Summary
Zure postconditioning beschermt tegen cerebrale ischemie. Hier presenteren wij twee modellen om APC uit te voeren. Ze worden respectievelijk bereikt door corticostriatale plakjes over te brengen naar zure buffer na zuurstof-glucose-deprivatie in vitro en door inademing van 20% CO 2 na middelste cerebrale arterie-occlusie in vivo .
Abstract
Stroke is een van de belangrijkste oorzaken van sterfte en handicap wereldwijd, met beperkte therapeutische benaderingen. Als een endogene strategie voor neuroprotectie, hebben postconditionerende behandelingen bewezen veelbelovende therapieën tegen cerebrale ischemie. Maar ingewikkelde procedures en mogelijke veiligheidsproblemen beperken hun klinische toepassing. Om deze nadelen te overwinnen hebben we een zware postconditioning ontwikkeld (APC) als een therapie voor experimentele focal cerebrale ischemie. APC verwijst naar de milde acidose behandeling door CO 2 in te ademen tijdens reperfusie na ischemie. Hier presenteren wij twee modellen om respectievelijk APC in vitro en in vivo uit te voeren. De zuurstof-glucose-deprivatie (OGD) -behandeling van muizen en de corticostriatale occlusie- en middelste cerebrale arteriële occlusie (MCAO) van muizen werden gebruikt om cerebrale ischemie te mimmen. APC kan eenvoudig worden bereikt door hersenschijfjes over te brengen naar zuurbuffer die met 20% CO 2 , o wordt geborreldR door muizen die 20% CO 2 inademen. APC vertoonde significante beschermende effecten tegen cerebrale ischemie, zoals weerspiegeld door weefsel levensvatbaarheid en het infarct volume van het hersenen.
Introduction
Beroerte is een van de belangrijkste oorzaken van sterfte en handicap wereldwijd. Er zijn grote inspanningen gedaan om effectieve behandelingen voor beroerte in de afgelopen decennia te vinden, maar de prestatie is nogal onbevredigend. Postconditioning is een proces gemanipuleerd door subtoxische spanningen na een ischemische aflevering. Postconditioning, met inbegrip van ischemische, hypoxische, lage glucose en afgelegen ischemische postconditioning, trigger endogene adaptieve mechanismen, en bewezen zijn veelbelovende therapieën tegen cerebrale ischemie 1 , 2 , 3 , 4 . Echter, ischemische postconditioning kan extra verwonding veroorzaken. Limb op afstand ischemische postconditioning heeft meestal verschillende cycli van 5 tot 20 minuten occlusie en reperfusie op de ipsilaterale of bilaterale achterste ledematen 5 , 6 , 7 . thDaarom zijn deze postconditioning manipulaties gevaarlijk of onpraktisch in de klinische praktijk. Om deze nadelen te overwinnen hebben we APC ontwikkeld als een therapie voor focal cerebrale ischemie bij muizen 8 . Geïnduceerd door simpelweg 20% CO 2 in te ademen, vermindert APC de ischemische hersenletsel op een meer haalbare en veiliger manier. Onlangs hebben we aangetoond dat APC het reperfusievenster uitbreidt, waarbij de betekenis van APC voor beroertetherapie 9 wordt benadrukt.
Hier presenteren wij twee experimentele modellen om de neuroprotectie van APC tegen cerebrale ischemie te bestuderen. De eerste is het zuurstof-glucose-deprivatie model (OGD) in muizen corticostriatale plakjes. Snelle voorbereiding en overdracht van de hersenschijfjes in een kunstmatige omgeving, meestal kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ASCF), kan de levensvatbaarheid van cellen en neuronale schakelingen handhaven, waardoor het mogelijk is om hersenfunctie in vitro te studeren 10 <Sup>, 11 . OGD in ASCF nabootst cerebrale ischemie en induceert ischemische schade 12 , 13 , 14 . Na OGD worden de hersenschijfjes vernieuwd in regelmatig ASCF (r-ASCF) om reperfusie te verschaffen en vervolgens met APC te behandelen met behulp van zure ASCF met 20% CO 2 geborreld. De corticostriatale plak houdt de intacte histologische karakterisering in vergelijking met primaire gekweekte cellen.
