Summary
במחקר זה, מתודולוגיה מוצג על איך לבצע באתר מרובה in vivo הקלטות אלקטרו מכיון hyperdirect תחת הרדמה urethane.
Abstract
עדות מתמשכת מראה כי מחלות נוירופסיכיאטריות רבות יש להבין כהפרעות של רשתות עצביות בקנה מידה גדול. כדי להבין טוב יותר את הבסיס הפאתופיסיולוגי של מחלות אלו, יש צורך לאפיין במדויק באיזו צורה מופרעת עיבוד המידע בין החלקים העצביים השונים של המעגל. באמצעות תאיים in vivo הקלטות אלקטרו, ניתן לתכנן במדויק את הפעילות העצבית בתוך הרשת העצבית. ליישום שיטה זו יש מספר יתרונות על פני טכניקות אלטרנטיביות, כגון הדמיה בתהודה מגנטית תפקודית ודמיון סידן, שכן היא מאפשרת רזולוציה זמנית ומרחבית ייחודית ואינה מסתמכת על אורגניזמים מהונדסים גנטית. עם זאת, השימוש תאיים בהקלטות vivo מוגבל שכן היא טכניקה פולשנית כי לא ניתן ליישם אוניברסלית. במאמר זה, שיטה פשוטה וקלה לשימוש מוצג wאשר ניתן בו זמנית לרשום פוטנציאלים תאיים כגון פוטנציאל שדה מקומי פעילות multunit במספר אתרים של רשת. זה מפורט כיצד מיקוד מדויק של גרעינים תת קליפתיים ניתן להשיג באמצעות שילוב של ניתוח stereotactic וניתוח מקוון של הקלטות יחידה רב. לפיכך, הוא הוכיח, איך רשת מלאה כגון hyperdirect cortico-basal לולאה הגרעינים ניתן ללמוד בחיות הרדים in vivo .
Introduction
עדויות המצטברות לאחרונה על הפרעות נוירופסיכיאטריות שונות כגון מחלת פרקינסון (PD) וסכיזופרניה מצביעות על כך שהפתופיזיולוגיה שלהם מבוססת על תפקוד לקוי של מעגלים עצביים מורחבים, שלעתים קרובות כרוכות במבנים קליפת המוח וקורטיקורטיקליים 1 , 2 , 3 . על פי תיאוריה זו, את הביטויים הקליניים של מחלות נובעות כתוצאה של יכולת עיבוד מידע לקוי של רשת של תאים במקום תאים בודדים או אלמנטים נוירונים ספציפיים 1 , 2 , 3 . על מנת להגביר את ההבנה של קבוצה מורכבת זו של מחלות נוירופסיכיאטריות ולמצוא אפשרויות טיפול חדשות, חובה לאפיין את הדינמיקה העצבית של הרשתות הנפרעות בחולים אנושיים ובמודלים בבעלי חיים בפירוט רב. מצויןשיטת ent ללמוד רשתות בקנה מידה גדול בנושאים חיים הוא אתר רב הקלטות אלקטרו של פוטנציאלים תאיים 4 . באמצעות שיטה זו, ניתן להעריך בו זמנית את הפוטנציאל השדה המקומי (LFPs), אשר מייצגים בעיקר את הסיכום הזמני של זרמים postsynaptic מעכב ופעילות רב יחידה (MUA), כי הוא שנוצר על ידי הפוטנציאל presynaptic 5 . ההקלטה של הפוטנציאלים תאיים יש מספר יתרונות על פני שיטות חלופיות ללמוד רשתות, למשל , הדמיה תפקודית תהודה מגנטית הדמיה סידן, כי זה מספק רזולוציה גבוהה יותר במרחב ובזמן כי זה לא תלוי אורגניזמים מהונדסים גנטית 5 . עם זאת, השימוש תאיים בהקלטות vivo מוגבל שכן היא טכניקה פולשנית כי לא ניתן ליישם אוניברסלית.
ב vivo electrophysiological recהסמכות יכולה להתבצע ער, כמו גם בחיות הרדים 6 . שתי השיטות מלווה יתרונות וחסרונות ספציפיים. מחקרים בבעלי חיים ער לאפשר הקלטה של אותות המוח במהלך הביצועים של משימות התנהגותיות מוגדרים, אבל נוטים התנועה הקשורים אחרים artifacts 7 , 8 . הקלטות בבעלי חיים מורדמים מצד שני מציעים את ההזדמנות להעריך LFPs ו MUA עם מינימום של artifacts ב מוגדרת מאוד סנכרון מדינות קליפת המוח, אבל התוצאות גם נבדלות במידה מסוימת מה ניתן למצוא בערים 9 , 10 , 11 .
