Summary
La postcondizionazione acida protegge contro l'ischemia cerebrale. Qui presentiamo due modelli per eseguire APC. Esse vengono ottenute rispettivamente trasferendo fette corticostriatali in tampone acico dopo la privazione di ossigeno-glucosio in vitro e inalando 20% di CO 2 dopo l'occlusione dell'arteria cerebrale media in vivo .
Abstract
L'ictus è una delle principali cause di mortalità e disabilità in tutto il mondo, con approcci terapeutici limitati. Come una strategia endogena per la neuroprotezione, i trattamenti post-condizionatori si sono dimostrati come terapie promettenti contro l'ischemia cerebrale. Tuttavia, complicate procedure e potenziali problemi di sicurezza limitano la loro applicazione clinica. Per superare questi svantaggi, abbiamo sviluppato postcondizionamento acico (APC) come terapia per l'ischemia cerebrale focale sperimentale. APC si riferisce al trattamento di acidosi mite mediante inalazione del CO 2 durante la reperfusione a seguito di ischemia. Qui presentiamo due modelli per eseguire APC in vitro e in vivo rispettivamente. Il trattamento della deprivazione di ossigeno-glucosio (OGD) dei topi e l'occlusione corticostriatale e l'occlusione dell'arteria cerebrale centrale (MCAO) dei topi sono stati impiegati per simulare l'ischemia cerebrale. L'APC può essere ottenuto semplicemente trasferendo le fettucce del cervello in tampone acido con 20% CO 2 , oR per topi inalando 20% di CO 2 . APC ha mostrato significativi effetti protettivi contro l'ischemia cerebrale, come rispecchia la vitalità del tessuto e il volume dell'infarto del cervello.
Introduction
L'ictus è una delle principali cause di mortalità e disabilità in tutto il mondo. Sono stati compiuti grandi sforzi per trovare efficaci trattamenti di ictus negli ultimi decenni, tuttavia il risultato è piuttosto insoddisfacente. Postcondizionamento è un processo manipolato da sottotossici stress dopo un episodio ischemico. Postcondizionamento, incluso ischemico, ipossico, basso glucosio e post-condizionamento ischemico a distanza, provoca meccanismi di adattamento endogeno e sono stati dimostrati promettenti terapie contro l'ischemia cerebrale 1 , 2 , 3 , 4 . Tuttavia, il postcondizionamento ischemico può presentare ulteriori lesioni. Il postcondizionamento ischemico remoto a distanza richiede solitamente diversi cicli di occlusione e reperfusione da 5 a 20 minuti sugli arti posteriori ipsilaterali o bilaterali 5 , 6 , 7 . thIn realtà, queste manipolazioni post-condizionanti sono pericolose o impraticabili nella pratica clinica. Per superare questi svantaggi, abbiamo sviluppato APC come terapia per l'ischemia cerebrale focale nei topi 8 . Indotta semplicemente inalando 20% di CO 2 , APC riduce in modo significativo lesioni cerebrali ischemiche in modo più fattibile e più sicuro. Recentemente abbiamo dimostrato che APC estende la finestra di reperfusione, evidenziando il significato dell'APC per la terapia a colpo 9 .
Qui presentiamo due modelli sperimentali per studiare la neuroprotezione dell'APC contro l'ischemia cerebrale. Il primo è il modello di deprivazione di ossigeno-glucosio (OGD) in fette corticostriatale di topi. La rapida preparazione e il trasferimento delle fette del cervello in un ambiente artificiale, di solito liquido cerebrospinale artificiale (ASCF), può mantenere la vitalità delle cellule e la circuiteria neuronale, che consente di studiare la funzione cerebrale in vitro 10 <Sup>, 11 . OGD in ASCF imita l'ischemia cerebrale e induce lesioni ischemiche 12 , 13 , 14 . Dopo l'OGD, le fette del cervello vengono aggiornate in ASCF regolare (r-ASCF) per fornire reperfusione e quindi trattate con APC usando ASCF acido bolle con 20% CO 2 . La fetta corticostriatal mantiene la caratterizzazione istologica intatta rispetto alle cellule primari coltivate.
