Summary
Syran efterkonditionering skyddar mot cerebral ischemi. Här presenterar vi två modeller för att utföra APC. De är respektive uppnås genom att överföra corticostriatal skivor till sur buffert efter syre-glukos deprivation in vitro och genom att andas in 20% CO 2 efter mellersta hjärnartären ocklusion in vivo.
Abstract
Stroke är en av de främsta orsakerna till dödlighet och funktionshinder världen över, med begränsade terapeutiska förhållningssätt. Som en endogen strategi för neuroprotektion har efterbehandlingsbehandlingar visat sig vara lovande terapier mot cerebral ischemi. Emellertid begränsar komplicerade procedurer och potentiella säkerhetsproblem deras kliniska tillämpning. För att övervinna dessa nackdelar har vi utvecklat sur postconditioning (APC) som en terapi för experimentell fokal cerebral ischemi. APC hänför sig till den milda acidosbehandlingen genom inhalation av CO 2 under reperfusion efter ischemi. Här presenterar vi två modeller för att utföra APC in vitro respektive in vivo . Syre-glukosavskrivning (OGD) -behandling av möss och corticostriatal ocklusion och mitten av cerebral arteriell ocklusion (MCAO) hos möss användes för att efterlikna cerebral ischemi. APC kan enkelt uppnås genom att överföra hjärnsnitt till sur buffert bubblades med 20% CO 2, or av möss som inhalerar 20% CO 2. APC visade signifikanta skyddande effekter mot cerebral ischemi, vilket återspeglas av vävnadslevnadsförmåga och hjärninfarktvolymen.
Introduction
Stroke är en av de främsta orsakerna till dödlighet och funktionshinder över hela världen. Stora ansträngningar har gjorts för att hitta effektiva behandlingar för stroke under de senaste decennierna, men prestationen är ganska otillfredsställande. Postkonditionering är en process som manipuleras av subtoxiska påfrestningar efter en ischemisk episod. Efterkonditionering, inklusive ischemisk, hypoxisk, lågglukos och avlägsen ischemisk efterkonditionering, utlöser endogena adaptiva mekanismer och har visat sig vara lovande behandlingar mot cerebral ischemi 1 , 2 , 3 , 4 . Men iskemisk efterkonditionering kan införa ytterligare skada. Limkemisk avlägsnande av ischemisk efterkonditionering behöver vanligtvis flera cykler om 5-20 min ocklusion och reperfusion på de ipsilaterala eller bilaterala bakbenen 5 , 6 , 7 . thDärför är dessa efterbehandlingsmanipulationer farliga eller opraktiska i klinisk praxis. För att övervinna dessa nackdelar har vi utvecklat APC som en terapi för fokal cerebral ischemi hos möss 8 . Inducerad helt enkelt genom att andas in 20% CO 2, APC signifikant reducerar ischemisk hjärnskada i en mer genomförbar och säkrare sätt. Nyligen har vi visat att APC utökar reperfusionsfönstret och belyser APC: s betydelse för strokebehandling 9 .
Här presenterar vi två experimentella modeller för att studera neuroprotektion av APC mot cerebral ischemi. Den första är syre-glukosavskrivning (OGD) -modellen i kort-sterostabila stycken av möss. Snabba förberedelser och överföring av hjärnskivorna till en artificiell miljö, vanligtvis artificiell cerebrospinalvätska (ASCF), kan upprätthålla celllabilitet och neuronal krets, vilket gör det möjligt att studera hjärnfunktionen in vitro 10 <Sup> 11 . OGD i ASCF efterliknar cerebral ischemi och inducerar ischemisk skada 12 , 13 , 14 . Efter OGD är hjärnan skivor uppdateras i regelbunden ASCF (r-ASCF) för att tillhandahålla reperfusion och behandlades därefter med APC med användning av sur ASCF bubblades med 20% CO2. Den kortikostriatala skivan upprätthåller den intakta histologiska karakteriseringen jämfört med primära odlade celler.