בשנים האחרונות, הוכח כי הדגימה של LFPs שימושי במיוחד כדי להגדיר שינויים פתולוגיים של פעילות הרשת. דוגמה בולטת לכך היא מחקר על הפתופיזיולוגיה של PD בחולה האנושימודלים של s ושל בעלי חיים של המחלה, שם ניתן היה להראות כי תנודות בטא משופר בלולאה הגרעינים קורטיקלי הבסיס קשורות סימפטומים המנוע פרקינסוניאן 12 , 13 . כתוצאה של קו זה של המחקר, הוא נחקר כעת אם תנודות בטא יכול לשמש ביומרקר משוב מקוון עבור לולאה סגורה גירוי מוחי עמוק 14 , 15 .
במחקר הנוכחי, תיאור מפורט של אתר רב חריף in vivo הקלטות אלקטרו של LFPs ו MUA חולדות הרדים עם urethane מסופק. הוא הוכיח כיצד רשת שלמה, כגון מסלול ההישרדות הקורטיקלי-בסיסי של קורטיקו-קורטיקו, יכולה להיות מאופיינת באמצעות אלקטרודות באמצעות אלקטרודות סטנדרטיות ומותאמות אישית, וכיצד ניתן לבנות אלקטרודות אלו. זה מודגש במיוחד כיצד מיקוד מדויק של גרעיני הגרעיני הבסיס יכול להיות מושגת על ידי שיתוףMbining ניתוח stereotactic יחד עם רישום מקוון של MUAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
נהלי הניסוי נערכו בהתאם לחוק רווחת בעלי חיים בגרמניה (מתוקן לאחרונה בשנת 2014) והתקנות האירופיות (2010/63 / EU). הניסויים אושרו על ידי רשות רווחת בעלי החיים המקומית (LaGeSo, Berlin), ועמדו בקריטריונים המקומיים ובהנחיות הבינלאומיות.
הערה: בשיטה המוצגת שני דגמים של אלקטרודות משמשים להקליט את מסלול הגנגליונים הבסיסי הקורטיקלי-בסיסי, המחבר את הקורטקס המוטורי הראשוני (M1) עם הגרעין התת-למי (STN) וה- nicra pars reticulate (SNR). עבור epidural electrocorticogram (ECoG) הקלטות מ M1 בהתאמה אישית עכבה נמוכה אלקטרודות Ag / AgCl משמשים. ההקלטות של STN ו SNR מבוצעות עם אלקטרודות טונגסטן אלקטרודות גבוהה זמינים מסחרית.
1. בניית Epidural Ag / AgCl Epidural אלקטרודות
- קח בערך. 5 ס"מ רצועת ארוכה של 99.99% כסף כסף טהור עם diameteR של 200 מיקרומטר ולהסיר ציפוי כלשהו במידת הצורך.
- החזק את קצה חוט עם קצה כלפי מטה לתוך להבה של מצית או נר עד קצה מתחיל להמיס. המתן עד קצה הוא בצורת כדור יש בקוטר של כ 1 מ"מ. חותכים את האלקטרודה preformed באורך כולל של 15 מ"מ מתחילת הכדור בצורת בצורת קצה חוט.
- הלחמה מחבר דיוק אל קצה חוט, אשר מתאים למערכת הקלטת אלקטרו אלקטרונית בשימוש. מכסים את נקודת ההלחמה מסוף חוט אל המחבר עם לכה כסף מוליך. זה עוזר מוליכות ותוצאות באיכות אות טובה יותר.
- לאחר לכה מוליך יש יבשים, לכסות את נקודת הלחמה עם 3 מ"מ ל 1 מ"מ חום מתכווץ צינור. בזהירות להשתמש פטיש השען כדי לשטח את הכדור בצורת טיפ חצי עובי.
- ללבוש כפפות בדיקה ולקחת מטלית ניקוי ללא מוך עם אתנול 100% כדי להסיר כל לכלוך ושומן.
- הכנס את האלקטרודות פנימהצינור צנטריפוגה 15 מ"ל או צינור תרבות התא ולמלא אותו עם אקונומיקה כלור הבית (זהירות, המכיל 2.8 גרם של hypochloride נתרן לכל 100 גרם ממס) עד עצה בצורת כדור מכוסה לחלוטין.
זהירות: כלור אקונומיקה הוא קורוזיבי; פעל תמיד לפי הוראות הבטיחות של היצרן. - קח את האלקטרודות החוצה לאחר 23 דקות לשטוף אותם בנדיבות עם מים מזוקקים. יישום מוצלח של שכבת כלוריד כסף מופיע שינוי בצבע סגול הומוגנית.
- יבש באוויר. לאחר יבש לחלוטין, לקחת את האלקטרודות עם פינצטה בסדר. בעזרת מכחול דק, החלת בידוד חשמלי נוזלי. התחל על חוט ישירות מאחורי קצה האלקטרודה לכסות את הכל עד החום מתכווץ צינור. בואו בידוד יבש לפחות 2 שעות.