Per studiare la funzionalità cerebrale in vivo , viene utilizzato il modello di occlusione cerebrale cerebrale centrale (MCAO). L'arteria cerebrale centrale viene bloccata inserendo un monofilamento a fiamma attraverso la comune arteria carotidea. Come uno dei modelli di corsa più utilizzati, il modello MCAO dimostra la rilevanza clinica e l'applicazione di un monofilamento rende più facile la reperfusione. Semplicemente inalando il gas misto normalmente contenente 20% di CO 2 dopo l'insorgenza del reperfusioN, APC ha dimostrato significativi effetti protettivi contro l'ischemia cerebrale indicata da volumi ridotti del cervello.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati approvati e condotti in conformità con le linee guida etiche del comitato scientifico per la sperimentazione degli animali di Zhejiang e sono stati in piena conformità con la Guida nazionale degli istituti sanitari per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Sono stati fatti sforzi per minimizzare qualsiasi dolore o disagio, ed è stato utilizzato il numero minimo di animali.
1. OGD di fette corticostriatali
- Preparazione della soluzione:
- Preparare 1,000 mL r-ACSF (124 mmol / L, NaCl, 5 mmol / L KCl, 1,25 mmol / L KH 2 PO 4, 2 mmol / L MgSO 4, 26 mmol / L NaHCO 3, 2 mmol / L CaCl 2, 10 mmol / L di glucosio, finale pH 7,4). Bolla con 5% CO 2 e 95% O 2 durante l'esperimento.
- Preparare 200 ml di ACSF senza glicemia (gf-ACSF) come sopra, ma escluso il glucosio, bolle con 5% CO 2 e 95% N 2 . Bolle i gas per 30 minuti prima di applicare a brAin per ridurre il contenuto di ossigeno nella soluzione. Continuare a bolle fino alla fine della procedura OGD.
- Preparare ACSF acido (a-ACSF) equilibrando 200 mL r-ACSF con 20% CO 2 e 80% O 2 . Bolle i gas per 30 minuti prima di applicare alle fette del cervello per ridurre il pH della soluzione al pH 6,8 e continuare a bolle fino alla fine della procedura APC.
- Posizionare tre portafogli in r-ACSF, gf-ACSF, a-ACSF, rispettivamente.
- Preparazione della cervello:
Nota: i topi maschi C57Bl / 6J maschi di 8 settimane sono stati utilizzati in questo studio. Gli animali sono stati alloggiati a temperatura controllata (22 ± 2 ° C), con un periodo di ciclo chiaro di 12 h e l'accesso a cibi e acqua.- Sacrifica un topo con un sovradosaggio di isoflurano in una camera di induzione. Decapitate il mouse. Disseccare il cervello usando piccole forbici e pinze. Rimuovere il cervello con una spatola sottile e lasciarla accuratamente in un bicchiere di vetro conContenente r-ACSF ghiacciata equilibrata con 5% CO 2 e 95% O 2 .
NOTA: Questi passaggi devono essere eseguiti in modo rapido ma meticoloso possibile. - Mantenere il cervello nel r-ACSF freddo ghiacciato per 5 min. Regolare la pressione del gas per evitare movimenti del cervello.
- Collocare la colla crioprecipitata sulla piastra vibratomia in due strisce. Mettere un pezzo di agarosio del 3% sulla striscia di colla lontano dalla lama per sostenere il cervello.
- Invertire un piatto di Petri da 10 cm sul ghiaccio e poi mettere una carta filtrante sul piatto. Inumidire la carta filtrante con gocce di r-ACSF ghiacciata.
- Trasferisci il cervello alla carta filtrante con le pinze. Tagliare il palo frontale e il cervelletto con lama e pinze.
NOTA: le sezioni trasversali dovrebbero essere il più agevole possibile e verticali al piano sagittale. - Posizionare il tessuto cerebrale rimanente verticalmente sull'altra striscia di colla e mantenere il cervello appoggiato all'agarosio. Aggiungere r-ACSF ghiacciato al serbatoio di taglio aImmergere il cervello e aggiungere ghiaccio all'area del supporto ghiaccio. Tenere il r-ACSF nel serbatoio in bolle con 5% CO 2 e 95% O 2 .
