Summary

Saggio per la fosforilazione e l'associazione dei microtubuli con localizzazione della proteina Tau in cellule di cancro del colon-retto

Published: October 10, 2017
doi:

Summary

Questo manoscritto descrive protocolli standard per la misurazione iperfosforilazione di tau, associazione tau ai microtubuli e la localizzazione intracellulare Tau dopo trattamenti farmacologici di misura. Questi protocolli possono essere utilizzati in modo ripetitivo per lo screening di farmaci o altri composti che ottenere tau iperfosforilazione o dei microtubuli associazione.

Abstract

Il tau proteina microtubule-collegata è una proteina di un neurone che si localizza principalmente negli assoni. Generalmente il tau è essenziale per il normale funzionamento neuronale perché è coinvolto nella stabilizzazione e microtubuli. Oltre a neuroni, tau è espresso in umano del seno, prostata, gastrica, del colon-retto e cancri del pancreas dove Mostra struttura quasi simile ed esercita funzioni simili come il tau neuronale. La quantità di tau e sua fosforilazione può modificare la sua funzione come stabilizzatore dei microtubuli e portare allo sviluppo di filamenti elicoidali accoppiati in diversi processi neurodegenerativi, come il morbo di Alzheimer. Determinazione dello stato di fosforilazione di tau e le sue caratteristiche di microtubule-leganti è importante. Inoltre, esaminando la localizzazione intracellulare di tau è importante in diverse malattie. Questo manoscritto particolari protocolli standard per la misurazione di fosforilazione di tau e associazione tau i microtubuli in cellule di cancro colorettale con o senza curcumina e trattamento di LiCl. Questi trattamenti possono essere utilizzati per interrompere lo sviluppo e la proliferazione della cellula tumorale. Localizzazione intracellulare di tau è esaminati mediante immunoistochimica e microscopia confocale durante l’utilizzo di basse quantità di anticorpi. Queste analisi possono essere utilizzate ripetutamente per lo screening di composti che influenzano l’iperfosforilazione di tau o associazione dei microtubuli. Approcci terapeutici utilizzati per differenti Taupatie o relativi agenti anticancro potenzialmente possono essere caratterizzati tramite questi protocolli.

Introduction

Tau è stata originariamente identificata come una proteina microtubule-collegata di termo-stabile che è stato co-purificata con tubulina1. Tau è espresso esclusivamente in più alti eucarioti2,3,4. La funzione principale di tau è quello di controllare microtubule Assemblea1,5,6. Contribuisce anche alla polimerizzazione dei microtubuli7, trasporto assonale8, cambiamenti nel diametro assonale9, formazione di neuroma polarità e neurodegenerazione10. Tau funge anche da un’impalcatura di proteine per controllare alcune vie di segnalazione. Gli studi del cervello di ratto suggeriscono che tau è neurone-specifico e che localizza principalmente in assoni11. Perché tau è essenziale per la polimerizzazione dei microtubuli e sviluppo neuronale, tau è stata supposta per svolgere un ruolo importante nello sviluppo di axonal nel sistema nervoso centrale; Questa ipotesi è stato successivamente verificato da esperimenti in vitro e in vivo . Oltre ai neuroni, tau è espresso in cellule non neuronali differenti, compreso fegato, rene e muscolo cellule12,13. Tau è espresso anche in umano del seno, della prostata, del colon-retto, gastrica e cancro del pancreas cella linee e tessuti14,15,16,17,18, 19. tau si trova anche nella miosite come twisted tubulofilaments in corpi di inclusione20.