- עבור בקרת איכות, לבצע בדיקה של מוליכות חשמלית עם multimeter. אם זמין, לבצע בדיקות עכבה ב 1 קילוהרץ באמצעות מטר עכבה המתאים, בעוד האלקטרודה ואת הבדיקהבדיקה הם להרכיב 0.9% NaCl המכיל H 2 O פתרון מבלי לגעת זה בזה. ערכי עכבה ב 1 קילוהרץ צריך להיות בערך 8 kΩ.
2. הרכבה של האלקטרודות למחזיק stereotaxic
הערה: כדי להקליט MUA ו LFPs בו זמנית, להשתמש אלקטרודות טונגסטן microwire עם עכבה של 1.5 MΩ. אם המוקד של הקלטות הוא על הקלטות באיכות גבוהה של יחידות בודדות, לבחור microwire אלקטרודות עם עכבה גבוהה (> 5 MΩ). אם מטרת המחקר מכוונת אך ורק LFPs, אלקטרודות עם עכבות נמוכות יותר יכול להיות מקובל. עבור מבנים קטנים, אשר התאמות stereotaxic dorsoventral הם נחוצים לעתים קרובות, להשתמש זוגות של אלקטרודות עם הפרדת קצה dorsoventral מתאים (במקרה זה 250 מיקרומטר). יתר על כן, זה מספק את היתרון של אלקטרודה התייחסות מקומית יותר, במידת הצורך. הקואורדינטות stereotaxic נמדדים תמיד מן האלקטרודה lowermost ומחדש מחושב ביחס לגרגמה.
- קח מחזיק אלקטרודה סטראוטיאקסיק סטנדרטי עם בלוק אקרילי ו מהדק והניח אותו בצורה מאובטחת על משטח שטוח בשדה הראייה של מיקרוסקופ כירורגי.
- ברפרוף לתקן את זוג הראשון של אלקטרודות לחסום אקריליק של בעל עם חתיכות של סרט דבק (3 מ"מ x 8 מ"מ) באמצעות פינצטה בסדר. האלקטרודות צריך לבלוט את הבלוק אקריליק כ. 12 מ"מ.
- בזהירות לתקן את האלקטרודה דו קוטבית השני ליד האלקטרודה הראשונה. עבור מיקוד המבנים של מסלול hyperdirect, המרחק צריך להיות 2 מ"מ ( איור 1 ). עבור רוב מחזיקי אלקטרודה stereotaxic סטנדרטי, זה ההפסקה הסמוכה. השתמש מד caliper כדי לאמת. רשתות שונות ניתן לגשת באותה דרך. לשם כך, בלוק אקריליק עשוי להיות פנה במידה מסוימת.
- התאם את זוג השני של האלקטרודות על ידי הזזה זה בזהירות למיקום, שבו קצה הגחון ביותר הוא כ 200Μm הפסקה לעומת האלקטרודה הראשונה ( איור 1 ). לעשות זאת תחת ראייה מיקרוסקופית. לשם כך, השתמש צינורית 30 G (קוטר חיצוני 300 מיקרומטר) כדי להעריך טוב יותר את המרחק.
- לחץ על סרט הדבקה, ולאחר מכן מאובטח עם מהדק מתכת של בעל.
3. ניתוח
- עבור הקלטות אלקטרו, השתמש urethane (זהירות) עבור הרדמה.
זהירות: Urethane הוא רעיל ומסרטן, ולכן תמיד לדבוק תקנות הבטיחות ואת גיליון הנתונים שניתנו על ידי היצרן של החומר. - הכן פתרון של 200 מ"ג / מ"ל urethane ב 0.9% NaCl תמיסת מלח רפואי.
- ניהול כולל של 1.3 גרם / ק"ג משקל גוף urethane intraperitoneally (IP). בהתאם זן חולדה זה יכול להיות סביר לפצל את המינון לתוך שתי מנות עם מרווח 15 דקות בין הזריקות על מנת לשפר את הבטיחות של הרדמה.
- בדוק את עומק ההרדמה באמצעות pרפלקס רפלקס רפלקס ורפלקסים מתאימים אחרים. אם ההרדמה אינה עמוקה מספיק כדי לבצע ניתוח, להזריק 0.15 גרם / ק"ג bodyweight של Eurethane IP לחכות עוד 15 דקות.
- החל משחה לעין כדי למנוע התייבשות הקרנית.
- עקוב באופן קבוע את קצב הנשימה ואת רפלקס הנסיגה רפלקס במהלך הרדמה. השתמש כרית חימום חיה קטנה עם בקרת טמפרטורה כדי להבטיח טמפרטורת הגוף הפיזיולוגי נשמר לאורך כל הניתוח. לפני תחילת הקלטות אלקטרו, שינוי אלטרנטיבה חשמלית ( למשל, כרית נתרן אצטט הראש).