För att studera hjärnfunktionen in vivo används musen mellan mitten av cerebral arteriell ocklusion (MCAO). Den centrala cerebrala artären blockeras genom att införa ett flamstoppat monofilament via den gemensamma halspulsådern. Som en av de mest använda stroke-modellerna visar MCAO-modellen klinisk relevans och appliceringen av en monofilament gör det lättare att uppnå reperfusion. Helt enkelt genom att andas in normoxisk blandad gas innehållande 20% CO 2 efter debuten av reperfusioN, visade APC signifikanta skyddande effekter mot cerebral ischemi som indikeras av minskad hjärntrådsvolym.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment godkändes av och genomfördes i enlighet med de etiska riktlinjerna från Zhejiang University Animal Experimentation Committee och var i fullständig överensstämmelse med National Institutes of Health Guide för vård och användning av laboratoriedjur. Åtgärder gjordes för att minimera eventuell smärta eller obehag och det minsta antalet djur användes.
1. OGD av kortikostriatala skivor
- Lösningsberedning:
- Förbereda 1000 ml r-ACSF (124 mmol / l, NaCl, 5 mmol / L KCl, 1,25 mmol / L KH 2 PO 4, 2 mmol / l MgSO 4, 26 mmol / L NaHCOj 3, 2 mmol / l CaCI2, 10 mmol / 1 glukos, slutligt pH 7,4). Bubbla med 5% CO2 och 95% O 2 genom hela experimentet.
- Förbereda 200 ml glukosfritt ACSF (gf-ACSF) som ovan men med undantag för glukos, bubblades med 5% CO2 och 95% N2. Bubbla gaserna i 30 minuter innan de appliceras på brSkivor för att minska syrehalten i lösningen. Fortsätt bubbla tills OGD-proceduren är klar.
- Förbereda sura ACSF (a-ACSF) genom ekvilibrering 200 ml r-ACSF med 20% CO 2 och 80% O 2. Bubbla gaserna i 30 minuter innan de appliceras på hjärnskivor för att minska pH-värdet till pH 6,8 och fortsätt bubbla tills APC-proceduren är klar.
- Placera tre vävnadshållare i r-ACSF resp. Gf-ACSF, a-ACSF.
- Hjärnskiva förberedelse:
Anm .: 8 veckor gamla, manliga C57Bl / 6J möss användes i denna studie. Djurna hölls under kontrollerad temperatur (22 ± 2 ° C), med en 12 timmar lång mörk cykelperiod och tillgång till pelleterad mat och vatten.- Uppoffera en mus med en isofluranöverdos i en induktionskammare. Dekapitera musen. Utsöndra hjärnan med hjälp av små saxar och tångar. Ta bort hjärnan med en tunn spatel och släpp försiktigt in i en glasbägarelande iskall r-ACSF ekvilibrerad med 5% CO2 och 95% O 2.
OBS! Dessa steg ska göras så snabbt men noggrant som möjligt. - Håll hjärnan i iskall r-ACSF i 5 minuter. Justera gastrycket för att undvika rörelser i hjärnan.
- Placera cryoprecipitate lim på vibratomplattan i två remsor. Sätt en bit av 3% agaros på limremsan bort från bladet för att stödja hjärnan.
- Invertera en 10 cm petriskål på is och sätt sedan ett filterpapper på disken. Fukt filterpapperet med droppar iskallt r-ACSF.
- Överför hjärnan till filterpappret med tångar. Klipp av främre polen och hjärnbenet med blad och tångar.
OBS: Tvärsnittet ska vara så smidigt som möjligt och vertikalt till sagittalplan. - Placera den återstående hjärnvävnaden vertikalt på den andra limremsan och håll hjärnan lutad mot agarosen. Tillsätt iskall r-ACSF till skärningsreservoaren tillNedsänk hjärnan och lägg is till ishållareområdet. Hålla r-ACSF i reservoaren bubblades med 5% CO2 och 95% O 2.
- Lyft upp behållaren och justera rakhyvelns läge för att placera rakhyvel så nära hjärnan som möjligt och strax ovanför hjärnan.
- Välj "CONT" -läget för att skära hjärnavsnitten kontinuerligt. Ställ skärstycket till 400 μm, vibrationsfrekvensen till 6-8 och hastigheten till 3 - 4. Tryck på "start / stop" -knappen för att starta automatisk skärning.
- Skär av toppen av en 3 ml Pasteur pipette för att skapa en öppning som matchar storleken på hjärnskivorna.
OBS! Öppningen ska vara tillräckligt stor för att undvika ytterligare skador på hjärnskivorna. - Dra ut fem hjärnsnitt en efter en med spetsen-cutPasteur pipett och placera dem in i vävnaden hållaren i iskall r-ACSF bubblades med 5% CO2 och 95% O 2. Samla inte in den första skivan som produceras. Justera gastrycket till avoiD rörelser av hjärnskivorna.
