Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Экспериментальные модели для изучения нейропротекции кислотного посткондиционирования против церебральной ишемии

Published: July 31, 2017 doi: 10.3791/55931
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Pharmacology & Toxicology, College of Pharmaceutical Sciences, Department of Pharmacology, Key Laboratory of Medical Neurobiology of The Ministry of Health of China, Zhejiang Province Key Laboratory of Neurobiology, Zhejiang University
* These authors contributed equally

Summary

Кислотное посткондиционирование защищает от церебральной ишемии. Здесь мы представляем две модели для выполнения APC. Они достигаются, соответственно, путем переноса кортикотратальных срезов в кислый буфер после лишения кислород-глюкозы in vitro и при вдыхании 20% CO 2 после окклюзии средней церебральной артерии in vivo .

Abstract

Инсульт является одной из ведущих причин смертности и инвалидности во всем мире, с ограниченными терапевтическими подходами. В качестве эндогенной стратегии нейропротекции лечение после кондиционирования оказалось многообещающей терапией против церебральной ишемии. Однако сложные процедуры и потенциальные проблемы безопасности ограничивают их клиническое применение. Чтобы преодолеть эти недостатки, мы разработали кислотное посткондиционирование (APC) в качестве терапии экспериментальной фокальной церебральной ишемии. APC относится к легкой терапии ацидозом при вдыхании CO 2 во время реперфузии после ишемии. Здесь мы представляем две модели для выполнения APC in vitro и in vivo , соответственно. Для имитации церебральной ишемии применяли лечение личинки кислород-глюкозы (OGD) у мышей и окклюзию кортикостриала и окклюзию средней мозговой артерии (MCAO) у мышей. APC может быть просто достигнута путем переноса срезов мозга в кислый буфер, барботированный 20% CO 2 , oГ мышами, вдыхающими 20% CO 2 . APC показал значительные защитные эффекты против церебральной ишемии, что отразилось на жизнеспособности тканей и объеме инфаркта головного мозга.

Introduction

Инсульт является одной из ведущих причин смертности и инвалидности во всем мире. Большие усилия были предприняты для того, чтобы найти эффективные методы лечения инсульта в последние десятилетия, однако достижение довольно неудовлетворительное. Postconditioning - это процесс, которым манипулируют субтоксические стрессы после ишемического эпизода. Посткондиционирование, включая ишемическую, гипоксическую, низкую глюкозу и отдаленное ишемическое посткондиционирование, вызывает эндогенные адаптивные механизмы и, как доказано, является перспективной терапией против церебральной ишемии 1 , 2 , 3 , 4 . Однако ишемическое посткондиционирование может привести к дополнительным травмам. Конечное ишемическое посткондиционирование конечности обычно требует нескольких циклов окклюзии и реперфузии 5-20 минут на ипсилатеральных или двусторонних задних конечностях 5 , 6 , 7 . ThПоэтому эти посткондиционирующие манипуляции опасны или непрактичны в клинической практике. Чтобы преодолеть эти недостатки, мы разработали APC как терапию фокальной церебральной ишемии у мышей 8 . Индуцированный просто при вдыхании 20% CO 2 , APC значительно снижает ишемическое повреждение головного мозга более эффективным и безопасным способом. Недавно мы доказали, что APC расширяет окно реперфузии, подчеркивая важность APC для терапии инсульта 9 .

Здесь мы представляем две экспериментальные модели для изучения нейропротекции АРС против церебральной ишемии. Первая из них - модель лишения кислород-глюкозы (OGD) у мышей кортикостриала. Быстрая подготовка и передача срезов мозга в искусственную среду, обычно искусственную спинномозговую жидкость (ASCF), могут поддерживать жизнеспособность клеток и нейронную схему, что позволяет изучать функцию мозга in vitro 10 <Sup>, 11 . OGD в ASCF имитирует церебральную ишемию и индуцирует ишемическое повреждение 12 , 13 , 14 . После OGD срезы мозга обновляются в регулярном ASCF (r-ASCF), чтобы обеспечить реперфузию, а затем обработаны APC с использованием кислого ASCF, барботированного 20% CO 2 . Кортикостриальный срез сохраняет интактную гистологическую характеристику по сравнению с первичными культивируемыми клетками.