Tau può trasportare parecchie modifiche post-traduzionali. Di tutte le modifiche post-traduzionali, fosforilazione è il più comune. Fosforilazione di tau aumento diminuisce la sua affinità per i microtubuli, infine destabilizzare il citoscheletro. Siti di fosforilazione di ottantacinque sono stati descritti nella proteina tau isolato dai tessuti di cervello umano del morbo di Alzheimer. Di questi siti, 53% costituiscono serina, treonina 41% e solo 6% tirosina residui21,22,23. La fosforilazione di Tau influisce sulla sua localizzazione, funzione, associazione, solubilità e della sua suscettibilità ad altre modificazioni post-traduzionali. Anche la fosforilazione di tau a oltre la misura normale (o completamente saturo con gruppi fosfato) è conosciuto come iperfosforilazione che replica le caratteristiche strutturali e funzionali del morbo di Alzheimer24. Tau mantiene il corretto funzionamento dei microtubuli assonali e assicura il normale funzionamento neuronale in condizioni fisiologiche. Tuttavia, tau iperfosforilata non riesce a mantenere un’associazione ben organizzata dei microtubuli, causando la perdita di un neurone a causa di disassemblaggio dei microtubuli. Sono necessari per tau corretto funzionamento normali livelli di fosforilazione di tau, ma tau non riesce a funzionare normalmente se il livello di fosforilazione caratteristico è alterato e se è hyperphosphorylated25. Nel morbo di Alzheimer e di alcuni altri disordini neurodegenerative relativi all’età, tau diventa hyperphosphorylated e forma i filamenti elicoidali accoppiati e grovigli neurofibrillary26,27. Così, i metodi per determinare la fosforilazione di tau e associazione dei microtubuli sono importanti.

Cancro colorettale, un cancro di invecchiamento-collegato, è che il terzo più frequentemente diagnosticato cancro e il terzo cancro prominente di causa di morte per uomini e donne28. Il cancro colorettale è uno dei cancri più principali causa di morte nel mondo occidentale29. Perché sia cancro colorettale e morbo di Alzheimer sono associate con l’invecchiamento e sia capita soprattutto nei paesi sviluppati, dove le persone godono simili abitudini alimentari, le due malattie possono in qualche modo essere correlate. Inoltre, le cellule tumorali tau-positivi e negativi tau rispondono in modo diverso agli agenti chemioterapeutici, ad es., paclitaxel16.

La curcumina è uno dei principali derivati di Curcuma longa, la curcuma spezia indiana30. Per secoli, popolazioni sud asiatiche hanno consumato curcuma nella loro dieta su base giornaliera. La curcumina è usata per trattare diverse patologie, compreso cancro colorettale, morbo di Alzheimer, diabete, fibrosi cistica, malattie infiammatorie intestinali, artrite, iperlipidemia, aterosclerosi e malattia cardiaca ischemica31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. al litio può anche uccidere le cellule tumorali del colon-retto o prevenire la loro proliferazione39. Litio può essere utilizzato anche per il trattamento del morbo di Alzheimer40 come si diminuisce l’aggregazione di tau e impedisce la sua iperfosforilazione come osservato in un topo transgenico modello41,42,43, 44.

Questo manoscritto si propone di: 1) misurare la tau totale e livelli di espressione di phospho-tau in cellule trattate; 2) descrivere un’analisi della fosfatasi per misurare la fosforilazione di tau complessiva; 3) esaminare microtubule-leganti di tau; e 4) localizzare tau mediante microscopia confocale in linee cellulari di cancro colorettale trattate con curcumina o LiCl. I risultati rivelano che il trattamento delle cellule con la curcumina, che è un agente chemioterapeutico apparentemente buono per tumore del colon, e trattamento con LiCl può ridurre l’espressione di entrambi tau totale e fosforilato tau in linee cellulari di cancro colorettale. Questi trattamenti possono anche causare la traslocazione nucleare di tau. Tuttavia, inaspettatamente, la curcumina non riesce a migliorare associazione di tau i microtubuli.