Om de hersenfunctie in vivo te bestuderen wordt het muizen midden cerebrale slagader occlusie (MCAO) model gebruikt. De middelste hersenslagader wordt geblokkeerd door een vlamvormige monofilament via de gemeenschappelijke halsslagader in te voegen. Als een van de meest gebruikte stroke modellen, toont het MCAO-model klinische relevantie en de toepassing van een monofilament maakt het gemakkelijker om reperfusie te bereiken. Simpelweg door het inademen van normoxisch gemengd gas met 20% CO 2 na het begin van reperfusioN, APC toonde significante beschermende effecten tegen cerebrale ischemie, aangeduid door verminderde infarctvolumes van de hersenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden goedgekeurd door en uitgevoerd in overeenstemming met de ethische richtlijnen van de Zhejiang Experimentatie Dieren Experimentatie en waren in volledige overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de zorg en het gebruik van laboratoriumdieren. Er werden inspanningen gedaan om pijn of ongemak te minimaliseren en het minimale aantal dieren werd gebruikt.
1. OGD van Corticostriatale Plakjes
- Oplossingspreparatie:
- Bereid 1000 ml r-ACSF (124 mmol / L NaCl, 5 mmol / l KCI, 1,25 mmol / l KH 2PO 4, 2 mmol / l MgSO4, 26 mmol / l NaHCO3, 2 mmol / l CaCl2, 10 mmol / L glucose, uiteindelijke pH 7,4). Bubble met 5% CO 2 en 95% O 2 gedurende het experiment.
- Bereid 200 ml glucosevrije ACSF (gf-ACSF) zoals boven maar exclusief glucose, bubbelde met 5% CO 2 en 95% N 2 . Bubbel de gassen 30 minuten voor het aanbrengen op brAi plakjes om het zuurstofgehalte in de oplossing te verminderen. Blijf doorborrelen tot de OGD procedure is voltooid.
- Bereid zuur ACSF (a-ACSF) door 200 ml r-ACSF met 20% CO 2 en 80% O 2 te equilibreren. Bubbel de gassen gedurende 30 minuten voordat u op breinschijfjes aanbrengt om de pH van de oplossing tot pH 6,8 te verminderen en door te blazen tot de APC-procedure is afgerond.
- Plaats drie weefselhouders in respectievelijk r-ACSF, gf-ACSF, a-ACSF.
- Brainschijfvoorbereiding:
Opmerking: 8-jarige mannelijke C57Bl / 6J-muizen werden in deze studie gebruikt. De dieren werden onder gecontroleerde temperatuur (22 ± 2 ° C) gehuisvest, met een 12-uur lange donkere cyclusperiode en toegang tot gepelleteerde voedsel en water.- Offer een muis met een overdosis van isofluraan in een inductiekamer. Decapiteer de muis. Dissect de hersenen met behulp van kleine scharen en tang. Verwijder de hersenen met een dunne spatel en laat het zorgvuldig in een glazen bekercontact komenIjskoud r-ACSF in evenwicht gebracht met 5% CO 2 en 95% O 2 .
OPMERKING: Deze stappen moeten zo snel maar nauwgezet mogelijk worden uitgevoerd. - Houd de hersenen in de ijskoude r-ACSF gedurende 5 minuten. Stel de gasdruk in om bewegingen van de hersenen te vermijden.
- Plaats de cryoprecipitaatlijm op de vibratomeerplaat in twee stroken. Leg een stukje 3% agarose op de lijmstrip van het mes om de hersenen te ondersteunen.
- Omkeer een 10 cm Petri-schotel op ijs en zet dan een filterpapier op de schotel. Vochtig het filterpapier met druppels ijskoud r-ACSF.
- Breng de hersenen naar het filterpapier met tang. Knip de voorpaal en de cerebellum af met knip en tang.