Для изучения функции мозга in vivo используется мышь средней мозговой артерии (MCAO). Средняя мозговая артерия блокируется вставкой мононити с пламенем через общую сонную артерию. В качестве одной из наиболее широко используемых моделей инсульта модель MCAO демонстрирует клиническую значимость, и применение мононити облегчает достижение реперфузии. Просто путем вдыхания нормального смешанного газа, содержащего 20% CO 2 после начала реперфузииN, APC продемонстрировал значительные защитные эффекты против церебральной ишемии, отмеченной уменьшенными объемами инфаркта головного мозга.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты были одобрены и проведены в соответствии с этическими принципами Комитета по экспериментальному эксперименту для животных в Чжэцзянском университете и полностью соответствовали Руководству Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Были предприняты усилия для сведения к минимуму любой боли или дискомфорта, и использовалось минимальное количество животных.

1. OGD кортикоспитальных срезов

  1. Подготовка раствора:
    1. Подготовить 1000 мл r-ACSF (124 ммоль / л, NaCl, 5 ммоль / л KCl, 1,25 ммоль / л KH 2 PO 4 , 2 ммоль / л MgSO 4 , 26 ммоль / л NaHCO 3 , 2 ммоль / л CaCl 2 , 10 ммоль / л глюкозы, конечный рН 7,4). Пузырь с 5% CO 2 и 95% O 2 в течение всего эксперимента.
    2. Подготовьте 200 мл без глюкозы ACSF (gf-ACSF), как указано выше, но исключая глюкозу, барботируют 5% СО 2 и 95% N 2 . Пузырьковые газы в течение 30 минут перед нанесением на brЧтобы уменьшить содержание кислорода в растворе. Продолжайте пузыриться до завершения процедуры OGD.
    3. Подготовьте кислотный ACSF (a-ACSF) путем уравновешивания 200 мл r-ACSF с 20% CO 2 и 80% O 2 . Пузырьковые газы в течение 30 минут перед нанесением на срезы головного мозга для снижения рН раствора до рН 6,8 и продолжения барботирования до завершения процедуры APC.
    4. Поместите три держателя ткани в r-ACSF, gf-ACSF, a-ACSF, соответственно.
  2. Подготовка ломтика головного мозга:
    Примечание. В этом исследовании использовались 8-недельные мышиные мыши C57Bl / 6J. Животных помещали под контролируемую температуру (22 ± 2 ° C), с 12-часовым периодом темно-темного цикла и доступом к гранулированным пищевым продуктам и воде.
    1. Пожертвуйте мышью с передозировкой изофлураном в индукционной камере. Обезглавить мышь. Рассеивайте мозг с помощью маленьких ножниц и щипцов. Удалите мозг тонким шпателем и осторожно опустите его в стеклянный стаканВыдерживая ледяную r-ACSF, уравновешенную 5% CO 2 и 95% O 2 .
      ПРИМЕЧАНИЕ. Эти шаги должны выполняться как можно быстрее, но тщательно.
    2. Держите мозг в ледяной r-ACSF в течение 5 мин. Отрегулируйте давление газа, чтобы избежать движения мозга.
    3. Поместите криопреципитат клей на пластину вибратора двумя полосками. Поместите кусок 3% агарозы на клейкую полоску от лезвия для поддержки мозга.
    4. Инвертируйте 10-сантиметровую чашку Петри на лед, а затем нанесите на тарелку фильтровальную бумагу. Смочите фильтровальную бумагу капли ледяного r-ACSF.
    5. Перенесите мозг в фильтровальную бумагу с помощью щипцов. Отрежьте лобный столб и мозжечок лезвием и щипцами.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Поперечные сечения должны быть как можно более гладкими и вертикальными по отношению к сагиттальной плоскости.
    6. Поместите оставшуюся ткань головного мозга вертикально на другую полоску клея и держите мозг, прислонившись к агарозе. Добавить ледяной r-ACSF в режущий резервуар доПогрузите мозг и добавьте лед в зону хранения льда. Держите r-ACSF в резервуаре, барботированном 5% CO 2 и 95% O 2 .