- לגלח את הפרווה לצד הצד הגבי של הראש כדי להשיג שדה כירורגי נקי. לחטא סביב אתר החתך עם חיטוי כירורגי המתאים. תקן את החיה במסגרת stereotactic.
- לבצע חתך ארוך 2 ס"מ של הקרקפת בכיוון sagittal עם אזמל. השתמש אזמל כדי לגרד מעט את aponeurosis הגולגולת לחטא את הגולגולת. השתמש במשותףטבל ניצנים ספוגים 3% H 2 O 2 כדי להסיר את כל הרקמה שנותרה.
- השתמש electrocauter או thermocauter כדי לשלוט דימום, במידת הצורך. עצור דימום מן העצם הגולגולת ואת hypoderm, אם הדימום לא מפסיק באופן ספונטני לאחר 1-2 דקות מעכב את הראייה על הגולגולת.
- כווננו את סרגל החותך עד שהראש ממוקם בתנוחת גולגולת שטוחה, מה שאומר שבגמבה ולמבדה נקודות ייחוס סטריאוטקסיות נמצאות באותו מישור. זה הכי חשוב להשיג דיוק כירורגי גבוהה. השתמש סטנדרטי תקן stereotaxic יישור הכלי, לכייל את קצה המיועד לגרגר תחת ראייה מיקרוסקופית ולהתאים את סרגל החותך עד הנקודות המיועד עבור ברגמה למבדה על הכלי לגעת הגולגולת באותו זמן.
הערה: מבט מצד אחד עם אור ממוקד מהאחר עשוי לסייע בקביעת מצב זה. לחלופין, לקחת בעל stereotaxic עם צינורית בסדר ולמדוד את הקואורדינטות dorsoventral של Bregma אNd lambda תחת ראייה מיקרוסקופית. התאם את סרגל החותך עד הקואורדינטות dorsoventral של Bregma ו למבדה זהים. - השתמש בעל stereotaxic עם צינורית, לכייל את הגרגמה ולאחר מכן לחשב את המיקום של כל חורי המקדחה על הגולגולת. באמצעות מחזיק stereotaxic, לסמן את המיקום של החורים להיות קדח או על ידי בזהירות לגרד את הגולגולת או באמצעות סמן צבע כירורגי. הקואורדינטות של זה תלוי במטרות, קואורדינטות עם התייחסות לגרגמה ניתנות עבור מסלול hyperdirect בטבלה 1 , כולל הקואורדינטות הציע עבור אלקטרודות התייחסות cerebellar.
- באמצעות microdrill בזהירות לקדוח את כל החורים. עבור STN ו SNR, לקדוח חור משותף (כ 2 מ"מ x 3 מ"מ גודל). כל חורים לקדוח אחרים צריך להיות בקוטר של 1 מ"מ.
- קח שני cannulas בסדר (לפחות 27 G) ו לכופף את העצות שלהם כדי ליצור צורה מכור, באמצעות משטח קשה או פינצטה. השתמש אלה כדי להסיר כל debriS מתוך חורי המקדחה, בזהירות לחתוך ולהסיר את dater mater ב STN משותף / חור SNR.
- לשטוף את חורי המקדח עם מלוחים פיזיולוגיים. החל טיפת מלוחים פיזיולוגיים כל 15 דקות לחורים לקדוח כדי למנוע את המוח ואת דורה מ ייבוש החוצה.
- קח microdrill ו התאמת נירוסטה בורג מיקרו בורג ( למשל ב 1.2 מ"מ x 2 מ"מ בורג), לקדוח חור בורג מיקרו בורג בין חורי המקדח של האלקטרודות epidural התייחסות מעל המוח הקטן, לעשות את אותו הדבר עבור M1 epidural אלקטרודות.
- השקופית עצמית Ag / AgCl epidural בנוי אלקטרודות לתוך חורי המקדח עבור האלקטרודות התייחסות אלקטרודות M1. מדריך את קצה האלקטרודה עם פינצטה בסדר להחליק אותו ישירות מתחת לעצם הגולגולת לתוך חור המקדח.
- תקן את כל האלקטרודות אפידורל עם שני רכיב אקריליק שיניים. הקפד לא לכסות את נקודת ברגמה ולא להשפיע על חור STN / SNR רגיל.
- הכנס את בעל מוכן עם אלקטרודות טונגסטן microwireEs לתוך מסגרת stereotaxic.
- לכייל את האלקטרודה הגחון ביותר, אשר מיועד למקד את STN, על הגרגמה. התאם את המיקום מחושב מעל החור STN / SNR משותף ולהוריד את האלקטרודות למטה אל המוח תחת ראייה מיקרוסקופית. ודא כי האלקטרודות טונגסטן microwire ללכת בתוך המוח בצורה חלקה.