OPMERKING: De dwarsdoorsneden moeten zo glad mogelijk zijn en verticaal naar sagittaalvlak. - Plaats het resterende hersenweefsel verticaal op de andere lijmstrip en houd de hersenen tegen de agarose leunend. Voeg ijskoude r-ACSF toe aan het snijreservoirDe hersenen onderdompelen en ijs toevoegen aan het ijshoudergebied. Bewaar de r-ACSF in het reservoir met 5% CO 2 en 95% O 2 .
- Verhoog het reservoir en pas de positie van de scheermes aan om de scheermes zo dicht bij de hersenen mogelijk te plaatsen en net boven de hersenen.
- Kies de "CONT" -modus om de hersensecties continu te snijden. Stel de snijdikte in op 400 μm, trillingsfrequentie tot 6 - 8 en snelheid tot 3 - 4. Druk op de knop "start / stop" om automatisch te snijden.
- Knip het punt van een 3 ml Pasteur pipette af om een opening te maken die overeenstemt met de grootte van de hersenschijfjes.
OPMERKING: De opening moet groot genoeg zijn om extra schade aan de hersenschijfjes te vermijden. - Teken vijf breinschijfjes één voor één met de tip-cutPasteur-pipet en plaats ze in de weefselhouder in ijskoude r-ACSF met 5% CO 2 en 95% O 2 . Verzamel niet de eerste geproduceerde plak. Stel de gasdruk in de luchtD bewegingen van de hersenen plakjes.
OPMERKING: De breinschijfjes mogen elkaar niet bedekken. - Leg breinschijfjes met r-ACSF bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten en daarna nog eens 10 minuten bij 37 ° C in een waterbad om synaptische functies te herstellen.
- Offer een muis met een overdosis van isofluraan in een inductiekamer. Decapiteer de muis. Dissect de hersenen met behulp van kleine scharen en tang. Verwijder de hersenen met een dunne spatel en laat het zorgvuldig in een glazen bekercontact komenIjskoud r-ACSF in evenwicht gebracht met 5% CO 2 en 95% O 2 .
- OGD en APC:
- Plaats gf-ACSF en a-ACSF in een waterbad van 37 ° C en bel de buffers met de bijbehorende gassen zoals hierboven vermeld in 1.1.2 en 1.1.3 gedurende 30 minuten.
- Laat een stukje in r-ACSF als een controle. Breng de andere vier breinschijfjes zorgvuldig in de weefselhouder met voorverhitte gf-ACSF en incubeer gedurende 15 minuten. Breng de plakjes terug in de weefselhouder in r-ACSF om reperfusie te bereiken.
- Om het tijdvenster van APC te bestuderen, overstappen één snede rechtstreeks van gf-ACSF naar a-ACSF. Vervolgens de andere drie plakjes eerst naar r-ACSF, en verplaats daarna twee keer naar de weefselhouder in respectievelijk a-ACSF 5 en 15 minuten na reperfusie.
- IncubatE de 3 plakjes in a-ACSF gedurende 3 minuten en geef ze vervolgens terug naar r-ACSF. Incubeer de drie plakjes in r-ACSF gedurende nog eens 1 uur. Stel de resterende segmenten in r-ACSF als de OGD-groep in.
- Voor een dosis respons studie, verplaats alle vier plakjes aan de weefselhouder in r-ACSF, eerst na OGD en incubeer gedurende 5 minuten. Verlaat dan een snij in r-ACSF als de OGD-groep en verplaats de overige drie plakjes naar a-ACSF. Incubeer de plakjes in a-ACSF respectievelijk respectievelijk 1, 3 en 5 minuten en laat ze vervolgens terug naar r-ACSF. Incubeer de drie plakjes in r-ACSF gedurende nog eens 1 uur.
- Slice viability determination:
- Bereid 0,25% 2,3,5-trifenyltetrazoliumhydrochloride (TTC) normale zoutoplossing op. Voeg 1,25 g TTC poeder toe aan 500 ml normale zoutoplossing.