    7. Поднимите резервуар и отрегулируйте положение бритвы, чтобы поместить бритву как можно ближе к мозгу, а также чуть выше мозга.
    8. Выберите режим «CONT», чтобы разрезать секции мозга непрерывно. Установите толщину резания до 400 мкм, частота вибрации до 6 - 8 и скорость до 3 - 4. Нажмите кнопку «Пуск / Стоп», чтобы начать автоматическую резку.
    9. Отрежьте кончик 3-миллилитровой пипетки Пастера, чтобы сделать отверстие, соответствующее размеру срезов мозга.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Открытие должно быть достаточно большим, чтобы избежать дополнительного повреждения срезов мозга.
    10. Вырежьте пять кусочков мозга один за другим с помощью пипетки tip-cutPasteur и поместите их в держатель ткани в ледяной r-ACSF, барботированный 5% CO 2 и 95% O 2 . Не собирайте первый разрез. Отрегулируйте давление газа до avoiD движений срезов мозга.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Ломтики мозга не должны покрывать друг друга.
    11. Поместите срезы мозгов с r-ACSF при комнатной температуре в течение 30 минут, а затем при 37 ° C на водяной бане еще на 10 минут для восстановления синаптических функций.
  3. OGD и APC:
    1. Поместите gf-ACSF и a-ACSF в водяную баню с температурой 37 ° C и пузырьки буферов с соответствующими газами, как указано выше в 1.1.2 и 1.1.3, в течение 30 мин.
    2. Оставьте один срез в r-ACSF в качестве элемента управления. Перенесите остальные четыре среза мозга в держатель ткани с предварительно разогретым gf-ACSF и инкубируйте в течение 15 мин. Перенесите ломтики обратно в держатель ткани в r-ACSF для достижения реперфузии.
    3. Чтобы изучить временное окно APC, перенесите один срез непосредственно из gf-ACSF в a-ACSF. Сначала перенесите остальные три среза на r-ACSF, а затем перенесите два из них в держатель ткани в ACSF 5 и 15 мин после реперфузии соответственно.
    4. IncubatE два среза в a-ACSF в течение 3 минут, а затем переносите их обратно в r-ACSF. Инкубируйте три среза в r-ACSF еще 1 час. Установите остальные фрагменты в r-ACSF в качестве группы OGD.
    5. Для исследования ответа на дозу перенесите все четыре среза в держатель ткани в r-ACSF сначала после OGD и инкубируйте в течение 5 мин. Затем оставите один срез в r-ACSF в качестве группы OGD и перенесите остальные три среза в a-ACSF. Инкубируйте срезы в a-ACSF в течение 1, 3 и 5 минут соответственно, а затем передайте их обратно в r-ACSF. Инкубируйте три среза в r-ACSF еще 1 час.
  4. Определение жизнеспособности среза:
    1. Подготовьте 0,25% 2,3,5-трифенилтетразолия гидрохлорид (ТТК) нормальный физиологический раствор. Добавьте 1,25 г порошка ТТС в 500 мл нормального физиологического раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ. После полного растворения порошка перенесите раствор в 24-луночный планшет (500 мкл на лунку), покрытый фольгой, и храните его при 4 ° C. TTC и ткани, окрашенные TTC, являются светлымиsitive.
    2. Перенесите срезы в 24-луночный планшет (один срез на лунку), содержащий раствор ТТК, и растяните срез в растворе. Инкубируйте срезы в TTC-растворе при 37 ° C на мелководной бане в течение 30 мин.
    3. Перенесите ломтики в чистые 1,5 мл центрифужные пробирки, покрытые фольгой, и измерьте сухой вес ломтиков.
    4. Добавьте этанол / диметилсульфоксид (1: 1) в центрифужные пробирки (v: w = 10: 1) для извлечения формазана. Инкубируйте срезы в этаноле / диметилсульфоксиде при комнатной температуре вдали от света в течение 24 часов.
    5. Добавить все этанол / диметилсульфоксид в пробирки в 96-луночный планшет и измерить поглощение при 490 нм с помощью планшетного ридера.
    6. Нормализовать абсорбцию до сухого веса среза и выразить жизнеспособность как процент контрольного среза.