4. מיפוי והקלטות אלקטרו-מכאניות
הערה: עבור שלב זה, כלוב Faraday ומערכת הקלטה רב ערוצית עם מערכת הקלטה עם יכולת סינון מקוון ומיון ספייק מקוון הוא הכרחי. רצוי להשתמש במערכת שעובדת עם preamplifier ממוקם ליד ראש החיות כדי לשמור על רעש חשמלי חפצים לכל היותר מינימום מוחלט. מלבד אלקטרודות טונגסטן microwire, לפחות אחד epidural ואחד אלקטרודה התייחסות נדרשים לבצע הקלטות של מסלול hyperdirect. מומלץ להכניס את האפידורל ואת הפניהאלקטרודות e זוג ללא נוגע זה בזה, זה עוזר במקרה של תקלה ומאפשר סוגים שונים של התייחסות לנתח נתונים.
- שים כלוב פאראדיי נייד מעל המסגרת stereotaxic. אם רק כלוב Faraday נייח זמין, בזהירות להעביר את המסגרת stereotaxic לתוך הכלוב Faraday תוך הקפדה על אלקטרודות המוח עמוק לא יורדים לתוך המוח עד מסגרת stereotaxic נמצאת בעמדה הסופית שלה.
- חבר את האלקטרודות אל headstage של ההתקנה electrophysiological. ודא אלקטרודות התייחסות מחוברים ערוצי התייחסות מתאימה.
- הגדרת תוכנת ההקלטה: מסנן Bandpass (0.05-8,000 הרץ) ולהגדיל (לזכות 1,500-2,000x) אות הנתונים הגולמיים. השתמש באינטרנט LFP ומסנן ספייק עם ההגדרות המתאימות (bandpass מסנן 0.05-250 הרץ עבור LFPs, bandpass מסנן 300-8000 הרץ עבור MUA). עבור כל המסננים, השתמש במסנן מסוג butterworth.
- הגדרת סף ספייק, אם רלוונטי, עבור onlinמיון מיון. רוב תוכנת ההקלטה מאפשרת הגדרת סף ספייק, שהוא ערך משרעת שמעליה מסומן האות כקפיצה על ידי התוכנה. סף זה יכול להיקבע מתמטית כגורם או סטיית תקן של המשרעת הממוצעת של האות ספייק מסונן, או עדיף ניתן לקבוע על ידי בדיקה ויזואלית של קטעים נתונים <500 ms ולהגדיר בתור מעל רעש האות גרפי ממשק משתמש.
הערה: הכוונה בהקמת סף ספייק היא לספור קוצים ומיין יחידות על מנת לספק מידע על כמה נוירונים נרשמים כיום וכיצד הקוצים שלהם מעוצבים. - לאט לאט להוריד את האלקטרודות microwire טונגסטן עד 1 מ"מ הגבי של היעד, אשר STN עבור מסלול hyperdirect. המתן שהאות יתייצב במידת הצורך.
- עבור מיפוי electrophysiological, לקדם את האלקטרודות ventrally במדרגות של 100 מיקרומטר. בכל שלב, להעריך את דפוס הירי, ירי rאכלו וצורה של קוצים. השווה אלה עם דוגמאות טיפוסיות הנתון באיור 2 . בדרך כלל, גרעינים צפופים להראות מהירה וממושכת spiking על כמה צעדים dorsoventral, ואילו מבנים עשירים בסיבים להראות שיעורי ירי נמוכים פחות פעילות ספייק הומוגני בצעדים הגחון הבאים.
- עבור מסלול hyperdirect, ודא כי האלקטרודה הגחון ביותר הוא בתוך STN.
הערה: STN הוא הגיע כאשר עלייה משמעותית MUA מזוהה הגחון של incerta זונה. הגחון STN, spiking מפסיק כמעט לחלוטין, כי האלקטרודה הגיעה הקפסולה הפנימית. כאשר האלקטרודה הגחון ביותר הוא STN, את התצורה של microelectrodes טונגסטן מבטיח האחורי, האלקטרודה השנייה היא SNR. ייתכן שיש צורך לכוונן עדין במינונים קטנים כדי להקליט MUA טיפוסי ב- STN ו- SNR בו-זמנית. שים לב כי תדירות MUA תלוי במספר הנוירונים נרשמה בפועל על המוח ברמההַפעָלָה. - לאחר האלקטרודות הן במבנים הרצויים, להגדיר סינון מקוון מיון ספייק (ראה איור 4 ), ולאחר מכן להתחיל את ההקלטה של הנתונים. דוגמאות אופייניות עבור מדינות שונות סנכרון קליפת המוח, כי ניתן לזהות את הקלטות LFP מוצגים באיור 3 .