OPMERKING: Nadat het poeder volledig is opgelost, breng de oplossing over in een 24-putjesplaat (500 μL per putje), bedekt met folie en opslaan bij 4 ° C. TTC en weefsel gekleurd met TTC zijn licht sensitive. - Breng de plakken over in een 24-putjesplaat (een stuk per putje) die TTC-oplossing bevat en de plak in de oplossing uitrekken. Incubeer de plakjes in TTC-oplossing bij 37 ° C in een ondiep waterbad gedurende 30 minuten.
- Breng de plakken over in schone 1,5 ml centrifugebuizen die in folie zijn bedekt en meet het droge gewicht van de plakjes.
- Voeg ethanol / dimethylsulfoxide (1: 1) in de centrifugebuizen (v: w = 10: 1) om formazan te extraheren. Incubeer de plakjes in ethanol / dimethylsulfoxide bij kamertemperatuur weg van het licht gedurende 24 uur.
- Voeg alle ethanol / dimethylsulfoxide in de buizen in een 96-putjesplaat en meet de absorptie bij 490 nm door een plaatlezer.
- Normaliseer de absorptie op het droge gewicht van de plak en expresseer de levensvatbaarheid als percentage van de controleschijf.
- Bereid 0,25% 2,3,5-trifenyltetrazoliumhydrochloride (TTC) normale zoutoplossing op. Voeg 1,25 g TTC poeder toe aan 500 ml normale zoutoplossing.
2. MCAO
- Voorbereiding:
- Desinfecteer de werkbank, het oppervlak van de Laser Doppler FlowmetrY (LDF) instrument en zijn accessoires met 70% ethyl alcohol.
- Voorbereiden autoclave instrumenten: twee scharen, 10 cm; Twee tang, 10 cm; Een oftalmische tang, 11 cm; Een micro-oogschaar, 9 cm; Een microvessel klem, 1,8 cm; Oneneedle drive, r 12,5 cm; Verscheidene chirurgische hechtingen (△ 1/2 4 × 10); wattenstaafjes.
- Bereid een spuit (zonder naald) op met een zoutoplossing om een gehydrateerd bedieningsgebied te handhaven.
- Bereid het anesthesiegas (100% O 2 + isofluraan).
- Detectie van de bloedstroom van de hersenen:
- Stel het LDF-instrument op.
- Injecteer pijnstillers intraperitoneaal in de muis: metamizol 200 mg / kg, carprofen 4 mg / kg en buprenorfine 0,1 mg / kg.
- Plaats de muis in een inductiekamer met 4% isofluraan in zuurstof om het te verdovend tot spontane beweging van het lichaam en de vibrissae stopt.
- Plaats de muis in een slechte positie met zijn neus in de steek geplaatstE neuskegel en behoud van isofluraan bij 1,5% voor de daaropvolgende procedure.
- Breng dexpanthenol oogsalf aan beide ogen aan.
- Desinfecteer het hoofd met 70% ethyl alcohol.
- Maak een juiste paramedische huidinsnijding tussen de ogen en de oren met behulp van een scalpel om de bregma bloot te stellen.
- Vryf de schedel met steriele katoen.
- Breng 1 tot 2 druppels chirurgische lijm aan op het oppervlak van de schedel.
- Plaats de tip van de glasvezel sonde 5 mm caudal aan de bregma en 6 mm lateraal aan de middellijn.
- Begin met het opnemen van de bloedstroom op de computersoftware. Wacht tot een stabiele bloedstroom basislijn optreedt en plaats dan een 20 μL katalysator op de lijm om de sonde vast te zetten.
OPMERKING: een ideale basislijn moet meer dan 500 flux zijn. - Als de basislijn minder dan 200 flux is, pas de positie fijn om een geschikte basislijn te krijgen. Houd de sonde vast aan de schedel voor de duur van het experiment.
- Desinfecteer het hoofd met iodophor afTer bevestiging van de glasvezel sonde.
- MCAO:
- Plaats de anesthetiseerde muis (met LDF-sonde bevestigd aan de schedel) in een rustige positie en houd de lichaamstemperatuur met behulp van een warmtelamp door de operatie. Desinfecteer de nek met 70% ethyl alcohol.