- Sollevare il serbatoio e regolare la posizione del rasoio per posizionare il rasoio più vicino al cervello possibile e appena sopra il cervello.
- Scegliete la modalità "CONT" per tagliare continuamente le sezioni del cervello. Impostare lo spessore di taglio a 400 μm, la frequenza di vibrazione a 6 - 8 e la velocità a 3 - 4. Premere il pulsante "start / stop" per avviare il taglio automatico.
- Tagliare la punta di una pipetta Pasteur da 3 ml per fare un'apertura corrispondente alle dimensioni delle fette del cervello.
NOTA: l'apertura dovrebbe essere abbastanza grande per evitare ulteriori danni alle fette del cervello. - Disegnare cinque fette del cervello una per una con la pipetta tip-cutPasteur e collocarle nel supporto di tessuto in r-ACSF ghiacciato bolle con 5% CO 2 e 95% O 2 . Non raccogliere la prima fetta prodotta. Regolare la pressione del gas in posizione apertaD movimenti delle fette del cervello.
NOTA: Le fette del cervello non devono coprire l'altro. - Posizionare le fette del cervello con r-ACSF a temperatura ambiente per 30 minuti e poi a 37 ° C in un bagno d'acqua per altri 10 minuti per recuperare le funzioni sinaptiche.
- Sacrifica un topo con un sovradosaggio di isoflurano in una camera di induzione. Decapitate il mouse. Disseccare il cervello usando piccole forbici e pinze. Rimuovere il cervello con una spatola sottile e lasciarla accuratamente in un bicchiere di vetro conContenente r-ACSF ghiacciata equilibrata con 5% CO 2 e 95% O 2 .
- OGD e APC:
- Posizionare gf-ACSF e a-ACSF in un bagno d'acqua di 37 ° C e bollire i tamponi con i corrispondenti gas come sopra indicato in 1.1.2 e 1.1.3 per 30 minuti.
- Lasciare una fetta in r-ACSF come un controllo. Trasferire con cura le altre quattro fette del cervello nel supporto del tessuto con gf-ACSF preriscaldato e incubare per 15 minuti. Trasferire le fette nel supporto di tessuto in r-ACSF per ottenere reperfusione.
- Per studiare la finestra temporale di APC, trasferire una fetta direttamente da gf-ACSF a un ACSF. Trasferire innanzitutto le altre tre fette in r-ACSF e quindi trasferire due di esse nel portafoglio in un ACSF 5 e 15 minuti dopo la reperfusione rispettivamente.
- IncubatE le due fette in a-ACSF per 3 minuti e poi trasferite nuovamente a r-ACSF. Incubare le tre fette in r-ACSF per altri 1 h. Impostare le restanti fette in r-ACSF come gruppo OGD.
- Per uno studio di risposta dose, trasferire tutte e quattro le fette al supporto tissutale in r-ACSF inizialmente dopo OGD e incubare per 5 min. Quindi lasciare una fetta in r-ACSF come gruppo OGD e trasferire le altre tre fette in un ACSF. Incubare le fette in a-ACSF rispettivamente per 1, 3 e 5 min e quindi trasferirle nuovamente a r-ACSF. Incubare le tre fette in r-ACSF per altri 1 h.
- Determinazione della vitalità della fetta:
- Preparare la soluzione salina normale di 2,3,5-trifeniltetrazolium cloridrato (TTC) 0,25%. Aggiungere 1,25 g di polvere TTC a 500 ml di soluzione salina normale.
NOTA: Dopo che la polvere si dissolve completamente, trasferire la soluzione in una piastra a 24 pozzetti (500 μl per pozzetto) rivestita in fogli e conservarla a 4 ° C. TTC e tessuti macchiati con TTC sono sen. Leggerisitive. - Trasferire le fette in una piastra a 24 pozzetti (una fetta per pozzetto) contenente la soluzione TTC e allungare la fetta nella soluzione. Incubare le fette in soluzione TTC a 37 ° C in un bagno ad acqua poco profonda per 30 min.