2. MCAO

  1. Приготовление:
    1. Дезинфицировать рабочее место, поверхность лазерного доплеровского FlowmetrY (LDF) и его принадлежности с 70% этиловым спиртом.
    2. Подготовьте автоклавные инструменты: две ножницы, 10 см; Два пинцета, 10 см; Один офтальмический щипчик, 11 см; Один микро-глазной ножницы, 9 см; Один зажим микрососуда, 1,8 см; Привод на оси, r 12,5 см; Несколько хирургических швов (△ 1/2 4 × 10); ватные палочки.
    3. Подготовьте шприц (без иглы) с солевым раствором для поддержания области гидратации.
    4. Подготовьте анестезирующий газ (100% O 2 + изофлуран).
  2. Обнаружение потока крови головного мозга:
    1. Настройте инструмент LDF.
    2. Инъекционные анальгетики внутрибрюшинно в мышь: метамизол 200 мг / кг, карпрофен 4 мг / кг и бупренорфин 0,1 мг / кг.
    3. Поместите мышь в индукционную камеру с 4% изофлураном в кислороде, чтобы обезболивать ее до тех пор, пока спонтанное движение тела и вибрации не прекратится.
    4. Поместите мышь в положение лежа с носом, вставленным вНосовой конус и поддерживать изофлуран на 1,5% для последующей процедуры.
    5. Приложите глазную мазь декспантенола на оба глаза.
    6. Дезинфицируйте голову 70% этилового спирта.
    7. Сделайте правильный парамедианный разрез кожи между глазами и ушами, используя скальпель, чтобы выставить бредгу.
    8. Протрите череп стерильным хлопком.
    9. Нанесите одну-две капли хирургического клея на поверхность черепа.
    10. Поместите наконечник волоконно-оптического зонда 5 мм хвостовым на брегму и 6 мм в поперечном направлении к средней линии.
    11. Начните запись потока крови на компьютерном программном обеспечении. Подождите, пока не будет достигнут стабильный исходный уровень кровотока, а затем нанесите 20 мкл катализатора на клей для фиксации зонда.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Идеальный базовый уровень должен быть более 500 флюсов.
    12. Если базовый уровень составляет менее 200 флюсов, аккуратно отрегулируйте положение, чтобы получить подходящую базовую линию. Держите зонд прикрепленным к черепу в течение всего эксперимента.
    13. Дезинфицируйте голову йодомС подключенным оптоволоконным зондом.
  3. MCAO:
    1. Поместите и зафиксируйте анестезированную мышь (с зондом LDF, прикрепленным к ее черепу) в положении лежа на спине и поддерживайте температуру тела, используя лампу накаливания во время операции. Дезинфицируйте шейку 70% этиловым спиртом.
    2. Сделать разрез кожи парамедиа в шею с помощью скальпеля; Тупые рассекают мягкие ткани щипцами, чтобы разоблачить сосуды. Добавьте одну каплю физиологического раствора в облученные ткани, чтобы поддерживать их влагой.
    3. Вырезать общую сонную артерию из окружающих тканей и блуждающего нерва с помощью офтальмологических щипцов. Будьте осторожны, чтобы не повредить блуждающий нерв. Продезинфицируйте кожу шеи снова иодофором после обнажения общей сонной артерии.
    4. Поместите зажим микрососуда на дистальный конец общей сонной артерии, а затем завяжите мертвый узел с 6-0 шелковыми швами на проксимальном конце. Поместите зажим как можно более проксимальным для последующих операций. Убедитесь, что длинаСосуд между зажимом и мертвым узлом как можно дольше для последующих операций.
    5. Сделайте временный шов, проксимальный к зажиму, связывая свободный узел. Убедитесь, что между двумя узлами достаточно места для вставки мононити.
    6. Сделайте небольшой продольный разрез между двумя узлами с помощью микроглазничных ножниц. Убедитесь, что разрез как можно ближе к мертвому узлу для последующих операций. Будьте осторожны, чтобы не отключить судно.
    7. Вставьте 12-миллиметровый мононити с затупленными концами через разрез, чтобы войти в просвет артерии и продвинуть его на несколько мм. Затяните свободный узел вокруг кончика мононити, а затем снимите зажим.
    8. Продвиньте нить во внутреннюю сонную артерию (10 мм, чтобы закрыть центральную мозговую артерию) с помощью офтальмологических щипцов, пока программное обеспечение LDF не продемонстрирует резкое снижение (> снижение на 80% от исходного кровотока) в кровотоке. Запишите время начала окклюзии.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Настройка прибора LDFОписанных в разделе 2.2.