- Maak een paramedische huidinsnijding in de nek met behulp van een scalpel; Ontleed de zachte weefsels met pincet om de schepen bloot te stellen. Voeg een druppel zoutoplossing toe aan de blootgestelde weefsels om ze gedroogd te houden.
- Dissecteer de gemeenschappelijke halsslagader van het omliggende weefsel en de vagus-zenuw met behulp van oftalmische tang. Wees voorzichtig om de vagus zenuw niet te beschadigen. Desinfecteer de huid van de nek opnieuw met iodophor na de blootstelling van de gewone halsslagader.
- Plaats een microvessel klem op het distale uiteinde van de gewone halsslagader en bind dan een dode knoop met 6-0 zijden hechten aan het proximale uiteinde. Plaats de klem zo proximaal mogelijk voor de volgende werkzaamheden. Zorg ervoor dat de lengte vanHet schip tussen de klem en de dode knoop is zo lang mogelijk voor de volgende werkzaamheden.
- Maak een tijdelijke hechting proximaal aan de klem door een losse knoop vast te binden. Zorg ervoor dat er voldoende ruimte is tussen twee knopen voor monofilament inbrengen.
- Maak een kleine lengte tussen de twee knopen met een micro-oogschaar. Zorg ervoor dat de incisie zo dicht bij de dode knoop mogelijk is voor latere operaties. Wees voorzichtig om het vaartuig niet af te snijden.
- Steek een 12 mm dikke monofilament door de insnijding om het slagaderlumen in te voeren en een paar mm verder te maken. Draai de losse knop om de punt van de monofilament vast en verwijder de klem.
- Bevorder het filament in de inwendige halsslagader (10 mm om de middelste hersenslagader te sluiten) met oftalmische tang totdat de LDF-software een scherpe daling (> 80% reductie van de basisbloedstroom) in de bloedstroom laat zien. Noteer de starttijd van de occlusie.
OPMERKING: LDF instrument setup isBeschreven in sectie 2.2. - Ontwijk de middelste hersenslagader gedurende 1 uur. Knip de LDF-sonde uit en zet de muizen in een incubator van 30 ° C gedurende de duur van de okklusie.
- Reperfusie en APC:
- Re-anesthetiseer de dieren met isofluraan zoals hierboven beschreven 55 minuten na het begin van de okklusie. Plaats en fix muizen in een rugliggende positie. Open de nekinsnijding en laat de gemeenschappelijke halsslagader terug.
- Verwijder de filament voorzichtig met oogmassa na de okklusieperiode om reperfusie te bereiken en draai de tijdelijke hechting in een permanente door de knoop aan te trekken.
- Voor de acidose behandeling, verander het gas dat door de neuskegel wordt ingeademd naar de menggassen die 5, 50 of 100 minuten na reperfusie bevatten met 20% CO 2 , 20% O 2 en 60% N 2 gedurende 5 minuten. Sluit de incisie met een onderbroken chirurgische hechting.
- Plaats muizen in een warmtekooi van 30 ° C tot muizen het bewustzijn herstellenEn ga dan de muizen terug om schoon, individuele kooien te reinigen. Geef muizen een petrischaal water en vochtig vocht. Monitor de muizen nauw na de operatie voor overmatige pijn en dood.
- Brain Infarct volumemeting:
- Meet het infarctvolume van de hersenen door gebruik te maken van TTC-kleuring 24 uur na reperfusie.
- Bereid 0,25% TTC-oplossing zoals vermeld in stap 1.4.1 voorafgaand aan de aangegeven tijd van het offeren. Breng de oplossing over in een 24-putjesplaat (1 ml per putje), bedekt met folie en sla het op bij 4 ° C.
OPMERKING: TTC en weefsel gekleurd met TTC zijn lichtgevoelig. - Op 24 uur na reperfusie, offer het dier met een overdosis van isofluraan in een inductiekamer. Decapiteer de muizen. Dissect de hersenen met behulp van kleine scharen en tang. Onderzoek bloedpunten op de hersenen om de muizen die subarachnoïdale hemorragie ondergaan in de Circle of Willis uit te sluiten.