OBS! Hjärnskivorna borde inte täcka varandra. - Placera hjärnskivor med r-ACSF vid rumstemperatur i 30 minuter och sedan vid 37 ° C i ett vattenbad under ytterligare 10 minuter för att återvinna synaptiska funktioner.
- Uppoffera en mus med en isofluranöverdos i en induktionskammare. Dekapitera musen. Utsöndra hjärnan med hjälp av små saxar och tångar. Ta bort hjärnan med en tunn spatel och släpp försiktigt in i en glasbägarelande iskall r-ACSF ekvilibrerad med 5% CO2 och 95% O 2.
- OGD och APC:
- Placera gf-ACSF och a-ACSF i ett 37 ° C vattenbad och bubbla buffertarna med motsvarande gaser enligt ovan i 1.1.2 och 1.1.3 under 30 minuter.
- Lämna en skiva i r-ACSF som en kontroll. Överför de övriga fyra hjärnskivorna i vävnadshållaren med förvärmd gf-ACSF noga och inkubera i 15 minuter. Överför skivorna tillbaka i vävnadshållaren i r-ACSF för att uppnå reperfusion.
- För att studera APC: s tidsfönster, överför en skiva direkt från gf-ACSF till a-ACSF. Överför de övriga tre skivorna till r-ACSF först och sedan överföra två av dem till vävnadshållaren i a-ACSF 5 och 15 minuter efter reperfusion.
- IncubatE de två skivorna i a-ACSF i 3 minuter och sedan överföra dem tillbaka till r-ACSF. Inkubera de tre skivorna i r-ACSF under ytterligare 1 timme. Ställ in resterande skivor i r-ACSF som OGD-gruppen.
- För en dosresponsstudie, överför alla fyra skivorna till vävnadshållaren i r-ACSF först efter OGD och inkubera i 5 minuter. Lämna sedan en skiva i r-ACSF som OGD-gruppen och överför de övriga tre skivorna till a-ACSF. Inkubera skivorna i a-ACSF för respektive 1, 3 och 5 minuter och överför dem sedan tillbaka till r-ACSF. Inkubera de tre skivorna i r-ACSF under ytterligare 1 timme.
- Slice viability bestämning:
- Förbered 0,25% 2,3,5-trifenyltetrazoliumhydroklorid (TTC) normal saltlösning. Tillsätt 1,25 g TTC-pulver till 500 ml normal saltlösning.
OBS! När pulvret är helt upplöst, överför lösningen till en 24-brunnsplatta (500 μl per brunn) täckt i folie och förvara den vid 4 ° C. TTC och vävnad färgad med TTC är ljus sensitive. - Överför skivorna till en 24-brunnsplatta (en skiva per brunn) innehållande TTC-lösning och sträck ut skivan i lösningen. Inkubera skivorna i TTC-lösning vid 37 ° C i ett grunt vattenbad under 30 minuter.
- Överför skivorna till rena 1,5 ml centrifugrör i folie och mäta skivans torrvikt.
- Tillsätt etanol / dimetylsulfoxid (1: 1) i centrifugrören (v: w = 10: 1) för att extrahera formazan. Inkubera skivorna i etanol / dimetylsulfoxid vid rumstemperatur bort från ljus i 24 timmar.
- Tillsätt all etanol / dimetylsulfoxid i rören i en 96-brunnsplatta och mät absorbansen vid 490 nm med en plåtläsare.
- Normalisera absorbansen till skivans torrvikt och uttrycka viabilitet som procentandel av kontrollskivan.
- Förbered 0,25% 2,3,5-trifenyltetrazoliumhydroklorid (TTC) normal saltlösning. Tillsätt 1,25 g TTC-pulver till 500 ml normal saltlösning.
2. MCAO
- Förberedelse:
- Desinficera arbetsbänken, ytan på Laser Doppler FlowmetrY (LDF) instrument och dess tillbehör med 70% etylalkohol.
- Förbereda autoklaverade instrument: två saxar, 10 cm; Två tångar, 10 cm; En oftalmisk tång, 11 cm; En mikro oftalmisk sax, 9 cm; En microvesselklämma, 1,8 cm; Oneneedle drive, r 12,5 cm; Flera kirurgiska suturer (△ 1/2 4 × 10); Bomullspinne.