5. סוף הניסוי
- כאשר הקלטות נעשות, לאט להרים את האלקטרודות מתוך המוח מיידי לשטוף אותם עם מלוחים פיזיולוגיים. את האלקטרודות ניתן לעשות בה שימוש חוזר לאחר שטיפה יסודית ובדיקה ויזואלית. פריקה אלקטרודות לכופף.
- להרדים את החיות על ידי הזרקת IP של מנת יתר של urethane (2.5 גרם / ק"ג bodyweight).
הערה: Urethane צריך לשמש רק עבור ההליכים הסופיים. - אם אימות היסטולוגית של עמדת האלקטרודה או הליכים אחרים מכתים היסטולוגית נדרש, להסיר את המוח מן הגולגולת ולעבד אתרקמות כראוי.
הערה: בהתאם לשיטות מכתים המיועד, זלוף transcardial עשוי להיות נחוץ. לאימות שלאחר המוות של עמדת האלקטרודה, מכתים ניסל סטנדרטי מספיק ברוב המקרים כדי לדמיין את מסלול האלקטרודה למשל קטעים במוח העטרה. גישות נוספות כדי להקל על היעד היעד היסטולוגית כוללים את השימוש נגעים המושרה חשמלית לרקמת המוח על ידי החלת זרם חשמלי באמצעות אלקטרודות ההקלטה או את היישום של צבע biocompatible לפני הכניסה אלקטרודה 16 , 17 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עם זאת משמש הקלטה אלקטרודות, אפשר לדגימה LFPs מן הקורטקס המוטורי העיקרי, הגרעין subthalamic ואת reiculata ניגריה פטרייתיות ו MUA מן STN ו SNR. בתחילה, LFP והפעילות מרובת היחידות נרשמות יחד באות של פס רחב. לאחר מכן, LFPs ו MUAs מופרדים על ידי מסננים bandpass (0.05-250 הרץ עבור LFPs ו 300-4000 הרץ עבור MUA).
עבור המיקוד הנכון של גרעינים תת-קורטיקליים, במיוחד של מבנים קטנים כגון STN, יש יתרון ליישר את הקואורדינטות הסטראוטיות המתוכננות עם אות MUA שהוקלט באופן מקוון. עבור מסלול אלקטרודה מיקוד STN מאפיין MUA האופייני ניתן להקליט ( איור 2 ) 9 , 20 .
בשלבים מאוחרים יותר של הניתוח, זהלעתים קרובות חובה להגדיר יחידות בודדות מפעילות רב יחידה על ידי ניתוח רכיב עיקרי ( איור 4 ).
ב LFP הקלטות מ M1 שני באופן ספונטני לסירוגין סינכרון קליפת המוח מדינות ניתן לזהות: המדינה המופעל (AS) ואת פעילות גלי איטי (SWA) המדינה ( איור 3 ) 18 , 19 . בעוד המדינה SWA נשלטת על ידי תנודות איטי משרעת גבוהה של כ 1 הרץ, AS מאופיין תנודות מהר עם משרעת נמוכה יותר ( איור 3 ).
איור 1: הגדרת של המוח עמוק microwire אלקטרודות ב stereotaxic מחזיק סטנדרטי. הערה ההפרדה עצה בין, זוג האלקטרודה עבורSTN, ו- B, זוג האלקטרודה עבור SNR בכיוון dorsoventral של כ. 200 מיקרומטר כיוון anterioposterior של כ. 2 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: פעילות מאופיינת ביחידה רב-תכליתית ממסלול אלקטרודה דורסוונטרל המכוון את STN. ( A ) הקלטות יחידות מרובות של גרעין התלמוס הגחון (VPM), ה- incerta zona, הגרעין התת-ממדי (STN) וה- nigra pars rticularis (SNR). ה- VPM מציג מדללים חריגים ולא סדירים במרווחים משרדיים גבוהים. דפוס זה של קוצים מפסיק כאשר מתקרבים ZI. כאשר האלקטרודה נכנסת STN טיפוסית דפוס תדר בתדירות גבוהה עם התפרצויות קצרות עם בינוני amplitUde ניתן לצפות. SNR יכול להיות מזוהה על ידי משרעת גבוהה שלה דפוס הירי הרגיל. ( ב) STN- מסלולים על גבי תמונות על אטלס stereotactic עכברוש 21 . חלק עליון: מטוס העטרה. החלק התחתון: המטוס sagittal. הערה עובר את קצה האלקטרודה דרך VPM ו- ZI. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. קורטיקלי סינכרון מדינות LFP הקלטות מ קליפת המוח העיקרי במהלך ההרדמה Urethane. ( א ) נציג 600 s LFP הקלטה של קליפת המוח העיקרי. תקופות זמן עם תדירות גבוהה, פעילות משרעת נמוכה התואמת את מצב מופעל (i) ואת תקופות הזמן עם קצב איטי גבוה משרעת er המתאימה למצב איטי פעילות גל (ii) יכול להיות מובחן. ( ב ) המקביל תדירות על פני תקופה על פני מרווח של 600 s הממחישות את הכוח 0-20 Hz היחסי של LFPs שהוצגו (א). צבעים חמים מצביעים על עוצמה יחסית גבוהה יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: מיון יחידות בודדות מפעילות STN מרובת יחידות. ( א ) תצוגה תלת מימדי של אשכולות יחידה בחלל תכונה לאחר ניתוח רכיב ראשי. כל אשכול מייצג יחידה אחת משוערת. ( B ) גלי ספייק ממוצעים wave wave ממוצעים המתאימים אשכולות ב (א).0fig4large.jpg "target =" _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
| קואורדינטות מ Bregma | STN | SNR | M1 | הפניה 1 | הפניה 2 |
| קדמי-אחורי | -3.6 | -4.8 | +3.0 | -10.0 | -10.0 |
| מדיאלי-לרוחב | +2.5 | +2.5 | +3.0 | +3.0 | -3.0 |
| הגבי - הגחון | -8.0 | נה | נה | נה | נה |
טבלה 1: קואורדינטות Stereotaxic להקלטת שיתוף HyperdirectRtico-basal גנגליה נתיב. כל הנקודות נמדדות מנקודת הייחוס של הגרגמה על הגולגולת ב- mm; Na - לא ישים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר הנוכחי, השיטה מדגימה כיצד להקליט אותות אלקטרו-סיביים תאיים בו-זמנית מאתרים מרובים של רשת נתונה, תוך שימוש בדוגמה של מסלול הגרעינים הקורטיקו-ביסאלי המהיר המחבר את ה- M1 עם ה- STN ו- SNR במכרסמים.
צעד קריטי בהקלטה של מבנים תת-קליניים קטנים כגון STN הוא ההכנסה המודרכת במדויק של אלקטרודות ההקלטה אל המטרה. בשיטה המוצגת, טיפול בשני שלבים מכריעים מבטיח דיוק גבוה של המיקוד. כאשר מכינים את החיה במנגנון stereotactic לפני האלקטרודות הם הציגו לתוך המוח, זה בהחלט חובה לוודא כי הגולגולת מובא לתוך "גולגולת שטוחה" עמדה 22 . כדי להשיג את המיקום הגולגולת שטוח, את המיקום של סרגל חותך של מסגרת stereotactic משתנה עד לגבהים של ברגמה ולמדה נקודות התייחסות oN הגולגולת נמצאים באותו מטוס dorsoventral 21 . רק על ידי הבטחת עמדה זו, קואורדינטות שנמצאו אטלסים stereotactic ניתן ליישם עם רמה גבוהה של דיוק החיה המעבדה הפרט, מאז אטלסים מבוססים על עמדת הגולגולת שטוח 21 . כמו כן, הראיות הניסוי מוכיח כי דיוק המיקוד באמצעות מיקום גולגולת שטוחה אישית עדיף על התאמה קבועה של סרגל החותך 23 . המיקום של האלקטרודות הקלטה במישור dorsoventral צריך להיות מכוון היטב על ידי רישום מתמיד של פעילות יחידה מרובת. הגרעינים השונים מבנים חומר לבן לאורך מסלול אלקטרודה להראות דפוסים אופייניים אש ( איור 2 ), אשר ניתן להשתמש בהם כדי להתאים מחדש את המיקום של האלקטרודה 9 , 20 .
צעד חשוב נוסף בשיטה המוצגת הוא המיקום של rאלקטרודת האספקה. בפרוטוקול המוצג, נבחרה עמדה מעל קליפת המוח cerexellar, כי בשלב זה האלקטרודה התייחסות אינו מזהה את פעילות הגרעינים הבסיס קורטיקו, שהיה נקודת המרכזי של המחקר. במחקרים עם עניין בשיטות ניתוח רגישים הולכה נפח התייחסות מקומית יותר צריך להיות מועדף 5 .