- Trasferire le fette in tubi centrifughi di 1,5 ml coperti in fogli e misurare il peso secco delle fette.
- Aggiungere etanolo / dimetil sulfossido (1: 1) nei tubi di centrifuga (v: w = 10: 1) per estrarre formazan. Incubare le fette in etanolo / dimetil sulfossido a temperatura ambiente lontano dalla luce per 24 ore.
- Aggiungere tutti i etanolo / dimetilsolfossido nei tubi in una piastra a 96 pozzetti e misurare l'assorbanza a 490 nm da un lettore di piastre.
- Normalizzare l'assorbanza al peso secco della fetta ed esprimere la vitalità come percentuale della fetta di controllo.
- Preparare la soluzione salina normale di 2,3,5-trifeniltetrazolium cloridrato (TTC) 0,25%. Aggiungere 1,25 g di polvere TTC a 500 ml di soluzione salina normale.
2. MCAO
- Preparazione:
- Disinfettare il banco di lavoro, la superficie del Doppler Laser FlowmetrY (LDF) e relativi accessori con alcool etilico del 70%.
- Preparare strumenti autoclavati: due forbici, 10 cm; Due pinze, 10 cm; Una pinza oftalmica, 11 cm; Una micro forbici oftalmiche, 9 cm; Un morsetto a microvessel, 1,8 cm; Azionamento oneneedle, r 12,5 cm; Diverse suture chirurgiche (△ 1/2 4 × 10); tamponi di cotone.
- Preparare una siringa (senza ago) con soluzione salina per mantenere un'area di funzionamento idratata.
- Preparare il gas di anestesia (100% O 2 + isoflurano).
- Rilevamento del flusso sanguigno del cervello:
- Impostare lo strumento LDF.
- Iniettare analgesici intraperitonealmente nel topo: metamizolo 200 mg / kg, carprofen 4 mg / kg e buprenorfina 0,1 mg / kg.
- Posizionare il mouse in una camera di induzione con 4% di isoflurano nell'ossigeno per anestetizzarla finché non si arresta il movimento spontaneo del corpo e delle vibrazioni.
- Posizionare il mouse in posizione predisposta con il naso inserito in questa posizioneCono del naso e mantenere l'isoflurano a 1,5% per la successiva procedura.
- Applicare unguento di occhio dexpanthenol su entrambi gli occhi.
- Disinfettare la testa con alcool etilico del 70%.
- Fare una perfetta incisione paramedica tra gli occhi e le orecchie usando un bisturi per esporre il bregma.
- Strofinare il cranio con cotone sterile.
- Applicare una o due gocce di colla chirurgica alla superficie del cranio.
- Posizionare la punta della sonda a fibre ottiche 5 mm caudale al bregma e 6 mm lateralmente alla linea mediana.
- Avviare la registrazione del flusso sanguigno sul software del computer. Attendere che si verifica una linea stabile di flusso sanguigno e quindi applicare un catalizzatore di 20 μl sulla colla per fissare la sonda.
NOTA: Una linea di base ideale deve essere superiore a 500 flussi. - Se la linea di base è inferiore a 200 flussi, regolare la posizione finemente per ottenere una linea di base adatta. Tenere la sonda attaccata al cranio per tutta la durata dell'esperimento.
- Disinfetta la testa con iodophor afLa sonda a fibre ottiche collegata.
- MCAO:
- Posizionare e fissare il mouse anestetizzato (con sonda LDF attaccato al suo cranio) in posizione supina e mantenere la sua temperatura corporea usando una lampada di calore durante l'intervento chirurgico. Disinfettare il collo con alcol etilico del 70%.
- Effettuare una incisione cutanea paramedica nel collo usando un bisturi; Sfogliare i tessuti molli con le pinze per esporre le navi. Aggiungere una goccia di salina ai tessuti esposti per mantenerli disidratati.
- Dissectare la comune arteria carotide dai tessuti circostanti e dal nervo vagus usando le pinze oftalmiche. Fare attenzione a non danneggiare il nervo vagus. Disinfetta la pelle del collo nuovamente con iodofora dopo che l'arteria carotide comune è esposta.