    9. Закройте среднюю мозговую артерию в течение 1 часа. Отрежьте зонд LDF и поместите мышей в инкубатор 30 ° C на время окклюзии.
  4. Реперфузия и АПК:
    1. Повторно обезжирить животных изофлюраном, как описано выше, через 55 минут после начала окклюзии. Поместите и исправьте мышей в положении лежа на спине. Откройте шейный разрез и снова выпустите общую сонную артерию.
    2. Аккуратно вытащите нить с помощью офтальмологических щипцов после периода окклюзии для достижения реперфузии и превратите временный шов в постоянный, затянув узел.
    3. Для лечения ацидоза замените газ, вдыхаемый носовым конусом, на смесительные газы, содержащие 20% CO 2 , 20% O 2 и 60% N 2 в течение 5 минут при 5, 50 или 100 минут после реперфузии. Закройте разрез прерванным хирургическим швом.
    4. Поместите мышей в тепловую клетку 30 ° C, пока мыши не восстановят сознаниеА затем вернуть мышей для очистки отдельных клеток. Предоставьте мышам чашку Петри с водой и смоченной пищей. Следите за мышами после операции за чрезмерную боль и смерть.
  5. Измерение объема инфаркта головного мозга:
    1. Измерьте объем инфаркта головного мозга, используя окрашивание TTC через 24 часа после реперфузии.
    2. Подготовьте 0,25% раствор ТТК, как указано на этапе 1.4.1, до назначенного времени жертвоприношения. Перенесите раствор в 24-луночный планшет (1 мл на лунку), покрытый фольгой, и храните его при 4 ° C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: TTC и ткань, окрашенные TTC, чувствительны к свету.
    3. Через 24 ч после реперфузии принести в жертву животное с передозировкой изофлюраном в индукционной камере. Обезглавить мышей. Вырезайте мозг с помощью маленьких ножниц и щипцов. Изучите точки кровообращения на мозге, чтобы исключить мышей, которые подверглись субарахноидальному кровоизлиянию в Круге Уиллиса.
    4. Поместите мозг на чистый стеклянный предмет слайда на -20 ° ; Ледяной пакет. Поместите мозг и стекло в холодильник -20 ° C в течение 5 минут, чтобы мозг стал легче срезать.
    5. Выньте мозг и стеклянную ползунь от -20 ° C и положите их обратно на лед -20 ° C. Рассекайте лобный столб и мозжечок лезвием и щипцами.
    6. Нарезайте срезы мозга горизонтально до толщины 1 мм с помощью лезвия для производства 5 срезов. Перенесите срезы в 24-луночный планшет, содержащий раствор ТТК (1 срез на лунку) с помощью пинцета и растяните срезы в растворе. Инкубируйте срезы в TTC-растворе при 37 ° C на мелководной бане в течение 30 мин.
    7. Аспирируйте раствор ТТК. Добавить 10% формальдегид (1 мл на лунку) и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин. Поместите кусочки в том порядке, в котором они были разрезаны на листе целлофана, и отсканируйте сегменты в фотопленку.
    8. Проанализируйте размер инфаркта в процентах от всего среза мозга с помощью программного обеспечения для анализа изображений ImageJLass = "xref"> 8 на основе визуальной идентификации; См. Рис. 2 (слева).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В описанной выше модели срединной кортикостриотической области выживаемость кортикостриотической части количественно определяли методом ТТК через 1 ч после реперфузии. Конверсия ТТК рассчитывалась путем нормализации поглощения на 490 нм до контрольного среза. Согласно TTC-конверсии, APC защищен от OGD-индуцированного реперфузионного повреждения в начале и в зависимости от продолжительности. Детально, как 1, так и 3 мин обработки ацидозом значительно улучшали жизнеспособность через 5 мин после 15 мин OGD, тогда как 5 мин не было (OGD: 0,609 ± 0,029, 5/1: 0,758 ± 0,034, 5/3: 0,821 ± 0,041, 5/5: 0,672 ± 0,053, данные представлены как среднее ± SEM) ( рисунок 1 A ). Нейропротекция обработкой ацидозом оставалась защитной в течение 5 мин после реперфузии, тогда как 15 мин не было (OGD: 0,584 ± 0,044, 0/3: 0,762 ± 0,036, 5/3: 0,833 ± 0,062, 15/3: 0,627 ± 0,038) Рисунок 1 B ).

