रियल स्लाइस व्यवहार्यता 1 टी पर टीटीसी परख द्वारा मात्रा निर्धारित की गई थी। टीटीसी रूपांतरण को 4 9 0 एनएम पर नियंत्रण टुकड़े के अवशोषण के सामान्यकरण द्वारा गणना की गई थी। टीटीसी रूपांतरण के अनुसार, एपीसी एक शुरुआती समय और अवधि-निर्भर तरीके से ओजीडी प्रेरित रीपरफ्यूजन इज़न के प्रति सुरक्षित है। विस्तार से, एसिडोसिस उपचार के 1 और 3 मिनट दोनों में 15 मिनट ओजीडी के बाद 5 मिनट में व्यवहार्यता में सुधार हुआ है, जबकि 5 मिनट (ओजीडी: 0.60 9 ± 0.029, 5/1: 0.758 ± 0.034, 5/3: 0.821 ± 0.041, 5/5: 0.672 ± 0.053, डेटा ± SEM के रूप में दर्ज किया गया डेटा) ( चित्रा 1 ए )। एसिडोसिस उपचार द्वारा न्यूरोप्रॉक्टेशन रिपरफ्यूज़न के बाद 5 मिनट के भीतर सुरक्षात्मक रहा, जबकि 15 मिनट (ओजीडी: 0.584 ± 0.044, 0/3: 0.762 ± 0.036, 5/3: 0.833 ± 0.062, 15/3: 0.627 ± 0.038) ( आकृति 1 बी )।

एमसीएओ मॉडल में, 5 मिनट में अम्लरोग उपचार शुरू करने के 5 मिनट में रीपरफ्यूज के शुरू होने के बाद, छोटे इन्फर्क्ट वॉल्यूम (एमसीएओ: 33.4 ± 4.4%, 5/5: 16.6 ± 2.7%, 50 / 5: 1 9 .5 ± 2.1%, 100/5: 37 ± 2.1%)। Neuroprotection अभी भी मजबूत था, भले ही शुरूआत समय reperfusion के बाद 50 मिनट में देरी हो गई थी। हालांकि, 100 मिनट में शुरू की गई एसिडोसिस उपचार से इस्कीमिक चोटों ( चित्रा 2 ) को रोक नहीं किया गया था।

सभी आंकड़ों को अंधा कर लिया गया फैशन में एकत्र और विश्लेषण किया गया था। डेटा को ± एसईएम मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जाता है कॉर्टिकोस्ट्रिएटल टुकड़ा मॉडल में, प्रत्येक समूह में 6-8 नमूने हैं। एमसीएओ मॉडल में, प्रत्येक समूह में 9 से 10 नमूने हैं कम-से-कम महत्वपूर्ण अंतर वाले विचरण के एक-तर-से विश्लेषण कई तुलना के लिए लागू किया गया था।


चित्रा 1। कोर्टिकॉस्ट्रियल स्लाइसें में ओपीडी प्रोस्टेट्स ओजीडी प्रेरित रेपरफ्यूजन इज़न के खिलाफ। कॉर्टिकोस्ट्रियल स्लाइस को एग्डोज़ोसिस (पीएच 6.8) के साथ संकेतित अवधि (ए) के लिए और ओजीडी के बाद वसूली अवधि (बी) का संकेत दिया गया। रिपरफ्यूजन के बाद 24 घंटे के बाद सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन 24 - 4 [4,5-डाईमेथिथियाजोल -2-य्ल] -2,5-डीफिनीथेटेज़ोलियम ब्रोमाइड परख के द्वारा किया गया था, और कॉर्टिकोस्ट्रिएटल स्लाइस व्यवहार्यता टीटीसी परख द्वारा रिफ्रेंसिंग के 1 घंटे बाद की मात्रा निर्धारित किया गया था। मान दर्शाते हैं ± एसईएम प्रत्येक समूह के लिए n = 6 - 8; * पी <0.05 और ** पी <0.01 विचरण के एक तरफ़ा विश्लेषण; आर, रीपरफ्यूजन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

"चित्रा चित्र 2। एपीसी चूहे में एमसीएओ प्रेरित चोट के खिलाफ रक्षा करता है जानवरों को 60 मिनट के एमसीएओ के अधीन किया जाता था और रीपरफ्यूजन के बाद 5, 50 या 100 मिनट में 5 मिनट के लिए 20% सीओ 2 में श्वास लेने से इलाज किया जाता था। रिपरफ्यूज़न (बाएं पैनल पर काले बिंदुित रेखा द्वारा इंगित) के बाद 24 घंटे में इंफर्ट की मात्रा 2,3,5-ट्रिपिनोल्टेट्रोजोलियम हाइड्रोक्लोराइड स्टैनिंग द्वारा मात्रा निर्धारित की गई थी। मान दर्शाते हैं ± एसईएम प्रत्येक समूह के लिए n = 8 - 10; * पी <0.05 और ** पी <0.01 विचरण के एक तरफ़ा विश्लेषण; आर, रीपरफ्यूजन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