- Posizionare un morsetto a microvessel all'estremità distale dell'arteria carotide comune e poi legare un nodo morto con suture di seta 6-0 all'estremità prossimale. Posizionare il morsetto il più prossimale possibile per le operazioni successive. Assicurarsi che la lunghezza diLa nave tra il morsetto e il nodo morto è il più a lungo possibile per le operazioni successive.
- Effettuare una sutura temporanea prossimale alla fascetta legando un nodo sciolto. Assicurarsi che ci sia spazio sufficiente tra due nodi per l'inserimento monofilamento.
- Fai un'incisione piccolo-longitudinale tra i due nodi con micro forbici oftalmiche. Assicurarsi che l'incisione sia più vicina al nodo defunto possibile per le operazioni successive. Fare attenzione a non tagliare la nave.
- Inserire un monofilamento di punta da 12 mm con l'incisione per entrare nel lume dell'arteria e far avanzare alcuni millimetri. Stringere il nodo sciolto intorno alla punta del monofilamento e quindi rimuovere il morsetto.
- Far avanzare il filamento nella arteria carotide interna (10 mm per occludere l'arteria cerebrale mediana) con pinze oftalmiche finché il software LDF non mostra un forte calo (> 80% di riduzione del flusso sanguigno di base) nel flusso sanguigno. Registrare l'ora di inizio dell'occlusione.
NOTA: L'impostazione dello strumento LDF èDescritto nella sezione 2.2. - Assorbire l'arteria cerebrale media per 1 ora. Tagliare la sonda LDF e mettere i topi in un incubatore a 30 ° C per la durata dell'occlusione.
- Reperfusione e APC:
- Riconestetizzare gli animali con isoflurano come sopra descritto 55 minuti dopo l'inizio dell'occlusione. Posizionare e fissare i topi in posizione supina. Aprire l'incisione del collo e riesporre la comune arteria carotidea.
- Estrarre delicatamente il filamento con pinze oftalmiche dopo il periodo di occlusione per ottenere la reperfusione e girare la sutura temporanea in una forma permanente stringendo il nodo.
- Per il trattamento dell'acidosi, cambiare il gas inalato dal cono del naso ai gas di miscelazione contenenti 20% CO 2 , 20% O 2 e 60% N 2 per 5 minuti a 5, 50 o 100 minuti dopo la reperfusione. Chiudere l'incisione con una sutura chirurgica interrotta.
- Porre i topi in una gabbia di calore a 30 ° C fino a quando i topi recuperano la coscienzaE poi restituire i topi a gabbie pulite, individuali. Fornire i topi con un piatto di Petri d'acqua e di cibo inumidito. Monitorare attentamente i topi dopo l'intervento chirurgico per un eccessivo dolore e la morte.
- Misura del volume di infarto del cervello:
- Misurare il volume di infarto del cervello utilizzando la colorazione TTC 24 ore dopo la reperfusione.
- Preparare la soluzione TTC di 0,25% come indicato al punto 1.4.1 prima dell'ora di sacrificio designata. Trasferire la soluzione in una piastra a 24 pozzetti (1 mL per pozzetto) ricoperta di foglio e conservarla a 4 ° C.
NOTA: TTC e tessuto macchiato con TTC sono sensibili alla luce. - A 24 ore dopo la reperfusione, sacrifica l'animale con un sovradosaggio di isoflurano in una camera di induzione. Decapitate i topi. Disseccare il cervello utilizzando piccole forbici e pinze. Esaminare i punti di sangue sul cervello per escludere i topi sottoposti a emorragia subarachnoide al Circolo del Willis.
- Posizionare il cervello su una lastra di vetro pulita a -20 ° C di ghiaccio. Posizionare il cervello e il vetrino in un frigorifero -20 ° C per 5 minuti per rendere il cervello più facile da tagliare.
- Estrarre il cervello e il vetrino di vetro da -20 ° C e riporli sul pacco di ghiaccio -20 ° C. Dissecca il palo frontale e il cervelletto con lama e pinze.