В модели MCAO через 5 минут после начала реперфузии через 5 мин после выздоровления, вызванного ишемическим оскорблением, было обнаружено 5 минут лечения ацидозом, что отразилось на небольших объемах инфаркта (MCAO: 33,4 ± 4,4%, 5/5: 16,6 ± 2,7%, 50 / 5: 19,5 ± 2,1%, 100/5: 37 ± 2,1%). Нейропротекция была по-прежнему устойчивой, даже когда начальное время было отложено до 50 мин после реперфузии. Однако лечение ацидозом, начатое через 100 мин, не блокировало ишемические повреждения ( рисунок 2 ).

Все данные были собраны и проанализированы вслепую. Данные представлены как среднее ± SEM. В модели кортикостриального среза каждая группа имеет 6-8 выборок. В модели MCAO каждая группа имеет 9 - 10 образцов. Для множественных сравнений применялся односторонний анализ дисперсии с наименьшей значимой разницей.


Рисунок 1 . APC защищает от OGD-индуцированной реперфузионной травмы в кортикостриалатных срезах. Кортикотратальные срезы обрабатывались ацидозом (рН 6,8) для указанных длительностей (A) и указывали периоды восстановления (B) после OGD. Жизнеспособность клеток оценивали по анализу 3- [4,5-диметилтиазол-2-ил] -2,5-дифенилтетразолия бромида через 24 ч после реперфузии, а жизнеспособность кортикостриозального среза определяли количественно путем анализа ТТК через 1 ч после реперфузии. Значения показывают среднее значение ± SEM. N = 6 - 8 для каждой группы; * P <0,05 и ** p <0,01 в одностороннем анализе дисперсии; R, реперфузия. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

"Рисунок Рисунок 2 . APC защищает от MCAO-индуцированной травмы у мышей. Животных подвергали 60 мин MCAO и обрабатывали путем вдыхания 20% CO2 в течение 5 мин при 5, 50 или 100 мин после реперфузии. Объем инфаркта определяли количественно окрашиванием гидрохлоридом 2,3,5-трифенилтетразолия через 24 часа после реперфузии (обозначено черной пунктирной линией на левой панели). Значения показывают среднее значение ± SEM. N = 8 - 10 для каждой группы; * P <0,05 и ** p <0,01 в одностороннем анализе дисперсии; R, реперфузия. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы представляем две экспериментальные модели для изучения нейропротекции АРС против церебральной ишемии. В срезах головного мозга APC достигается путем инкубации мышей кортикостриальных срезов в кислом буфере, барботированном 20% CO 2 после начала реперфузии, тогда как в модели MCAO APC достигается путем вдыхания 20% CO 2 мышам после реперфузии. Обе модели отражают нейропротекцию АРС против церебральной ишемии. Защита была сопоставима с той, которая достигалась при ишемическом постусловии, но с более широким временным окном. В модели MCAO временное окно может составлять до 50 минут после реперфузии по сравнению с 10 мин для ишемического посткондиционирования 15 . Кроме того, процедура APC проще и безопаснее.