- Förbered en spruta (utan nål) med saltlösning för att upprätthålla ett hydratiserat arbetsområde.
- Förbereda anestesigas (100% O 2 + isofluran).
- Detektion av hjärnblodflöde:
- Ställ in LDF-instrumentet.
- Injicera analgetika intraperitonealt in i musen: metamizol 200 mg / kg, carprofen 4 mg / kg och buprenorfin 0,1 mg / kg.
- Placera musen i en induktionskammare med 4% isofluran i syre för att bedöva den tills spontan rörelse av kropp och vibrationer stannar.
- Placera musen i ett benäget läge med näsan monterad i thE-näskon och behålla isofluran vid 1,5% för den efterföljande proceduren.
- Applicera dexpanthenol ögonsalva på båda ögonen.
- Desinficera huvudet med 70% etylalkohol.
- Gör en rätt paramedian hud snitt mellan ögon och öron med en skalpell för att avslöja bregma.
- Gnida skalle med steril bomull.
- Applicera en till två droppar kirurgiskt lim till ytan på skallen.
- Placera spetsen av fiberoptisk sond 5 mm caudal till bregma och 6 mm lateral till mittlinjen.
- Börja spela in blodflödet på datorprogrammet. Vänta tills en stabil blodflödesbaslinje inträffar och applicera sedan en 20 μl katalysator på limet för att fixera sonden.
OBS! En ideal baslinje ska vara mer än 500 flöde. - Om baslinjen är mindre än 200 flöde, justera läget fint för att få en lämplig baslinje. Håll sonden fäst vid skallen under försöksperioden.
- Desinficera huvudet med jodophor afNär den fiberoptiska sonden är fäst.
- MCAO:
- Placera och fixa den bedövade musen (med LDF-sond som är fäst vid dess skalle) i en bakre position och behåll kroppstemperaturen med hjälp av en värmelampa genom hela operationen. Desinficera halsen med 70% etylalkohol.
- Gör en paramedian hud snitt i nacken med en skalpell; Stumma dissekera mjuka vävnader med tång för att exponera kärl. Tillsätt en droppe saltlösning till de exponerade vävnaderna för att hålla demhydrerade.
- Dissektera den gemensamma halspulsådern från omgivande vävnad och vagusnerven med hjälp av oftalmiska pincett. Var försiktig så att du inte skadar vagusnerven. Desinficera huden på nacken igen med jodofor efter att den vanliga halspulsådern är utsatt.
- Placera en microvesselklämma vid den distala änden av den gemensamma halspulsådern och bind sedan en död knut med 6-0 silkesuturer vid den proximala änden. Placera klämman så proximal som möjligt för efterföljande operationer. Se till att längden påKärlet mellan klämman och den döda knuten är så lång som möjligt för efterföljande operationer.
- Gör en tillfällig sutur proximal i klämman genom att binda en lös knut. Se till att det finns tillräckligt med utrymme mellan två knop för monofilamentinsättning.
- Gör ett litet snitt mellan de två knutarna med mikro ögonhålan. Se till att snitten är så nära den döda knuten som möjligt för efterföljande operationer. Var försiktig så att du inte skär av fartyget.
- Sätt in en 12 mm spetsformad monofilament genom snittet för att komma in i artärlumenet och förflytta det några mm. Dra åt den lösa knuten runt monofilamentets spets och ta bort klämman.
- Förflytta filamentet till den inre halspulsådern (10 mm för att tillsluta den centrala cerebrala artären) med oftalmiska pincett tills LDF-mjukvaran visar en kraftig nedgång (> 80% reduktion från blodflödet i blodet) i blodflödet. Spela in starttiden för ocklusion.
OBS! LDF-instrumentinställningen ärBeskrivs i avsnitt 2.2. - Undvik den centrala cerebrala artären i 1 timme. Skär av LDF-sonden och sätt musen i en 30 ° C inkubator under ocklusionstiden.
- Reperfusion och APC:
- Ombedöda djuren med isofluran som beskrivits ovan 55 min efter början av ocklusion. Placera och fixa möss i en bakre position. Öppna nackens snitt och exponera den gemensamma halspulsådern.
- Dra försiktigt ut filamentet med oftalmiska tångar efter ocklusionstiden för att uppnå reperfusion och vrid den temporära suturen till en permanent genom att dra åt knutten.