- Plaats de hersenen op een schone glijbaan op -20 ° ; C ijspakketje Plaats de hersenen en de glazen glijbaan in een koelkast van -20 ° C gedurende 5 minuten om de hersenen makkelijker te snijden.
- Verwijder de hersenen en de glazen glijbaan van -20 ° C en zet ze terug op de -20 ° C ijspak. Dissecteer de voorpaal en de cerebellum met mes en tang.
- Snijd de breinsecties horizontaal tot een 1 mm dikte met een mes om 5 plakjes te produceren. Breng de plakjes in de 24-putjesplaat met TTC-oplossing (1 stuk per putje) met tang en steek de plakjes uit in de oplossing. Incubeer de plakjes in TTC-oplossing bij 37 ° C in een ondiep waterbad gedurende 30 minuten.
- Aspireer de TTC oplossing. Voeg 10% formaldehyde (1 ml per putje) toe en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Leg de plakjes in de volgorde waarin ze op een cellofaanblad werden gesneden en scan de segmenten in de fotografische plaatbeelder.
- Analyseer de infarctgrootte als een percentage van de gehele breinschijf met behulp van ImageJ analyse softwareLass = "xref"> 8 gebaseerd op visuele identificatie; Zie figuur 2 (links).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In het hierboven beschreven corticostriatale snijmodel werd de corticostriatale snij-levensvatbaarheid gekwantificeerd door TTC-analyse op 1 uur na reperfusie. TTC-omzetting werd berekend door de absorptie bij 490 nm te normaliseren op de controleschijf. Volgens de TTC-omzetting beschermt APC tegen OGD-geïnduceerde reperfusie letsel in een aanvangstijd en duurafhankelijke wijze. In detail heeft zowel 1 en 3 min. Acidose behandeling de levensduur verbeterd na 5 minuten na 15 minuten OGD, terwijl 5 minuten niet (OGD: 0,609 ± 0,029, 5/1: 0,758 ± 0,034, 5/3: 0,821 ± 0,041, 5/5: 0.672 ± 0.053, data gemeld als gemiddelde ± SEM) ( Figuur 1 A ). De neuroprotectie door acidose behandeling bleef binnen 5 minuten na reperfusie beschermend, terwijl 15 minuten niet (OGD: 0,584 ± 0,044, 0/3: 0,762 ± 0,036, 5/3: 0,833 ± 0,062, 15/3: 0,627 ± 0,038) ( Figuur 1 B ).
In het MCAO-model, 5 minuten na de aanvang van de reperfusie, 5 minuten van de acidose-behandeling, werd gered door cellulaire dood veroorzaakt door ischemische belediging, weerspiegeld door kleinere infarctvolumes (MCAO: 33,4 ± 4,4%, 5/5: 16,6 ± 2,7%, 50 / 5: 19,5 ± 2,1%, 100/5: 37 ± 2,1%). De neuroprotectie was nog steeds robuust, zelfs wanneer de aanvangstijd tot 50 minuten na reperfusie werd uitgesteld. Echter, de behandeling van de acidose op 100 minuten begon de ischemische verwondingen niet te blokkeren ( Figuur 2 ).
Alle gegevens werden op blinde wijze verzameld en geanalyseerd. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. In het corticostriatale segmentmodel heeft elke groep 6-8 monsters. In het MCAO-model heeft elke groep 9-10 monsters. One-way analyse van variantie met het minst significante verschil werd toegepast voor meerdere vergelijkingen.