В модели кортико-стригальных ломтиков нежные и быстрые операции имеют решающее значение для обеспечения жизнеспособности срезов мозга в максимальной степени. Для работы MCAO мониторинг мозгового кровотокаНеобходимо, и необходимо наблюдать резкое снижение кровотока, чтобы обеспечить окклюзию средней мозговой артерии. После того, как мозг был расчленен для окрашивания ТТК, тщательное исследование мозга необходимо для исключения субарахноидального кровоизлияния.

Расширение и продолжительность ацидоза имеют решающее значение для достижения нейропротекции АПК. Длительная продолжительность лечения ацидозом не выгодна в модели кортикостриотических срезов ( рисунок 1 A ). Кроме того, наши предыдущие исследования показали , что как 10% и 20% СО 2 ингаляции, а не 30% СО 2 ингаляции придают нейропротекции на мышах 8. Это указывает на то, что мягкий ацидоз имеет решающее значение для нейропротекции АРС, и поэтому концентрация СО 2 и продолжительность АРС незаменимы для нейрозащиты ацидоза.

В дополнение к окрашиванию ТТС многие методы могут быть объединены сУдовлетворяя разнообразные исследовательские потребности. Например, внеклеточная электрическая запись может быть добавлена ​​к заключительному этапу, чтобы наблюдать, как ишемия и ацидоз влияют на нейронный потенциал 16 . Перфузионное решение среза мозга можно также собирать для измерения изменения концентрации аминокислотных нейротрансмиттеров после АРС с помощью ВЭЖХ 17 . Ломтики определенных областей мозга могут быть подготовлены для изучения ответов конкретной области на ишемию и APC. В целом, многие альтернативы могут быть введены для освещения последствий ишемии и ацидоза.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа финансировалась Национальным фондом естественных наук Китая (81573406, 81373393, 81273506, 81221003, 81473186 и 81402907), Фондом естественных наук провинции Чжэцзян (LR15H310001) и Программой для ведущей команды инновационной команды S & T в Чжэцзяне (2011R50014).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Sigma S5886
Potassium chloride Sigma P5405
Potassium phosphate monobasic Sigma P9791
Magnesium sulfate Sigma M2643
Sodium bicarbonate Sigma S5761
Calcium chloride dihydrate Sigma C5080
D-(+)-Glucose Sigma G7021
Vibratome Leica VT1000 S
2,3,5-triphenyltetrazolium hydrochloride Sigma T8877
Absolute Ethanol Aladdin Industrial Corporation E111993
Dimethyl sulfoxide Sigma D8418
Laser Doppler Flowmetry Moor Instruments Ltd Model Moor VMS-LDF2
Diethyl ether anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Corporation 80059618
Trichloroacetaldehycle hydrate Sinopharm Chemical Reagent Corporation 30037517
10% Formalin Aladdin Industrial Corporation F111936
24-well plates Jet Biofil TCP-010-024