- Fetta le sezioni del cervello orizzontalmente ad uno spessore di 1 mm con una lama per produrre 5 fette. Trasferire le fette nella piastra a 24 pozzetti contenenti una soluzione TTC (1 fetta per pozzetto) con le pinze e allungare le fette della soluzione. Incubare le fette in soluzione TTC a 37 ° C in un bagno ad acqua poco profonda per 30 min.
- Aspirare la soluzione TTC. Aggiungere 10% di formaldeide (1 mL per pozzetto) e incubare a temperatura ambiente per 30 min. Posizionare le fette nell'ordine in cui sono state tagliate su un foglio di cellofano e scansionare i segmenti nella piastra fotografica.
- Analizza la dimensione dell'infarto come percentuale dell'intera fetta del cervello usando il software di analisi ImageJLass = "xref"> 8 basato sull'identificazione visiva; Vedere la Figura 2 (a sinistra).
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Representative Results
Nel modello di fetta corticostriatal descritto sopra, la vitalità della fetta corticostriatale è stata quantificata con il dosaggio TTC a 1 h dopo la reperfusione. La conversione TTC è stata calcolata normalizzando l'assorbimento a 490 nm alla fetta di controllo. Secondo la conversione TTC, l'APC è protetto contro lesioni di reperfusione indotte da OGD in un modo di dipendenza dal tempo e dalla durata. In dettaglio, sia 1 e 3 minuti di trattamento dell'acidosi hanno migliorato significativamente la vitalità a 5 minuti dopo 15 minuti di OGD, mentre 5 minuti non hanno (OGD: 0.609 ± 0.029, 5/1: 0.758 ± 0.034, 5/3: 0.821 ± 0.041, 5/5: 0,672 ± 0,053, dati riportati come media ± SEM) ( Figura 1 A ). La neuroprotezione mediante trattamento dell'acidosi è rimasta protettiva entro 5 minuti dalla reperfusione, mentre 15 minuti non (OGD: 0.584 ± 0.044, 0/3: 0.762 ± 0.036, 5/3: 0.833 ± 0.062, 15/3: 0.627 ± 0.038) ( Figura 1 B ).
Nel modello MCAO, 5 minuti di trattamento dell'acidosi iniziato a 5 minuti dopo l'inizio della reperfusione, la morte di cellule staccate causata da insulti ischemici, riflesse da piccoli volumi di infarto (MCAO: 33,4 ± 4,4%, 5/5: 16,6 ± 2,7%, 50 / 5: 19,5 ± 2,1%, 100/5: 37 ± 2,1%). La neuroprotezione era ancora robusta, anche quando il tempo di inizio è stato ritardato a 50 minuti dopo la reperfusione. Tuttavia, il trattamento dell'acidosi iniziato a 100 minuti non ha bloccato le lesioni ischemiche ( Figura 2 ).
Tutti i dati sono stati raccolti e analizzati in modo accecante. I dati sono presentati come media ± SEM. Nel modello della fetta corticostriatal, ogni gruppo ha 6-8 campioni. Nel modello MCAO, ogni gruppo ha 9-10 campioni. L'analisi univoca di varianza con differenza minima è stata applicata per più confronti.