Figuur 1 . APC beschermt tegen OGD-geïnduceerde Reperfusion Injury in Corticostriatale Schijfjes. Corticostriatale plakjes werden behandeld met acidose (pH 6,8) voor aangegeven duur (A) en aangegeven herstelperioden (B) na OGD. De cellevendabiliteit werd 24 uur na reperfusie beoordeeld door de 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-difenyltetrazoliumbromide-bepaling, en de levensduur van de corticostriatale snede werd bij 1 uur na reperfusie gekwantificeerd door TTC-analyse. Waarden tonen gemiddelde ± SEM. N = 6 - 8 voor elke groep; * P <0,05 en ** p <0,01 door eenrichtingsanalyse van variantie; R, reperfusie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2 . APC beschermt tegen MCAO-geïnduceerde schade in muizen. Dieren werden onderworpen aan 60 minuten MCAO en behandeld door inademing 20% CO2 gedurende 5 minuten bij 5, 50 of 100 minuten na reperfusie. Infarctvolume werd gekwantificeerd door 2,3,5-trifenyltetrazoliumhydrochloride-kleuring na 24 uur na reperfusie (aangeduid met zwarte stippellijn aan het linker paneel). Waarden tonen gemiddelde ± SEM. N = 8 - 10 voor elke groep; * P <0,05 en ** p <0,01 door eenrichtingsanalyse van variantie; R, reperfusie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren wij twee experimentele modellen om de neuroprotectie van APC tegen cerebrale ischemie te bestuderen. In breinschijfjes wordt APC bereikt door incubatie van muizen corticostriatale plakjes in zure buffer, die met 20% CO 2 na 20 20 20 20 20 20 20 25 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 25 30 35 60 100 Beide modellen weerspiegelen de neuroprotectie van APC tegen cerebrale ischemie. De bescherming was vergelijkbaar met dat verkregen door ischemische postconditioning maar met een breder tijdscherm. In het MCAO-model kan het tijdvenster zo lang als 50 minuten na reperfusie zijn in vergelijking met 10 minuten voor ischemische postconditioning 15 . Bovendien is de procedure van APC makkelijker en veiliger.
In het corticostriatale snijmodel zijn zachte en snelle operaties van cruciaal belang om de levensvatbaarheid van breinschijfjes in de maximale mate te waarborgen. Voor de MCAO prestatie is de cerebrale bloedstroombewakingVereist, en de scherpe daling van de bloedstroom moet worden waargenomen om de occlusie van de middelste hersenslagader te waarborgen. Nadat de hersenen werden uitgescheiden voor TTC-kleuring, is een zorgvuldig onderzoek van de hersenen nodig om subarachnoïde bloeding uit te sluiten.
De verlenging en de duur van acidose zijn cruciaal om de neuroprotectie van APC te bereiken. Langdurige duur van de behandeling van de acidose is niet gunstig in het corticostriatale snijmodel ( Figuur 1 A ). Bovendien blijkt uit onze vorige studie dat zowel 10% als 20% CO 2 -inhalatie, in plaats van 30% CO 2 -inhalatie, neuroprotectie op muizen 8 veroorzaakt . Deze suggereren dat milde acidose van cruciaal belang is voor de neuroprotectie van APC, en dus de concentratie van CO 2 en de duur van APC zijn onontbeerlijk voor de acidose neuroprotectie.
Naast TTC-kleuring kunnen veel technieken worden gecombineerd met sDiverse onderzoeksbehoeften bevredigen. Bijvoorbeeld, extracellulaire elektrische opname kan worden toegevoegd aan de laatste stap om te observeren hoe ischemie en acidose neuraal potentieel beïnvloeden 16 . De perfusieoplossing van hersenschijf kan ook worden verzameld om de concentratieverandering van aminozuur-neurotransmitters na APC met HPLC 17 te meten. Plakjes van een bepaalde hersengebied kunnen bereid zijn om de reacties van een bepaald gebied naar ischemie en APC te bestuderen. In het algemeen kunnen veel alternatieven worden geïntroduceerd om de effecten van ischemie en acidose te verlichten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (81573406, 81373393, 81273506, 81221003, 81473186 en 81402907), Zhejiang Provinciale Natuurwetenschappenstichting (LR15H310001) en het Programma voor Zhejiang Leading Team van S & T Innovatie Team (2011R50014).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Magnesium sulfate | Sigma | M2643 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C5080 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
| Vibratome | Leica | VT1000 S | |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium hydrochloride | Sigma | T8877 | |
| Absolute Ethanol | Aladdin Industrial Corporation | E111993 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Laser Doppler Flowmetry | Moor Instruments Ltd | Model Moor VMS-LDF2 | |
| Diethyl ether anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Corporation | 80059618 | |
| Trichloroacetaldehycle hydrate | Sinopharm Chemical Reagent Corporation | 30037517 | |
| 10% Formalin | Aladdin Industrial Corporation | F111936 | |
| 24-well plates | Jet Biofil | TCP-010-024 |
References
- Zhao, H., Sapolsky, R. M., Steinberg, G. K. Interrupting reperfusion as a stroke therapy: ischemic postconditioning reduces infarct size after focal ischemia in rats. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (9), 1114-1121 (2006).