- För acidos behandling, ändra gasen inandas av noskonen till blandningsgaser innehållande 20% CO 2, 20% O2 och 60% N2 under 5 min vid 5, 50, eller 100 minuter efter reperfusion. Stäng snittet med en avbruten kirurgisk sutur.
- Placera möss i en 30 ° C värmekorg tills möss återvinner medvetandetOch sedan återvända mössen för att rengöra, enskilda burar. Ge möss med en petriskål med vatten och fuktig mat. Övervaka mössen noga efter operationen för överdriven smärta och död.
- Brain Infarct volymmätning:
- Mät hjärninfarktvolymen genom att använda TTC-färgning 24 timmar efter reperfusion.
- Förbered 0,25% TTC-lösning som nämnts i steg 1.4.1 före den angivna tiden för offret. Överför lösningen till en 24-brunnsplatta (1 ml per brunn) i folie och förvara den vid 4 ° C.
OBS: TTC och vävnad färgad med TTC är ljuskänsliga. - Efter 24 timmar efter reperfusion, uppoffera djuret med en isofluranöverdos i en induktionskammare. Dekapitera mössen. Dissektera hjärnorna med hjälp av små saxar och tångar. Undersök blodpunkter på hjärnorna för att utesluta de möss som genomgick subaraknoidblödning vid Willis Circle.
- Placera hjärnan på en ren glasskiva på -20 ° ; C ispack. Placera hjärnan och glasskivan i ett kylskåp på -20 ° C i 5 minuter för att göra hjärnan lättare att skära.
- Ta ut hjärnan och glasrutan från -20 ° C och sätt tillbaka dem på -20 ° C ispacken. Dissektera främre polen och hjärnbenet med blad och pincett.
- Skär hjärnavsnitten horisontellt till en 1 mm tjocklek med ett blad för att producera 5 skivor. Överför skivorna till 24-brunnsplattan med TTC-lösning (1 skiva per brunn) med pincett och sträck ut skivorna i lösningen. Inkubera skivorna i TTC-lösning vid 37 ° C i ett grunt vattenbad under 30 minuter.
- Aspirera TTC-lösningen. Tillsätt 10% formaldehyd (1 ml per brunn) och inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter. Placera skivorna i den ordning i vilken de skars på ett cellofanark och skanna segmenten i fotografisk plattaimager.
- Analysera infarktstorleken som en procentandel av hela hjärnskivan med hjälp av ImageJ analysprogramLass = "xref"> 8 baserat på visuell identifiering; Se figur 2 (vänster).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den kortikostriatala skivmodellen beskriven ovan kvantifierades corticostriatal skivbarbarhet genom TTC-analys vid 1 h efter reperfusion. TTC-omvandling beräknades genom normalisering av absorptionen vid 490 nm till kontrollskivan. Enligt TTC-omvandling skyddades APC mot OGD-inducerad reperfusionsskada vid en starttid och varaktighetsberoende sätt. I detalj förbättrade både 1 och 3 min acidosebehandling signifikant livskraften vid 5 min efter 15 min OGD, medan 5 min inte (OGD: 0,609 ± 0,029, 5/1: 0,758 ± 0,034, 5/3: 0,821 ± 0,041, 5/5: 0,672 ± 0,053, data rapporterad som medelvärde ± SEM) ( Figur 1 A ). Neuroprotektion med hjälp av acidosebehandlingen förblev skyddande inom 5 min efter reperfusion, medan 15 minuter inte (OGD: 0,584 ± 0,044, 0/3: 0,762 ± 0,036, 5/3: 0,833 ± 0,062, 15/3: 0,627 ± 0,038) ( Figur 1 B ).
I MCAO-modellen initierades 5 min acidosebehandling vid 5 min efter återupptagning av räddad celldöd orsakad av ischemisk förolämpning, reflekterad av mindre infarktvolymer (MCAO: 33,4 ± 4,4%, 5/5: 16,6 ± 2,7%, 50 / 5: 19,5 ± 2,1%, 100/5: 37 ± 2,1%). Neuroprotektionen var fortfarande robust, även när starttiden fördröjdes till 50 min efter reperfusion. Acidosebehandling initierad vid 100 min blockerade emellertid inte de ischemiska skadorna ( Figur 2 ).