Figura 1 . APC protegge contro l'OGD-indotta lesione di reperfusione in fette corticostriatali. Le fette corticostriatali sono state trattate con acidosi (pH 6,8) per durate indicate (A) e periodi di recupero indicati (B) dopo OGD. La vitalità cellulare è stata valutata con il test di bromuro di 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difeniltetrazolium al 24 ore dopo la reperfusione e la vitalità della fetta corticostriatale è stata quantificata con il dosaggio TTC a 1 h dopo la reperfusione. I valori mostrano la media ± SEM. N = 6 - 8 per ogni gruppo; * P <0,05 e ** p <0,01 da un'analisi di varianza; R, reperfusione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . APC protegge contro lesioni indotte da MCAO nei topi. Gli animali sono stati sottoposti a 60 minuti di MCAO e trattati per inalazione del 20% di CO2 per 5 minuti a 5, 50 o 100 minuti dopo la reperfusione. Il volume di infarto è stato quantificato con la colorazione di 2,3,5-trifeniltetrazolium cloridrato a 24 ore dopo la reperfusione (indicata dalla linea tratteggiata nera sul pannello sinistro). I valori mostrano la media ± SEM. N = 8 - 10 per ogni gruppo; * P <0,05 e ** p <0,01 da un'analisi di varianza; R, reperfusione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui presentiamo due modelli sperimentali per studiare la neuroprotezione dell'APC contro l'ischemia cerebrale. Nelle fette del cervello, l'APC è ottenuto incubando le fette corticostriatali dei topi in tampone acico in boom con 20% di CO 2 dopo l'insorgenza di reperfusione, mentre nel modello MCAO l'APC è ottenuto inalando 20% di CO 2 nei topi dopo la reperfusione. Entrambi i modelli riflettono la neuroprotezione dell'APC contro l'ischemia cerebrale. La protezione era paragonabile a quella ottenuta con postcondizionamento ischemico ma con una finestra di tempo più ampia. Nel modello MCAO, la finestra temporale potrebbe durare fino a 50 minuti dalla reperfusione rispetto a 10 minuti per il postcondizionamento ischemico 15 . Inoltre, la procedura di APC è più semplice e sicura.
Nel modello di fette corticostriatal, operazioni dolci e rapide sono cruciali per garantire la massima redditività delle fette del cervello. Per la prestazione MCAO, il monitoraggio del flusso sanguigno cerebrale èNecessaria e il forte calo del flusso sanguigno deve essere osservato per assicurare l'occlusione dell'arteria cerebrale mediana. Dopo che i cervelli venivano disseccati per la colorazione TTC, è necessario un attento esame del cervello per l'esclusione della emorragia subarachnoide.
L'estensione e la durata dell'acidosi sono fondamentali per ottenere la neuroprotezione di APC. La durata prolungata del trattamento dell'acidosi non è vantaggiosa nel modello delle fette corticostriatal ( Figura 1 A ). Inoltre, il nostro precedente studio ha mostrato che sia l'inalazione del 10% e del 20% di CO 2 , piuttosto che l'inalazione del 30% di CO 2, conferiscono neuroprotezione ai topi 8 . Queste suggeriscono che l'acidosi lieve è fondamentale per la neuroprotezione di APC e quindi la concentrazione di CO 2 e la durata di APC sono indispensabili per la neuroprotezione dell'acidosi.
Oltre alla colorazione TTC, molte tecniche possono essere combinate a sSoddisfare diverse esigenze di ricerca. Ad esempio, la registrazione elettrica extra-cellulare può essere aggiunta al passaggio finale per osservare come l'ischemia e l'acidosi influenzano il potenziale neurale 16 . La soluzione di perfusione della fetta del cervello può anche essere raccolta per misurare il cambiamento di concentrazione di neurotrasmettitori di aminoacidi dopo APC mediante HPLC 17 . Fette di alcune regioni del cervello possono essere preparate per studiare le risposte di una particolare area all'ischemia e all'APC. Nel complesso, molte alternative possono essere introdotte per illuminare gli impatti dell'ischemia e dell'acidosi.
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Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione Nazionale di Scienze Naturali della Cina (81573406, 81373393, 81273506, 81221003, 81473186 e 81402907), Zhejiang Provincial Science Foundation (LR15H310001) e il Programma di Zhejiang Leadership Team di S & T Innovation Team (2011R50014).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Magnesium sulfate | Sigma | M2643 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C5080 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
| Vibratome | Leica | VT1000 S | |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium hydrochloride | Sigma | T8877 | |
| Absolute Ethanol | Aladdin Industrial Corporation | E111993 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Laser Doppler Flowmetry | Moor Instruments Ltd | Model Moor VMS-LDF2 | |
| Diethyl ether anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Corporation | 80059618 | |
| Trichloroacetaldehycle hydrate | Sinopharm Chemical Reagent Corporation | 30037517 | |
| 10% Formalin | Aladdin Industrial Corporation | F111936 | |
| 24-well plates | Jet Biofil | TCP-010-024 |
References
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