Protocol

1. preparazione dei reagenti aggiungere 10 µ l di soluzione di fluoruro phenylmethylsulfonyl di (1 mM), 10 µ l (1 x da deposito x 100) di soluzione cocktail dell’inibitore di proteasi e 10 µ l (1 x da deposito x 100) di fosfatasi il soluzione cocktail inibitore a 1 mL di tampone di dosaggio (RIPA) x radioimmunoprecipitation 1 per preparare il tampone di lisi completa RIPA. Preparare 10 x buffer buffer (PEM) generale tubulina. Aggiungi 800mm (6,0474 g) piperazina-N-N '…

Representative Results

Espressione di totale tau e fosfo-tau è stata esaminata dopo aver trattato le cellule con differenti concentrazioni di curcumina o LiCl (Figura 1). Trattamento delle cellule con le tre diverse concentrazioni di curcumina ha fatto diminuire i livelli di espressione di tau; Tuttavia, phospho-tau espressione aumentata dal trattamento con bassa concentrazione di curcumina ma è diminuito al momento trattando le cellule con alte concentrazioni di curcumina. Anti-…

Discussion

Questo manoscritto stabilito diverse condizioni procedurale per la rilevazione totale tau e fosforilato tau in cellule di cancro colorettale trattate con curcumina e LiCl. Per valutare lo stato generale di fosforilazione di tau nei campioni della proteina, è stata descritta un’analisi della fosfatasi. Questo test può potenzialmente utilizzabili per esaminare lo stato di fosforilazione di tutta la proteina.

Questa analisi è basata sul principio che fosforilato proteina mosse più lento del s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questa ricerca è stata eseguita come parte del progetto dal titolo “Sviluppo e industrializzazione di alto valore materie prime cosmetiche da microalghe marine”, finanziato dal Ministero degli oceani e pesca, Corea e fu sostenuta da una sovvenzione intramurale (2Z04930) da KIST Gangneung Istituto di prodotti naturali.

Materials

HCT 116 cell ATCC CCL-247
MEM (EBSS) Hyclone SH30024.01
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher (Gibco) 16000044 Store at -20 °C
penicillin-streptomycin Hyclone SV30010
Trypsin-EDTA solution WelGene LS 015-01
100 mm dish Corning 430161
6 well plate Corning Coster 3516
Anti-Tau 13 antibody abcam ab19030
Dithiothreitol (DTT) Roche 10 708 984 001 Storage Temperature 2–8 °C
Microlitre Centrifuges Hettich Zentrifugen MIKRO 200 R
Paclitaxel Sigma-Aldrich T1912 Storage Temperature 2–8 °C
Curcumin Sigma-Aldrich (Fluka) 78246 Storage Temperature 2–8 °C
Microtubules (MT) Cytoskeleton MT001 Store at 4 °C (desiccated)
Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200 Store at 4 °C in the dark
Sodium hydroxide Sigma 72068
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M2670
GTP Sigma-Aldrich G8877 Store at -20 °C
DPBS WelGene LB 001-02
Sonic Dismembrator Fisher Scientific Model 500
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-100 XP
PIPES Sigma P1851
Bovine serum Albumin (BSA) Sigma A7906
Molecular Imager Bio-Rad ChemiDoc XRS+ Store at 4 °C
Protein assay dye reagent Bio-Rad 500-0006
α-tubulin (11H10) Rabbit mAb Cell signalling 2125
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Cell signalling 2118
Anti-Tau (phospho S396) antibody abcam ab109390
EGTA Sigma E3889 Store at room temperature
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase Thermo Scientific EF0651 Store at -20 °C
PMSF Sigma P7626 Store at room temperature
Phosphatase Inhibitor Cocktail Cell Signalling 5870 Store at 4 °C
Protease Inhibitor Cocktail Cell Signalling 5871 Store at 4 °C
RIPA Buffer Sigma R 0278 Storage Temperature 2–8 °C
Tau-352 human Sigma T 9950 Store at -20 °C
Triton X-100  Sigma-Aldrich X – 100 Store at around 25 °C
PVDF membrane Bio-Rad 162-0177
Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody ThermoFisher A-11005 Store at 4 °C in the dark
Confocal Microscopy Leica Microsystem Leica TCS SP5
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Affymetrix 75819
Protein Assay Bio-Rad 500-0006 Store at 4 °C

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Huda, M. N., Erdene-Ochir, E., Pan, C. Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells. J. Vis. Exp. (128), e55932, doi:10.3791/55932 (2017).

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