- Leconte, C., et al. Delayed hypoxic postconditioning protects against cerebral ischemia in the mouse. Stroke. 40 (10), 3349-3355 (2009).
- Fan, Y. Y., et al. Transient lack of glucose but not O2 is involved in ischemic postconditioning-induced neuroprotection. CNS Neurosci Ther. 19 (1), 30-37 (2013).
- Hess, D. C., Hoda, M. N., Bhatia, K. Remote limb perconditioning [corrected] and postconditioning: will it translate into a promising treatment for acute stroke. Stroke. 44 (4), 1191-1197 (2013).
- Ren, C., Yan, Z., Wei, D., Gao, X., Chen, X., Zhao, H. Limb remote ischemic postconditioning protects against focal ischemia in rats. Brain Res. 1288, 88-94 (2009).
- Sun, J., et al. Protective effect of delayed remote limb ischemic postconditioning: role of mitochondrial K(ATP) channels in a rat model of focal cerebral ischemic reperfusion injury. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (5), 851-859 (2012).
- Li, P., et al. Remote limb ischemic postconditioning protects mouse brain against cerebral ischemia/reperfusion injury via upregulating expression of Nrf2, HO-1 and NQO-1 in mice. Int J Neurosci. , 1-8 (2015).
- Fan, Y. Y., et al. A novel neuroprotective strategy for ischemic stroke: transient mild acidosis treatment by CO2 inhalation at reperfusion. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (2), 275-283 (2014).
- Shen, Z., et al. PARK2-dependent mitophagy induced by acidic postconditioning protects against focal cerebral ischemia and extends the reperfusion window. Autophagy. 0, (2017).
- Skolnik, J., Takacs, L., Szende, E. In vitro oxygen consumption of slices from kidney, brain, cortex and liver in hypoxia. Nature. 209 (5020), 305 (1966).
- Lynch, G., Schubert, P. The use of in vitro. brain slices for multidisciplinary studies of synaptic function. Annu Rev Neurosci. 3, 1-22 (1980).
- Zheng, S., Zuo, Z. Isoflurane preconditioning reduces purkinje cell death in an in vitro model of rat cerebellar ischemia. Neuroscience. 118 (1), 99-106 (2003).
- Yin, B., Barrionuevo, G., Weber, S. G. Optimized real-time monitoring of glutathione redox status in single pyramidal neurons in organotypic hippocampal slices during oxygen-glucose deprivation and reperfusion. ACS Chem Neurosci. 6 (11), 1838-1848 (2015).
- Medvedeva, Y. V., Ji, S., Yin, H. Z., Weiss, J. H. Differential vulnerability of CA1 vs CA3 pyramidal neurons after ischemia: possible relationship to sources of Zn2+ accumulation and its entry into and prolonged effects on mitochondria. J Neurosci. , (2016).
- Pignataro, G., et al. In vivo and in vitro characterization of a novel neuroprotective strategy for stroke: ischemic postconditioning. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (2), 232-241 (2008).
- Zhang, X., Ding, H. Z., Jiang, S., Zeng, Y. M., Tang, Q. F. An in vitro study of the neuroprotective effect of propofol on hypoxic hippocampal slice. Brain Inj. 28 (13-14), 1758-1765 (2014).
- Niu, Y., et al. Chemical profiling with HPLC-FTMS of exogenous and endogenous chemicals susceptible to the administration of chotosan in an animal model of type 2 diabetes-induced dementia. J Pharm Biomed Anal. 104, 21-30 (2015).