यहां हम सेरेब्रल इस्केमिया के खिलाफ एपीसी के न्यूरोप्रसंक्षा का अध्ययन करने के लिए दो प्रयोगात्मक मॉडल पेश करते हैं। मस्तिष्क के स्लाइस में, एपीसी अम्लीय बफर में चूहों कोर्टेकोस्ट्रियल स्लाइस को उकसाने के द्वारा प्राप्त किया जाता है, जो रीपरफ्यूज़न शुरू होने के बाद 20% सीओ 2 के साथ होता है, जबकि एमसीएओ मॉडल में, एपीसी रीपरफ्यूजन के बाद 20% सीओ 2 से चूहों को साँस लेने से प्राप्त होता है। दोनों मॉडल मस्तिष्क आइसकेमिया के विरुद्ध एपीसी के न्यूरोप्रसंक्षा को दर्शाते हैं। सुरक्षा इसीकी तुलना में इस्केमिक पोस्टकंडिशनिंग द्वारा हासिल की गई थी, लेकिन एक व्यापक समय खिड़की के साथ। एमसीएओ मॉडल में, समय खिड़की रिचार्फ़्यूज़न के बाद 50 मिनट के बराबर हो सकती है, जो कि इस्कीमिक पोस्टसींडिशनिंग 15 के लिए 10 मिनट के बराबर है। इसके अतिरिक्त, एपीसी की प्रक्रिया आसान और सुरक्षित है।

कॉर्टिकोस्ट्रियल स्लाइस मॉडल में, कोमल और तेजी से काम करने के लिए मस्तिष्क के स्लाइस की व्यवहार्यता अधिकतम हद तक वारंट महत्वपूर्ण हैं। एमसीएओ के प्रदर्शन के लिए, मस्तिष्क रक्त प्रवाह की निगरानी हैआवश्यक है, और रक्त प्रवाह की तेज गिरावट को ध्यान में रखा जाना चाहिए ताकि मध्य सेरेब्रल धमनी के अवरोध को सुनिश्चित किया जा सके। टीटीसी के धुंधला के लिए मस्तिष्क को विच्छेदित किए जाने के बाद, उप-काश्मनी रक्तस्राव के बहिष्कार के लिए दिमाग की सावधानीपूर्वक जांच करना आवश्यक है।

एपीसी की न्यूरोप्रसंक्षा को हासिल करने के लिए एसिडोसिस की अवधि और विस्तार महत्वपूर्ण हैं। कॉर्टिकोस्ट्रियल स्लाइस मॉडल ( चित्रा 1 ए ) में एसिडोसिस उपचार की लंबी अवधि फायदेमंद नहीं है। इसके अलावा, हमारे पिछले अध्ययन में पता चला है कि 10% और 20% सीओ 2 में श्वास लेने के बजाय, 30% सीओ 2 में से साँस लेना चूहों 8 पर neuroprotection प्रदान करता है। ये सुझाव देते हैं कि एपीसी की न्यूरोप्रसंक्षा के लिए हल्के एसिडोसिस महत्वपूर्ण है, और इस प्रकार सीओ 2 की एकाग्रता और एपीसी की अवधि एसिडोसिस न्यूरोप्रेट्रेशन के लिए अपरिहार्य है।

टीटीसी धुंधला के अलावा, कई तकनीकों को एस के साथ जोड़ा जा सकता हैविविध अनुसंधान आवश्यकताओं को ठीक करना उदाहरण के लिए, एक्सेस्मिथिया और एसिडोज़्सेज न्यूरोल संभावित 16 को प्रभावित करने के लिए अंतिम चरण में अतिरिक्त सेलुलर इलेक्ट्रिक रिकॉर्डिंग को जोड़ा जा सकता है। एचपीएलसी 17 द्वारा एपीसी के बाद अमीनो एसिड न्यूरोट्रांसमीटर के एकाग्रता में परिवर्तन को मापने के लिए मस्तिष्क टुकड़े का छिड़काव समाधान भी एकत्र किया जा सकता है। विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों के स्लाइस्स को एक विशिष्ट क्षेत्र की प्रतिक्रियाओं को आइस्केमिया और एपीसी से अध्ययन करने के लिए तैयार किया जा सकता है। कुल मिलाकर, कई विकल्पों को आइसकेमिया और एसिडोसिस के प्रभावों को रोशन करने के लिए पेश किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81573406, 81373393, 81273506, 81221003, 81473186 और 81402 9 7), झेजियांग प्रांतीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (एलआर 15 एच 310001) और एसएंडटी इनोवेशन टीम (2011 आर 50014) की Zhejiang अग्रणी टीम के लिए कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Sigma S5886
Potassium chloride Sigma P5405
Potassium phosphate monobasic Sigma P9791
Magnesium sulfate Sigma M2643
Sodium bicarbonate Sigma S5761
Calcium chloride dihydrate Sigma C5080
D-(+)-Glucose Sigma G7021
Vibratome Leica VT1000 S
2,3,5-triphenyltetrazolium hydrochloride Sigma T8877
Absolute Ethanol Aladdin Industrial Corporation E111993
Dimethyl sulfoxide Sigma D8418
Laser Doppler Flowmetry Moor Instruments Ltd Model Moor VMS-LDF2
Diethyl ether anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Corporation 80059618
Trichloroacetaldehycle hydrate Sinopharm Chemical Reagent Corporation 30037517
10% Formalin Aladdin Industrial Corporation F111936
24-well plates Jet Biofil TCP-010-024

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References

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न्यूरोबोलॉजी अंक 125 सेरेब्रल इस्केमिया अम्लीय पोस्टकंडिशनिंग कोर्टिकॉस्ट्रिएटल स्लाइस ऑक्सीजन-ग्लूकोस अभाव मध्य मस्तिष्क धमनी अवरोधन (एमसीएओ) मस्तिष्क अवरोधक मात्रा समय खिड़की
प्रायोगिक मॉडल सेरेब्रल इस्केमिया के खिलाफ एसिडिक पोस्टकंडिशनिंग के न्यूरोप्रॉक्टेशन का अध्ययन करने के लिए
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Zheng, Y., Shen, Z., Wu, X., Jiang,… More

Zheng, Y., Shen, Z., Wu, X., Jiang, L., Hu, W., Chen, Z., Zhang, X. Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia. J. Vis. Exp. (125), e55931, doi:10.3791/55931 (2017).

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