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhao, H., Sapolsky, R. M., Steinberg, G. K. Interrupting reperfusion as a stroke therapy: ischemic postconditioning reduces infarct size after focal ischemia in rats. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (9), 1114-1121 (2006).
  2. Leconte, C., et al. Delayed hypoxic postconditioning protects against cerebral ischemia in the mouse. Stroke. 40 (10), 3349-3355 (2009).
  3. Fan, Y. Y., et al. Transient lack of glucose but not O2 is involved in ischemic postconditioning-induced neuroprotection. CNS Neurosci Ther. 19 (1), 30-37 (2013).
  4. Hess, D. C., Hoda, M. N., Bhatia, K. Remote limb perconditioning [corrected] and postconditioning: will it translate into a promising treatment for acute stroke. Stroke. 44 (4), 1191-1197 (2013).
  5. Ren, C., Yan, Z., Wei, D., Gao, X., Chen, X., Zhao, H. Limb remote ischemic postconditioning protects against focal ischemia in rats. Brain Res. 1288, 88-94 (2009).
  6. Sun, J., et al. Protective effect of delayed remote limb ischemic postconditioning: role of mitochondrial K(ATP) channels in a rat model of focal cerebral ischemic reperfusion injury. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (5), 851-859 (2012).
  7. Li, P., et al. Remote limb ischemic postconditioning protects mouse brain against cerebral ischemia/reperfusion injury via upregulating expression of Nrf2, HO-1 and NQO-1 in mice. Int J Neurosci. , 1-8 (2015).
  8. Fan, Y. Y., et al. A novel neuroprotective strategy for ischemic stroke: transient mild acidosis treatment by CO2 inhalation at reperfusion. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (2), 275-283 (2014).
  9. Shen, Z., et al. PARK2-dependent mitophagy induced by acidic postconditioning protects against focal cerebral ischemia and extends the reperfusion window. Autophagy. 0, (2017).
  10. Skolnik, J., Takacs, L., Szende, E. In vitro oxygen consumption of slices from kidney, brain, cortex and liver in hypoxia. Nature. 209 (5020), 305 (1966).
  11. Lynch, G., Schubert, P. The use of in vitro. brain slices for multidisciplinary studies of synaptic function. Annu Rev Neurosci. 3, 1-22 (1980).
  12. Zheng, S., Zuo, Z. Isoflurane preconditioning reduces purkinje cell death in an in vitro model of rat cerebellar ischemia. Neuroscience. 118 (1), 99-106 (2003).
  13. Yin, B., Barrionuevo, G., Weber, S. G. Optimized real-time monitoring of glutathione redox status in single pyramidal neurons in organotypic hippocampal slices during oxygen-glucose deprivation and reperfusion. ACS Chem Neurosci. 6 (11), 1838-1848 (2015).
  14. Medvedeva, Y. V., Ji, S., Yin, H. Z., Weiss, J. H. Differential vulnerability of CA1 vs CA3 pyramidal neurons after ischemia: possible relationship to sources of Zn2+ accumulation and its entry into and prolonged effects on mitochondria. J Neurosci. , (2016).
  15. Pignataro, G., et al. In vivo and in vitro characterization of a novel neuroprotective strategy for stroke: ischemic postconditioning. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (2), 232-241 (2008).
  16. Zhang, X., Ding, H. Z., Jiang, S., Zeng, Y. M., Tang, Q. F. An in vitro study of the neuroprotective effect of propofol on hypoxic hippocampal slice. Brain Inj. 28 (13-14), 1758-1765 (2014).
  17. Niu, Y., et al. Chemical profiling with HPLC-FTMS of exogenous and endogenous chemicals susceptible to the administration of chotosan in an animal model of type 2 diabetes-induced dementia. J Pharm Biomed Anal. 104, 21-30 (2015).

Tags

Нейробиология выпуск 125 церебральная ишемия кислотное посткондиционирование кортикостриальный срез лихорадка кислород-глюкоза окклюзия средней мозговой артерии (MCAO) объем инфаркта головного мозга временное окно
Экспериментальные модели для изучения нейропротекции кислотного посткондиционирования против церебральной ишемии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zheng, Y., Shen, Z., Wu, X., Jiang,… More

Zheng, Y., Shen, Z., Wu, X., Jiang, L., Hu, W., Chen, Z., Zhang, X. Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia. J. Vis. Exp. (125), e55931, doi:10.3791/55931 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter