Summary
In deze studie wordt de methode gepresenteerd over het uitvoeren van multi-site in vivo elektrofysiologische opnamen van de hyperdirecte weg onder urethaananesthesie.
Abstract
Convergeert bewijs blijkt dat veel neuropsychiatrische ziekten moeten worden begrepen als aandoeningen van grootschalige neuronale netwerken. Om de pathofysiologische basis van deze ziekten beter te begrijpen, is het noodzakelijk om precies te karakteriseren op welke wijze de verwerking van informatie verstoord raakt tussen de verschillende neuronale delen van het circuit. Met behulp van extracellulaire in vivo elektrofysiologische opnamen is het mogelijk om neuronale activiteit nauwkeurig te definiëren binnen een neuronaal netwerk. De toepassing van deze methode heeft meerdere voordelen ten opzichte van alternatieve technieken, zoals functionele magnetische resonantiebeeldvorming en calciumbeeldvorming, omdat het een unieke temporale en ruimtelijke resolutie mogelijk maakt en niet vertrouwt op genetisch gemanipuleerde organismen. Het gebruik van extracellulaire in vivo opnames is echter beperkt omdat het een invasieve techniek is die niet universeel toegepast kan worden. In dit artikel wordt een eenvoudige en makkelijk te gebruiken methode gepresenteerd wMet welke het mogelijk is om extracellulaire potenties tegelijkertijd op te nemen, zoals lokale veldpotenties en multiunitactiviteit op meerdere sites van een netwerk. Het is gedetailleerd hoe een precieze targeting van subcortische kernen kan worden bereikt met behulp van een combinatie van stereotactische chirurgie en online analyse van multi-unit opnames. Zo wordt aangetoond hoe een compleet netwerk, zoals de hyperdirecte cortico-basale ganglia-lus, kan worden onderzocht in verdovende dieren in vivo .
Introduction
Recente cumulatieve bewijzen over verschillende neuropsychiatrische stoornissen zoals de ziekte van Parkinson en schizofrenie stellen sterk voor dat hun pathofysiologie is gebaseerd op een kritische disfunctie van verlengde neuronale circuits die vaak corticale en subcortische structuren 1 , 2 , 3 betreffen . Volgens deze theorie ontstaan de klinische manifestaties van de ziekten als gevolg van een verminderde informatieverwerkingscapaciteit van een netwerk van cellen in plaats van enkele cellen of specifieke neuronale elementen 1 , 2 , 3 . Om het begrip van deze complexe groep neuropsychiatrische ziekten te vergroten en nieuwe behandelingsopties te vinden, is het verplicht om de neuronale dynamiek van deze gedwongen netwerken in menselijke patiënten en in diermodellen in detail te karakteriseren. Een uitstekendMethode om grootschalige netwerken in levende onderwerpen te bestuderen, is elektrofysiologische opnames van extracellulaire potenties 4 . Met behulp van deze methode is het mogelijk om lokale veldpotentialen (LFP's) gelijktijdig te beoordelen, die voornamelijk de temporale summatie vormen van excitatoire en remmende postsynaptische stromingen en multi-unit activiteit (MUA), die wordt gegenereerd door presynaptische mogelijkheden 5 . De opname van extracellulaire potenties heeft meerdere voordelen ten opzichte van alternatieve methoden om netwerken te bestuderen, bijvoorbeeld functionele magnetische resonantiebeeldvorming en calciumbeeldvorming, omdat het een hogere temporale en ruimtelijke resolutie biedt en omdat het niet afhankelijk is van genetisch gemanipuleerde organismen 5 . Het gebruik van extracellulaire in vivo opnames is echter beperkt omdat het een invasieve techniek is die niet universeel toegepast kan worden.
In vivo elektrofysiologische recOrdeningen kunnen zowel wakker als in verdovende dieren worden uitgevoerd 6 . Beide methoden worden gepaard gegaan met specifieke voor- en nadelen. Studies in wakker dieren maken het mogelijk om hersensignalen op te nemen tijdens de uitvoering van bepaalde gedragstaken, maar zijn gevoelig voor bewegingsgerelateerde en andere artefacten 7 , 8 . Opnames in verdovende dieren daarentegen bieden de mogelijkheid om LFP's en MUA te beoordelen met een minimum van artefacten bij zeer gedefinieerde corticale synchronisatiestaten, maar de resultaten verschillen ook tot op zekere hoogte in wat wakker is in vakken 9 , 10 , 11 .
In de afgelopen jaren is aangetoond dat de bemonstering van LFP's bijzonder nuttig is om pathologische veranderingen van netwerkactiviteit te definiëren. Een prominente voorbeeld hiervan is onderzoek naar de pathofysiologie van PD in de menselijke patiëntS en diermodellen van de ziekte, waaruit bleek dat verbeterde bètoscillaties in de cortico-basale ganglia-lus gekoppeld zijn aan parkinsonische motorische symptomen 12 , 13 . Als gevolg van deze onderzoekslijn wordt momenteel onderzocht of bèta-oscillaties gebruikt kunnen worden als een online-feedback biomarker voor de gesloten-loop diepe hersenstimulatie 14 , 15 .
In de onderhavige studie wordt een gedetailleerde beschrijving gegeven van acute multi-site in vivo elektrofysiologische opnames van LFP's en MUA bij ratten die met urethaan zijn verdoofd. Er wordt aangetoond hoe een volledig netwerk, zoals de hyperdirecte cortico-basale ganglia-route, elektrofysiologisch kan worden gekenmerkt door gebruik te maken van standaard en aangepaste elektroden en hoe deze elektroden kunnen worden gebouwd. Het wordt vooral benadrukt hoe een nauwkeurige targeting van basale ganglia kernen kan worden bereikt door coMbining stereotactische operatie samen met de online registratie van MUA's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Duitse dierenwelzijnswet (laatst gewijzigd in 2014) en Europese regelgeving (2010/63 / EU). Experimenten werden goedgekeurd door de lokale dierenwelzijnsautoriteit (LaGeSo, Berlijn) en conform de lokale afdeling en internationale richtlijnen.
OPMERKING: In de gepresenteerde methode worden twee modellen van elektroden gebruikt om te registreren vanuit de hyperdirecte cortico-basale ganglia-route die de primaire motorcortex (M1) verbindt met de subthalamische kern (STN) en het substantia nigra pars reticulate (SNr). Voor epiduraal elektrocorticogram (ECoG) worden opnamen van de M1 op maat gemaakte laagimpedantie Ag / AgCl elektroden gebruikt. De opnames van de STN en SNr worden uitgevoerd met in de handel verkrijgbare hoogimpedantie wolframelektroden.
1. Constructie van Epidurale Elektroden Epidurale Ag / AgCl
- Neem een ca. 5 cm lange strook 99,99% zuivere zilveren draad met een diameterR van 200 μm en verwijder eventuele bekleding indien nodig.
- Houd de draadtip met de tip naar beneden in een vlam van een aansteker of kaars totdat de tip begint te smelten. Wacht tot de punt bolvormig is en een diameter heeft van ongeveer 1 mm. Knip de voorgevormde elektrode af tot een totale lengte van 15 mm vanaf het begin van de kogelvormige punt naar het draad einde.
- Soldeer een precisie connector aan het draad einde, dat past bij het gebruikte elektrofysiologische opnamesysteem. Bedek het soldeerpunt van het draad einde naar de connector met geleidende zilververf. Dit helpt de geleidbaarheid en resulteert in een betere signaalkwaliteit.
- Nadat de geleidende vernis is gedroogd, bedek het soldeerpunt met een 3 mm tot 1 mm krimpkous. Gebruik voorzichtig een horlogemakerhamer om de kogelvormige dop naar de helft van de dikte te plakken.
- Zet de handschoenen aan en maak een lintvrije reinigingsdoek met 100% ethanol om vuil en vet te verwijderen.
- Zet de elektroden inEen 15 ml centrifuge buis of celcultuur buis en vul het op met huishoudelijke chloor bleekmiddel (WAARSCHUWING, bevattende 2,8 g natriumhypochloride per 100 g oplosmiddel) tot de kogelvormige punt volledig bedekt is.
VOORZICHTIG: Chloorbleekmiddel is bijtend; Volg altijd de veiligheidsinstructies van de fabrikant. - Neem de elektroden na 23 minuten uit en spoel ze royaal met gedestilleerd water. De succesvolle toepassing van een zilverchloridelaag verschijnt als een homogene paarsverandering in kleur.
- Droog in de lucht. Na volledig gedroogd, neem de elektroden met fijne pincetjes. Met een fijne penseelbril moet u een vloeibare elektrische isolatie toepassen. Begin de draad direct achter de elektrodespit en bedek alles tot aan de krimpkous. Laat de isolatie minstens 2 uur drogen.
- Voor kwaliteitscontrole, controleer een elektrische geleidbaarheid met een multimeter. Indien beschikbaar, voer een impedantie test op 1 kHz uit door gebruik te maken van een passende impedantie meter, terwijl de elektrode en testSonde worden samengevoegd in een 0,9% NaCl die H20 oplossing bevat zonder elkaar aan te raken. Impedantiewaarden bij 1 kHz moeten ongeveer 8 kΩ bedragen.
2. Bevestigen van de elektroden aan een stereotaxische houder
OPMERKING: Gebruik tegelijkertijd MUA en LFP's, gebruik wolfraam microwire elektroden met een impedantie van 1,5 MΩ. Als de focus van de opnames is op hoge kwaliteit opnames van eenheden, kies dan microwire elektroden met een hogere impedantie (> 5 MΩ). Als het doel van de studie uitsluitend gericht is op LFP's, kunnen elektroden met lagere impedanties aanvaardbaar zijn. Voor kleine structuren, waarvoor dorsoventrale stereotaxische aanpassingen vaak nodig zijn, gebruik dan elektroden met een geschikte dorsoventrale tipscheiding (in dit geval 250 μm). Bovendien biedt dit het voordeel van een meer lokale referentieelektrode, indien nodig. De stereotaxische coördinaten worden altijd gemeten van de laagste elektrode en aOpnieuw berekend op basis van de bregma.
- Neem een standaard stereotaxische elektrodehouder met een acrylblok en klem en leg hem veilig op een vlak oppervlak in het oogpunt van een chirurgische microscoop.
- Los het eerste paar elektroden los aan het acrylblok van de houder met kleefbandjes (3 mm x 8 mm) met fijne pincetjes. De elektroden moeten het acrylblok ca. 12 mm.
- Reinig de tweede bipolaire elektrode zorgvuldig naast de eerste elektrode. Voor het richten van de structuren van de hyperdirecte weg, moet de afstand 2 mm zijn ( Figuur 1 ). Voor de meeste standaard stereotaxische elektrodehouders is dit de aangrenzende uitsparing. Gebruik een kalibreermeter om te verifiëren. Verschillende netwerken kunnen op dezelfde manier benaderd worden. Hiervoor kan het acrylblok in zekere mate worden gedraaid.
- Pas het tweede paar elektroden aan door deze zorgvuldig naar een positie te schuiven, waarbij de meest ventrale punt ongeveer 200 isΜm verzonken in vergelijking met de eerste elektrode ( Figuur 1 ). Doe dit onder microscopische visie. Gebruik hiervoor een 30 G cannula (buitendiameter 300 μm) om de afstand beter te schatten.
- Druk op de kleefband en bevestig vervolgens met de metalen klem van de houder.
3. Chirurgie
- Voor elektrofysiologische opnames gebruikt u urethaan (VOORZICHTIG) voor anesthesie.
Let op: Urethaan is giftig en kankerverwekkend. Volg daarom altijd de veiligheidsvoorschriften en het door de fabrikant van de stof gegeven veiligheidsinformatieblad. - Bereid een oplossing van 200 mg / ml urethaan in 0,9% NaCl medische zoutoplossing op.
- Gee in totaal 1,3 g / kg lichaamsgewicht urethaan intraperitoneaal (IP). Afhankelijk van de rat stam kan het redelijk zijn om de dosis te verdelen in twee doses met een interval van 15 minuten tussen de injecties om de veiligheid van de verdoving te verbeteren.
- Controleer de diepte van de verdoving met behulp van pEdale terugtrekkingsreflex en andere geschikte reflexen. Als de verdoving niet diep genoeg is om een operatie uit te voeren, injecteer 0,15 g / kg lichaamsgewicht urethaan IP en wacht nog eens 15 minuten.
- Breng een oogsalf aan om cornea-uitdroging te voorkomen.
- Controleer de ademhalingsfrequentie en het terugtrekkingsreflex van het pedaal tijdens de verdoving. Gebruik een kleine dierverwarmingsblok met temperatuurregeling om ervoor te zorgen dat de fysiologische lichaamstemperatuur tijdens de operatie wordt gehandhaafd. Vóór de start van de elektrofysiologische opnamen, overstappen naar een niet-elektrisch alternatief ( bijv. Natriumacetaat hoofdkussen).
- Scheer de bont langs de dorsale kant van het hoofd om een schoon chirurgisch veld te bereiken. Desinfecteer rond de incisieplaats met een geschikt chirurgisch ontsmettingsmiddel. Fix het dier in het stereotactische frame.
- Voer een 2 cm lange incisie van de hoofdhuid in sagittale richting met een scalpel. Gebruik een scalpel om de schedelapneurose enigszins af te schrapen en de schedel te desinfecteren. Gebruik coTton knoppen geweekt in 3% H 2 O 2 om eventuele resterende weefsels te verwijderen.
- Gebruik een elektrocauter of thermocauter om bloeden te controleren, indien nodig. Stop bloeden van het schedelbeen en de hypoderm, als de bloeding niet na 1-2 minuten spontaan stopt en het zicht op de schedel voorkomt.
- Pas de snijbalk aan tot het hoofd in de vlakke schedelpositie staat, wat betekent dat de bregma en lambda als stereotaxische referentiepunten in hetzelfde vlak zijn. Dit is het belangrijkst om hoge chirurgische precisie te bereiken. Gebruik een standaard stereotaxisch ratuitlijningsgereedschap, kalibreer de aangewezen punt aan de bregma onder microscopische visie en pas de snijbalk aan tot de aangewezen punten voor de bregma en lambda op het gereedschap tegelijkertijd de schedel raken.
OPMERKING: een aanzicht van de ene kant met gericht licht van de andere kan helpen om deze conditie te bepalen. Als alternatief, neem een stereotaxische houder met een fijne canule en meet de dorsoventrale coördinaten van Bregma aNd lambda onder microscopische visie. Pas de snijbalk aan tot de dorsoventrale coördinaten van Bregma en Lambda hetzelfde zijn. - Gebruik een stereotaxische houder met canule, kalibreren naar de bregma en bereken vervolgens de positie van alle boorgaten op de schedel. Gebruik de stereotaxische houder, markeer de posities van de gaten die moeten worden geboord, hetzij door de schedel voorzichtig te krabben of door een chirurgische kleurmarkering te gebruiken. De coördinaten hiervoor zijn afhankelijk van de doelen, coördinaten met betrekking tot de bregma worden gegeven voor de hyperdirect pathway in Tabel 1 , inclusief de voorgestelde coördinaten voor cerebellaire referentieelektroden.
- Met behulp van een microdrill boren alle gaten zorgvuldig. Voor de STN en SNr boor een gemeenschappelijk gat (ongeveer 2 mm x 3 mm in grootte). Alle andere boorgaten moeten een diameter hebben van ongeveer 1 mm.
- Neem twee fijne cannulas (minstens 27 G) en buig hun tips om een haakvorm te vormen, met een hard oppervlak of pincet. Gebruik deze om eventuele debri te verwijderenS van de boorgaten, en snijd het dura mater zorgvuldig in en verwijder het gemeenschappelijk STN / SNr gat.
- Spoel de boorgaten met fysiologische zoutoplossing. Breng elke 15 minuten een druppel fysiologische zoutoplossing aan op de boorgaten om te voorkomen dat de hersenen en dura uitdrogen.
- Neem een microdrill en bijpassende roestvrijstalen microschroef ( bijv. Een M 1.2 mm x 2 mm schroef), boor een gat en schroef een microschroef tussen de boorgaten van de referentie-epidurale elektroden boven het cerebellum, doe hetzelfde voor de M1 epidurale elektroden.
- Schuif de zelfgebouwde Ag / AgCl epidurale elektroden in de boorgaten voor de referentieelektroden en M1-elektroden. Breng de elektrodespit met fijne pincetjes en schuif het direct onder het schedelbeen in het boorgat.
- Fix alle epidurale elektroden met tweecomponent tandheelkundige acryl. Zorg ervoor dat u het bregma-punt niet bedekt, noch het gemeenschappelijke STN / SNr-gat beïnvloedt.
- Plaats de voorbereide houder met de wolfraam microwire elektrodIs in het stereotaxische frame.
- Kalibreer de meest ventrale elektrode, die bedoeld is om de STN te richten op de bregma. Pas bij de berekende positie boven het gemeenschappelijke STN / SNr gat en verlaag de elektroden naar de hersenen onder microscopische visie. Zorg ervoor dat de wolfraam microwire-elektroden glad in de hersenen gaan.
4. Elektrofysiologische Mapping en opnamen
OPMERKING: Voor deze stap is een Faraday kooi en een multi-kanaals elektrofysiologisch opnamesysteem met opnameprogramma geschikt voor online-filtering en online spikesortering nodig. Gebruik bij voorkeur een systeem dat werkt met een voorversterker die zich dicht bij het hoofd van de dieren bevindt om elektrisch geluid en artefacten tot een absoluut minimum te houden. Naast de wolfraam microwire-elektroden zijn ten minste één epidurale en één referentieelektrode nodig om opnames van de hyperdirecte weg te kunnen uitvoeren. Het is aan te bevelen om epidurale en referentie te plaatsenE elektroden paarsgewijs zonder elkaar aan te raken, dit helpt bij storingen en zorgt voor verschillende soorten referenties in data analyse.
- Zet een mobiele Faraday kooi boven het stereotaxische frame. Als er alleen een stationaire Faraday-kooi beschikbaar is, beweeg het stereotaxische frame zorgvuldig in de Faraday-kooi terwijl u ervoor zorgt dat diepe hersenelektroden niet in de hersenen worden verlaagd tot het stereotaxische frame in zijn uiteindelijke positie staat.
- Sluit de elektroden aan op de hoofdfase van de elektrofysiologische instelling. Zorg ervoor dat de referentieelektroden zijn aangesloten op de juiste referentiekanalen.
- Stel de opnameprogramma in: Bandpass filter (0,05-8,000 Hz) en versterk het (1,500-2,000x) gain van het rauwe datasignaal. Gebruik een online LFP- en spijkfilter met de juiste instellingen (bandpasfilter 0,05-250 Hz voor LFP's, bandpasfilter 300-8000 Hz voor MUA). Voor alle filters, gebruik een butterworth-type filter.
- Stel een spelddrempel in, indien van toepassing, voor onlineE spik sorteren. De meeste opnameprogramma's maken het mogelijk om een piekdrempel op te stellen, die een amplitudewaarde is waarboven een signaal wordt gemarkeerd als een piek door de software. Deze drempel kan ofwel wiskundig bepaald worden als een factor of standaardafwijking van de gemiddelde amplitude van het gefilterde spikesignaal, of kan bij voorkeur bepaald worden door visuele inspectie van datasegmenten <500 ms en opgesteld als een lijn boven het signaalgeluid in een grafische gebruikersomgeving.
OPMERKING: De bedoeling bij het opzetten van een piekdrempel is om toppers te tellen en eenheden te sorteren om informatie te verschaffen over hoeveel neuronen momenteel zijn opgenomen en hoe hun spikes zijn gevormd. - Verlaag de wolfraam microwire-elektroden langzaam naar 1 mm dorsaal van het doel, dat is STN voor hyperdirect pathway. Wacht tot het signaal stabiliseert indien nodig.
- Voor de elektrofysiologische mapping, verplaats de elektroden ventraal in stappen van 100 μm. Bij elke stap, beoordeel het ontstekpatroon, afvuur rAten en vorm van spikes. Vergelijk die met de typische voorbeelden in figuur 2 . Dikwijls tonen dichte kernen zich snel en continu over meerdere dorsoventrale trappen, terwijl vezelrijke structuren lage vuursnelheden en minder homogene spijkeractiviteit in latere ventrale trappen laten zien.
- Voor de hyperdirecte weg, zorg ervoor dat de meest ventrale elektrode in STN zit.
OPMERKING: de STN is bereikt wanneer een aanzienlijke toename in MUA ventraal van de Zona incerta wordt gedetecteerd. Ventral naar de STN, stoppen bijna bijna volledig omdat de elektrode de interne capsule heeft bereikt. Wanneer de meest ventrale elektrode in STN staat, garandeert de configuratie van de wolfraam microelektroden de achterste, tweede elektrode in SNr. Dorsoventrale fine tuning in kleine stappen kan nodig zijn om tegelijkertijd typische MUA in STN en SNr op te nemen. Merk op dat de frequentie van MUA afhankelijk is van het aantal neuronen dat eigenlijk is opgenomen en op het niveau van de hersenenactivering. - Zodra de elektroden in de gewenste structuren zijn, zet u online filtering en spijker sortering aan (zie Figuur 4 ) en start dan de opname van de data. Typische voorbeelden voor de verschillende corticale synchronisatiestaten die kunnen worden geïdentificeerd in de LFP-opnamen worden weergegeven in Figuur 3 .
5. Einde van het experiment
- Wanneer de opnames zijn gedaan, verhoogt u de elektroden langzaam uit de hersenen en spoel ze onmiddellijk met fysiologische zoutoplossing. De elektroden kunnen worden hergebruikt na grondig spoelen en visuele inspectie. Ontladingsbendelektroden.
- Euthanize de dieren door een IP-injectie van een overdosis urethaan (2,5 g / kg lichaamsgewicht).
OPMERKING: Urethane mag alleen gebruikt worden voor eindprocedures. - Als histologische verificatie van de elektrodepositie of andere histologische kleurprocedures vereist is, verwijder de hersenen van de schedel en verwerk deWeefsel adequaat.
OPMERKING: Afhankelijk van de beoogde kleurmethoden kan transcardiale perfusie nodig zijn. Voor na-mortemverificatie van de elektrodepositie is een standaard Nissl-kleuring in de meeste gevallen voldoende om het elektrodebaan in bijvoorbeeld coronale hersensecties te visualiseren. Verdere aanpakken voor het vergemakkelijken van histologische doelverificatie omvatten het gebruik van elektrisch geïnduceerde laesies in het hersenweefsel door het aanbrengen van elektrische stroom via de opnamelektroden of de toepassing van biocompatibele kleurstof voorafgaand aan elektrodeinzetting 16 , 17 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met de hierin gebruikte opnameelektroden is het mogelijk om LFP's uit de primaire motorcortex, de subthalamische kern en de substantia nigra pars reticulata en MUA van de STN en SNr te proeven. Aanvankelijk worden LFP's en multi-unit activiteit samen in een breedband signaal opgenomen. Daarna worden LFP's en MUA's gescheiden door bandpassfilters (0,05-250 Hz voor LFP's en 300-4000 Hz voor MUA).
Voor de juiste targeting van subcorticale kernen, in het bijzonder van kleine structuren zoals de STN, is het voordelig om de geplande stereotaxische coördinaten af te stemmen met het online opgenomen MUA-signaal. Voor het elektrodenstraject targeting kan het STN karakteristieke MUA patroon worden opgenomen ( Figuur 2 ) 9 , 20 .
Voor latere stappen van de analyse is hetVaak verplicht om eenheden uit multi-unit activiteit te definiëren door middel van principe-componentanalyse ( figuur 4 ).
In de LFP opnames uit de M1 kunnen twee spontaan afwisselende corticale synchronisatiestaten worden geïdentificeerd: de Activated State (AS) en de SWA-toestand (Slow Wave Activity) ( Figuur 3 ) 18 , 19 . Terwijl de SWA-staat wordt gedomineerd door hoge-amplitude trage oscillaties van ongeveer 1 Hz, wordt de AS gekenmerkt door snellere oscillaties met een lagere amplitude ( Figuur 3 ).
Figuur 1: Instellen van de Deep Brain Microwire Elektroden in een Standaard Stereotaxische Houder. Let op de tip scheiding tussen A, het elektrodepaar voor deSTN en B, het elektrodepaar voor de SNr in dorsoventrale richting van ca. 200 μm en anterioposterior richting van ca. 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Karakteristieke multi-eenheid activiteit van een Dorsoventral Electrode Trajectory De STN targeten. ( A ) Multi-unit opnames van de ventrale posteromediale thalamische kern (VPM), de zona incerta (ZI), de subthalamische kern (STN) en de substantia nigra pars reticularis (SNr). De VPM vertoont scherpe en onregelmatige afstandspieken met hoge amplitude. Dit patroon van spikes stopt bij het naderen van de ZI. Wanneer de elektrode de STN binnentreedt, is een typisch hoogfrequent brandpatroon met korte bursts met medium amplitudeUde kan waargenomen worden. De SNr kan worden geïdentificeerd door zijn hoge amplitude en regelmatige ontstekingspatroon. ( B) STN-trajecten die op beelden van een rat-stereotactische atlas 21 zijn geplaatst . Bovenste gedeelte: kroonvliegtuig. Onderdeel: Sagittal vlak. Let op het doorgeven van de elektrodepunt via VPM en ZI. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Cortische synchronisatiestaten in LFP-opnamen van de primaire motorcortex tijdens uraananesthesie. ( A ) Vertegenwoordiger 600 s LFP opname van de primaire motor cortex. Tijdperken met hoge frequentie, lage amplitude activiteit die overeenkomt met de Geactiveerde Staat (i) en tijdperken met een langzamer ritme en hoog De amplitude die overeenkomt met de trage golfactiviteitstoestand (ii) kan gedifferentieerd worden. ( B ) Het corresponderende tijdfrequentie plot over een interval van 600 s, waarin de 0-20 Hz relatieve vermogen van de LFP's gepresenteerd in (A) wordt weergegeven. Warmer kleuren geven een hogere relatieve kracht aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Sorteren van enkele eenheden uit STN Multi-unit Activity. ( A ) Driedimensionale weergave van eenheidsklusters in functieruimte na hoofdcomponentanalyse. Elke cluster vertegenwoordigt een vermoedelijke eenheid. ( B ) Spike waveforms en spike waveform gemiddelden die overeenkomen met de clusters in (A).0fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
| Coördinaten van Bregma | STN | SNr | M1 | Referentie 1 | Referentie 2 |
| anterior-posterior | -3,6 | -4.8 | +3.0 | -10.0 | -10.0 |
| mediaal-lateraal | 2,5 | 2,5 | +3.0 | +3.0 | -3.0 |
| dorsale-ventrale | -8.0 | na | na | na | na |
Tabel 1: Stereotaxische coördinaten voor de opname van de Hyperdirect CoRtico-basale ganglia weg. Alle punten worden gemeten van het bregma referentiepunt op de schedel in mm; Niet van toepassing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de onderhavige studie wordt aangetoond hoe u extracellulaire elektrofysiologische signalen tegelijkertijd op meerdere locaties van een bepaald netwerk opneemt met behulp van het hyperdirect cortico-basale ganglia-pad dat de M1 verbindt met de STN en SNr bij knaagdieren.
Een kritische stap in de opname van kleine subcortische structuren zoals de STN is de nauwkeurige begeleiding van de opnameelektroden in het doel. In de gepresenteerde methode zorgt er voor twee belangrijke stappen voor een hoge nauwkeurigheid van de targeting. Bij het bereiden van het dier in het stereotactische apparaat voordat de elektroden in de hersenen worden geïntroduceerd, is het absoluut verplicht om ervoor te zorgen dat de schedel in de "platte schedel" positie 22 wordt gebracht . Om de platte schedelpositie te bereiken wordt de positie van de incisorstaaf van het stereotactische frame veranderd tot de hoogten van de bregma- en lambda-referentiepunten oN de schedel zijn op hetzelfde dorsoventrale vlak 21 . Alleen door deze positie te verzekeren, kunnen coördinaten die in stereotactische atlassen worden gevonden, met hoge mate van nauwkeurigheid worden toegepast op het individuele laboratoriumdier, aangezien de atlassen zijn gebaseerd op de vlakke schedelpositie 21 . Ook bewijsmateriaal bewijst dat de nauwkeurigheid van de targeting met behulp van een geïndividualiseerde platte schedelpositie superieur is aan een vaste aanpassing van de snijbalk 23 . De positie van de opnameelektroden in het dorsoventrale vlak moet goed worden afgesteld door de multi-unit activiteit voortdurend te registreren. De verschillende kern- en witte materiaalkonstructies langs het elektrode traject tonen karakteristieke vuurpatronen ( Figuur 2 ), die gebruikt kan worden om de positie van de elektrode 9 , 20 te herstellen.
Een andere belangrijke stap in de gepresenteerde methode is de plaatsing van de rEferentieelektrode. In het gepresenteerde protocol werd een positie boven de cerebellaire cortex gekozen, omdat op dit punt de referentieelektrode de cortico-basale ganglia-activiteit niet detecteert die het centrale punt van de studie was. In studies met een interesse in analysemethoden die vatbaar zijn voor volume geleiding, dient een meer lokale referentie te worden aangenomen 5 .
Urethaan is een veelgebruikte verdoving voor het opnemen van neuronale extracellulaire potenties in dierlijk onderzoek 11 , 18 , 24 , 25 , 26 . De reden hiervoor is dat een enkele dosis urethaan een stabiele en langdurige narcose gedurende 8-12 uur kan produceren met slechts een beperkte depressie van de werking van het centrale zenuwstelsel in vergelijking met andere verdovingsmiddelen 27 . Echter, urethaan anesthesieA activeert ook het sympathische zenuwstelsel, wat kan leiden tot ongewenste bijwerkingen, zoals bijv. Hyperglycemie 27 . Door zijn langdurige werking en het ontbreken van een krachtig middel om het verdovingseffect te antagoniseren, moet urethaan niet worden gebruikt voor herhaalde experimenten die gescheiden zijn door uren of dagen. Als het is gepland om meerdere opnamesessies op hetzelfde dier te doen of als er een technische reden is om geen urethaan te gebruiken, dan kunnen anesthesie met isofluraan en injecties van geneesmiddelen zoals ketamine en xylazine redelijke alternatieven zijn voor elektrofysiologische in vivo experimenten 28 , 29 . Het nadeel van deze narcose-regimes is dat ze meer frequente monitoring en aanpassingen nodig hebben dan het gebruik van urethaan, door hun korte halveringstijd en de accumulatie van de drugs over de tijd. Verder is er bewijs dat urethaan minder kan interfereren met fysiologische b Regenactiviteit dan andere verdovingsmiddelen 30 .
Alle hierin gedetailleerde opnameomstandigheden bepalen kritisch hoe de verkregen data verder verwerkt en geanalyseerd kan worden. Daarom is het verplicht alle instellingen aan te passen aan de eisen van de geplande analyse stappen. Aangezien er veel opties zijn voor de analyse van multi-channel extracellulaire opnames, kan het gebruik van beschikbare open-source gereedschapskisten voordelig zijn 31 .
De opname van extracellulaire potenties in vivo is een methode die een unieke temporale en ruimtelijke resolutie van hersensignalen biedt die superieur zijn aan alternatieve methoden zoals functionele magnetische resonantiebeeldvorming en calciumbeeldvorming 5 . De gepresenteerde methode kan niet alleen worden toegepast op de opname van de hyperdirecte weg, maar kan gemakkelijk worden aangepast aan een verscheidenheid aan andere experimentele modellen en onderzoeksvragenF '> 24 , 32 , 33. Aangezien het stereotactische chirurgie betreft, zijn er veel onderzoeksinstellingen waar het niet kan worden toegepast en waar een niet-invasieve methode geselecteerd moet worden.
In de toekomst moet een combinatie van de gepresenteerde extracellulaire multi-site opname techniek met optogenetische gereedschappen worden gerealiseerd om ons begrip van de netwerkdisfunctie onderliggende neuropsychiatrische ziekten verder te verbeteren om nieuwe behandelingen te vinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), KFO 247, om onze studie te financieren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ag/AgCl custom epidural electrodes | Goodfellow GmbH D-61213 Bad Nauheim, Germany info@goodfellow.com |
Product-ID AG005127 for 99.99% silver wire | Ag/AgCl electrodes will allow for better signal quality, but may only be used in acute experiments. Possible replacement: Stainless steel electrodes |
| Stereotaxic holder with acrylic block | David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA |
Product ID Model 1770 Standard Electrode Holder | Make sure the acrylic block has recesses which suit the electrode setup for the desired target. Acrylic blocks can easily be modified with a file to obtain the desired configuration. Possible replacement: Self-constructed electrode holders |
| Tungsten microwire electrodes 1.5 MΩ impedance | Microprobes.com 18247-D Flower Hill Way Gaithersburg, Maryland, 20879 USA |
Product-ID WE3ST31.5A5-250um | The 1.5 MΩ is necessary to record MUA and LFP at the same time. Possible replacement: Microelectrodes of different materials can be used. The electrodes have to be straight, robust and as thin as possible. |
| Rat alignment tool | David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA |
Product ID Model 944 Rat Alignment Tool | Allows the exact orientation of the brain to match stereotaxic atlases. Possible replacement: Stereotaxic holder with a cannula |
| Two-component dental acrylic | Associated Dental Products Ltd. Kemdent Works, Purton, Swindon Wiltshire, SN5 4HT, United Kingdom |
Simplex Rapid Powder Clear 225g, Product code: ACR803; Simplex Rapid Liquid 150ml, Product code: ACR920 | Depending in the electrodes used, superglue might be an easy alternative, if the electrodes are small and lightweight. Possible replacement: Superglue (Cyanacrylate-based) |
| Faraday cage | Self-construction | A proper Faraday cage will be the best protection from electromagnetic artifacts, but everything which can be formed into a box shape or applied to a frame and is made of conductive material may help. Possible replacement: Aluminum foil or copper mesh | |
| Electrophysiological setup with recording software and online spike-sorting capabilities | OmniPlex® Neural Data Acquisition System Plexon Inc 6500 Greenville Avenue, Suite 700 Dallas, Texas 75206 USA |
Offline sorting software is a potential alternative, multiple scripts and softwares can be found for free in the open source community. |
References
- Lozano, A. M., Lipsman, N. Probing and regulating dysfunctional circuits using deep brain stimulation. Neuron. 77 (3), 406-424 (2013).
- Mathalon, D. H., Sohal, V. S. Neural Oscillations and Synchrony in Brain Dysfunction and Neuropsychiatric Disorders: It's About Time. JAMA Psychiatry. 72 (8), 840-844 (2015).
- Uhlhaas, P. J., Singer, W. Neuronal dynamics and neuropsychiatric disorders: toward a translational paradigm for dysfunctional large-scale networks. Neuron. 75 (6), 963-980 (2012).
- Buzsaki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).
- Buzsaki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
- Brazhnik, E., Novikov, N., McCoy, A. J., Cruz, A. V., Walters, J. R. Functional correlates of exaggerated oscillatory activity in basal ganglia output in hemiparkinsonian rats. Exp Neurol. 261, 563-577 (2014).
- Avila, I., et al. Beta frequency synchronization in basal ganglia output during rest and walk in a hemiparkinsonian rat. Exp Neurol. 221 (2), 307-319 (2010).
- Javor-Duray, B. N., et al. Early-onset cortico-cortical synchronization in the hemiparkinsonian rat model. J Neurophysiol. 113 (3), 925-936 (2015).
- Beck, M. H., et al. Short- and long-term dopamine depletion causes enhanced beta oscillations in the cortico-basal ganglia loop of parkinsonian rats. Exp Neurol. 286, 124-136 (2016).
- Magill, P. J., Bolam, J. P., Bevan, M. D. Relationship of activity in the subthalamic nucleus-globus pallidus network to cortical electroencephalogram. J Neurosci. 20 (2), 820-833 (2000).
- Magill, P. J., et al. Changes in functional connectivity within the rat striatopallidal axis during global brain activation in vivo. J Neurosci. 26 (23), 6318-6329 (2006).
- Brown, P. Abnormal oscillatory synchronisation in the motor system leads to impaired movement. Curr Opin Neurobiol. 17 (6), 656-664 (2007).
- Stein, E., Bar-Gad, I. beta oscillations in the cortico-basal ganglia loop during parkinsonism. Exp Neurol. 245, 52-59 (2013).
- Little, S., Brown, P. What brain signals are suitable for feedback control of deep brain stimulation in Parkinson's disease? Ann N Y Acad Sci. 1265, 9-24 (2012).
- Priori, A., Foffani, G., Rossi, L., Marceglia, S. Adaptive deep brain stimulation (aDBS) controlled by local field potential oscillations. Exp Neurol. , 77-86 (2013).
- Brozoski, T. J., Caspary, D. M., Bauer, C. A. Marking multi-channel silicon-substrate electrode recording sites using radiofrequency lesions. J Neurosci Methods. 150 (2), 185-191 (2006).
- Schjetnan, A. G., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. (56), (2011).
- Mallet, N., et al. Disrupted dopamine transmission and the emergence of exaggerated beta oscillations in subthalamic nucleus and cerebral cortex. J Neurosci. 28 (18), 4795-4806 (2008).
- Steriade, M. Corticothalamic resonance, states of vigilance and mentation. Neuroscience. 101 (2), 243-276 (2000).
- Maesawa, S., et al. Long-term stimulation of the subthalamic nucleus in hemiparkinsonian rats: neuroprotection of dopaminergic neurons. J Neurosurg. 100 (4), 679-687 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1998).
- Oliveira, L. M. O., Dimitrov, D. Methods for Neural Ensemble Recordings Frontiers in Neuroscience. Nicolelis, M. A. L. , (2008).
- Torres, E. M., et al. Increased efficacy of the 6-hydroxydopamine lesion of the median forebrain bundle in small rats, by modification of the stereotaxic coordinates. J Neurosci Methods. 200 (1), 29-35 (2011).
- Hadar, R., et al. Rats overexpressing the dopamine transporter display behavioral and neurobiological abnormalities with relevance to repetitive disorders. Sci Rep. 6, 39145 (2016).
- Parr-Brownlie, L. C., Poloskey, S. L., Bergstrom, D. A., Walters, J. R. Parafascicular thalamic nucleus activity in a rat model of Parkinson's disease. Exp Neurol. 217 (2), 269-281 (2009).
- Steriade, M., Nunez, A., Amzica, F. A novel slow (< 1 Hz) oscillation of neocortical neurons in vivo: depolarizing and hyperpolarizing components. J Neurosci. 13 (8), 3252-3265 (1993).
- Maggi, C. A., Meli, A. Suitability of urethane anesthesia for physiopharmacological investigations in various systems. Part 1: General considerations. Experientia. 42 (2), 109-114 (1986).
- Goldberg, J. A., Kats, S. S., Jaeger, D. Globus pallidus discharge is coincident with striatal activity during global slow wave activity in the rat. J Neurosci. 23 (31), 10058-10063 (2003).
- Karain, B., Xu, D., Bellone, J. A., Hartman, R. E., Shi, W. X. Rat globus pallidus neurons: functional classification and effects of dopamine depletion. Synapse. 69 (1), 41-51 (2015).
- Paasonen, J., et al. Comparison of seven different anesthesia protocols for nicotine pharmacologic magnetic resonance imaging in rat. Eur Neuropsychopharmacol. 26 (3), 518-531 (2016).
- Mahmud, M., Vassanelli, S. Processing and Analysis of Multichannel Extracellular Neuronal Signals: State-of-the-Art and Challenges. Front Neurosci. 10, 248 (2016).
- Hadar, R., et al. Altered neural oscillations and elevated dopamine levels in the reward pathway during alcohol relapse. Behav Brain Res. 316, 131-135 (2017).
- Voget, M., et al. Altered local field potential activity and serotonergic neurotransmission are further characteristics of the Flinders sensitive line rat model of depression. Behav Brain Res. 291, 299-305 (2015).