Alla data samlades och analyserades på ett blint sätt. Data presenteras som medelvärde ± SEM. I den kortikostriatala skivmodellen har varje grupp 6-8 prover. I MCAO-modellen har varje grupp 9-10 prov. Envägsanalys av varians med minst signifikant skillnad tillämpades för flera jämförelser.
Figur 1 . APC skyddar mot OGD-inducerad repfusionskada i kortikostriatala skivor. Kortikostriatala skivor behandlades med acidos (pH 6,8) för indikerade varaktigheter (A) och indikerade återhämtningsperioder (B) efter OGD. Celllevarabiliteten bedömdes genom 3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5-difenyltetrazoliumbromidanalysen vid 24 h efter reperfusion och corticostriatal skivbarbarhet kvantifierades genom TTC-analys vid 1 h efter reperfusion. Värdena visar medelvärdet ± SEM. N = 6-8 för varje grupp; * P <0,05 och ** p <0,01 genom envägsanalys av varians; R, reperfusion. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2 . APC skyddar mot MCAO-inducerad skada hos möss. Djur utsattes för 60 min MCAO och behandlades genom inhalering av 20% CO2 i 5 minuter vid 5, 50 eller 100 minuter efter reperfusion. Infarctvolymen kvantifierades genom 2,3,5-trifenyltetrazoliumhydrokloridfärgning vid 24 h efter reperfusion (indikerad med svart streckad linje på vänster panel). Värdena visar medelvärdet ± SEM. N = 8 - 10 för varje grupp; * P <0,05 och ** p <0,01 genom envägsanalys av varians; R, reperfusion. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi två experimentella modeller för att studera neuroprotektion av APC mot cerebral ischemi. I hjärnsnitt, är APC uppnås genom inkubering av möss corticostriatal skivor i sur buffert bubblades med 20% CO 2 efter reperfusion insjuknandet, medan i MCAO modell, är APC uppnås genom att andas in 20% CO 2 till möss efter reperfusion. Båda modellerna återspeglar neuroprotektion av APC mot cerebral ischemi. Skyddet var jämförbart med det som uppnåddes genom ischemisk efterkonditionering men med ett större tidsfönster. I MCAO-modellen kan tidsfönstret vara så länge som 50 min efter reperfusion jämfört med 10 min för ischemisk efterkonditionering 15 . Dessutom är proceduren för APC lättare och säkrare.
I kortikostriatala skivmodellen är snabba och snabba operationer avgörande för att garantera livskvaliteten hos hjärnskivor i största möjliga utsträckning. För MCAO-prestanda är den cerebrala blodflödesövervakningenKrävs, och den kraftiga nedgången i blodflödet måste observeras för att säkerställa ocklusion av mellanskärnartären. Efter att hjärnorna dissekerades för TTC-färgning är en noggrann undersökning av hjärnorna nödvändig för att utesluta subaraknoidblödning.
Förlängningen och varaktigheten av acidos är kritiska för att uppnå neuroprotektion av APC. Långvarig behandling med acidos är inte fördelaktig i kortikostriatala skivmodeller ( Figur 1 A ). Dessutom visade vår tidigare studie att både 10% och 20% CO 2 inandning, snarare än 30% CO 2 inandning ge neuroprotektion på möss 8. Dessa föreslår mild acidos är avgörande för neuroprotektion av APC, och således är koncentrationen av CO 2 och varaktigheten av APC oumbärlig för acidosneuroprotektion.
Förutom TTC-färgning kan många tekniker kombineras till sÅtgärda mångsidiga forskningsbehov. Till exempel kan extracellulär elektrisk inspelning läggas till sista steget för att observera hur ischemi och acidos påverkar nervpotentialen 16 . Perfusionslösningen av hjärnskiva kan också samlas för att mäta koncentrationsförändringen av aminosyra-neurotransmittorer efter APC genom HPLC 17 . Skivor av vissa hjärnregioner kan vara beredda att studera svaren från ett visst område till ischemi och APC. Sammantaget kan många alternativ införas för att belysa effekterna av ischemi och acidos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av National Natural Science Foundation of China (81573406, 81373393, 81273506, 81221003, 81473186 och 81402907), Zhejiang Provincial Natural Science Foundation (LR15H310001) och programmet för Zhejiang ledande team i S & T Innovation Team (2011R50014).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Magnesium sulfate | Sigma | M2643 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C5080 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
| Vibratome | Leica | VT1000 S | |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium hydrochloride | Sigma | T8877 | |
| Absolute Ethanol | Aladdin Industrial Corporation | E111993 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Laser Doppler Flowmetry | Moor Instruments Ltd | Model Moor VMS-LDF2 | |
| Diethyl ether anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Corporation | 80059618 | |
| Trichloroacetaldehycle hydrate | Sinopharm Chemical Reagent Corporation | 30037517 | |
| 10% Formalin | Aladdin Industrial Corporation | F111936 | |
| 24-well plates | Jet Biofil | TCP-010-024 |
References
- Zhao, H., Sapolsky, R. M., Steinberg, G. K. Interrupting reperfusion as a stroke therapy: ischemic postconditioning reduces infarct size after focal ischemia in rats. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (9), 1114-1121 (2006).
- Leconte, C., et al. Delayed hypoxic postconditioning protects against cerebral ischemia in the mouse. Stroke. 40 (10), 3349-3355 (2009).
- Fan, Y. Y., et al. Transient lack of glucose but not O2 is involved in ischemic postconditioning-induced neuroprotection. CNS Neurosci Ther. 19 (1), 30-37 (2013).
- Hess, D. C., Hoda, M. N., Bhatia, K. Remote limb perconditioning [corrected] and postconditioning: will it translate into a promising treatment for acute stroke. Stroke. 44 (4), 1191-1197 (2013).
- Ren, C., Yan, Z., Wei, D., Gao, X., Chen, X., Zhao, H. Limb remote ischemic postconditioning protects against focal ischemia in rats. Brain Res. 1288, 88-94 (2009).
- Sun, J., et al. Protective effect of delayed remote limb ischemic postconditioning: role of mitochondrial K(ATP) channels in a rat model of focal cerebral ischemic reperfusion injury. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (5), 851-859 (2012).
- Li, P., et al. Remote limb ischemic postconditioning protects mouse brain against cerebral ischemia/reperfusion injury via upregulating expression of Nrf2, HO-1 and NQO-1 in mice. Int J Neurosci. , 1-8 (2015).
- Fan, Y. Y., et al. A novel neuroprotective strategy for ischemic stroke: transient mild acidosis treatment by CO2 inhalation at reperfusion. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (2), 275-283 (2014).
- Shen, Z., et al. PARK2-dependent mitophagy induced by acidic postconditioning protects against focal cerebral ischemia and extends the reperfusion window. Autophagy. 0, (2017).
- Skolnik, J., Takacs, L., Szende, E. In vitro oxygen consumption of slices from kidney, brain, cortex and liver in hypoxia. Nature. 209 (5020), 305 (1966).
- Lynch, G., Schubert, P. The use of in vitro. brain slices for multidisciplinary studies of synaptic function. Annu Rev Neurosci. 3, 1-22 (1980).
- Zheng, S., Zuo, Z. Isoflurane preconditioning reduces purkinje cell death in an in vitro model of rat cerebellar ischemia. Neuroscience. 118 (1), 99-106 (2003).
- Yin, B., Barrionuevo, G., Weber, S. G. Optimized real-time monitoring of glutathione redox status in single pyramidal neurons in organotypic hippocampal slices during oxygen-glucose deprivation and reperfusion. ACS Chem Neurosci. 6 (11), 1838-1848 (2015).
- Medvedeva, Y. V., Ji, S., Yin, H. Z., Weiss, J. H. Differential vulnerability of CA1 vs CA3 pyramidal neurons after ischemia: possible relationship to sources of Zn2+ accumulation and its entry into and prolonged effects on mitochondria. J Neurosci. , (2016).
- Pignataro, G., et al. In vivo and in vitro characterization of a novel neuroprotective strategy for stroke: ischemic postconditioning. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (2), 232-241 (2008).
- Zhang, X., Ding, H. Z., Jiang, S., Zeng, Y. M., Tang, Q. F. An in vitro study of the neuroprotective effect of propofol on hypoxic hippocampal slice. Brain Inj. 28 (13-14), 1758-1765 (2014).
- Niu, Y., et al. Chemical profiling with HPLC-FTMS of exogenous and endogenous chemicals susceptible to the administration of chotosan in an animal model of type 2 diabetes-induced dementia. J Pharm Biomed Anal. 104, 21-30 (2015).