Urethane הוא הרדמה בשימוש נרחב להקלטת הפוטנציאלים תאיים נוירונים במחקר בבעלי חיים 11 , 18 , 24 , 25 , 2 6 . הסיבה לכך היא כי מנה אחת של urethane יכול לייצר יציבה ויציבה ארוכת טווח עבור 8-12 שעות עם רק דיכאון מוגבל של מערכת העצבים המרכזית לעומת הרדמה אחרים 27 . עם זאת, הרדמה urethaneגם מפעיל את מערכת העצבים הסימפתטית, אשר עלולה לגרום לתופעות לוואי לא רצויות כגון היפרגליקמיה 27 למשל . בשל פעילות ממושכת שלה וחוסר סמים חזק כדי להרגיז את השפעת ההרדמה שלה, urethane לא צריך לשמש ניסויים חוזרים כי מופרדים על ידי שעות או ימים. אם זה מתוכנן לעשות מספר הפעלות הקלטה על בעל חיים זהה או אם יש סיבה טכנית לא להשתמש urethane, אז הרדמה גז עם isoflurane וזריקות של תרופות כגון קטמין ו xylazine יכול להיות חלופות סבירות עבור אלקטרופיזיולוגיים בניסויים vivo 28 , 29 . החיסרון של משטרי הסמים האלה הוא שהם דורשים ניטור והתאמה תכופים יותר משימוש באורטאן, בגלל מחצית חייהם הקצרה והצטברות התרופות לאורך זמן. יתר על כן, יש ראיות כי urethane עלול להפריע פחות עם פיזיולוגי ב פעילות הגשם לעומת הרדמה אחרת.
כל תנאי ההקלטה המפורטים כאן קובעים באופן ביקורתי כיצד הנתונים המתקבלים ניתנים לעיבוד נוסף ונותחו באופן לא מקוון, ולכן חובה להתאים את כל ההגדרות לדרישות של צעדי הניתוח המתוכננים. מאחר שישנן אפשרויות רבות לניתוח של הקלטות תאיים רב ערוציים, השימוש בקבצי קוד פתוח זמין יכול להיות יתרון 31 .
ההקלטה של הפוטנציאלים תאיים in vivo היא שיטה המציעה רזולוציה ייחודית ומרחבית ייחודית של אותות המוח כי הוא מעולה על שיטות חלופיות כגון הדמיה תפקודית מגנטית הדמיה סידן הדמיה 5 . השיטה המוצגת לא יכולה להיות מיושמת רק על ההקלטה של מסלול hyperdirect, אבל יכול להיות מותאם בקלות למגוון של מודלים ניסיוניים אחרים שאלות המחקרF "> 24 , 32 , 33 אולם, מאחר ומדובר בניתוח סטריאוטקטי, קיימות הגדרות מחקר רבות שבהן לא ניתן ליישם אותן, ובמקרים בהם יש לבחור שיטה לא פולשנית.
בעתיד, שילוב של הטכניקה המוצגת באתר רב תאגידי רב-תכליתי עם כלים optogenetic צריך להתממש כדי לשפר עוד יותר את ההבנה שלנו של תפקוד לקוי של הרשת בבסיס מחלות נוירופסיכיאטריות שונות על מנת למצוא טיפולים חדשים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים ל- Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), KFO 247, על מימון המחקר שלנו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ag/AgCl custom epidural electrodes | Goodfellow GmbH D-61213 Bad Nauheim, Germany info@goodfellow.com |
Product-ID AG005127 for 99.99% silver wire | Ag/AgCl electrodes will allow for better signal quality, but may only be used in acute experiments. Possible replacement: Stainless steel electrodes |
| Stereotaxic holder with acrylic block | David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA |
Product ID Model 1770 Standard Electrode Holder | Make sure the acrylic block has recesses which suit the electrode setup for the desired target. Acrylic blocks can easily be modified with a file to obtain the desired configuration. Possible replacement: Self-constructed electrode holders |
| Tungsten microwire electrodes 1.5 MΩ impedance | Microprobes.com 18247-D Flower Hill Way Gaithersburg, Maryland, 20879 USA |
Product-ID WE3ST31.5A5-250um | The 1.5 MΩ is necessary to record MUA and LFP at the same time. Possible replacement: Microelectrodes of different materials can be used. The electrodes have to be straight, robust and as thin as possible. |
| Rat alignment tool | David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA |
Product ID Model 944 Rat Alignment Tool | Allows the exact orientation of the brain to match stereotaxic atlases. Possible replacement: Stereotaxic holder with a cannula |
| Two-component dental acrylic | Associated Dental Products Ltd. Kemdent Works, Purton, Swindon Wiltshire, SN5 4HT, United Kingdom |
Simplex Rapid Powder Clear 225g, Product code: ACR803; Simplex Rapid Liquid 150ml, Product code: ACR920 | Depending in the electrodes used, superglue might be an easy alternative, if the electrodes are small and lightweight. Possible replacement: Superglue (Cyanacrylate-based) |
| Faraday cage | Self-construction | A proper Faraday cage will be the best protection from electromagnetic artifacts, but everything which can be formed into a box shape or applied to a frame and is made of conductive material may help. Possible replacement: Aluminum foil or copper mesh | |
| Electrophysiological setup with recording software and online spike-sorting capabilities | OmniPlex® Neural Data Acquisition System Plexon Inc 6500 Greenville Avenue, Suite 700 Dallas, Texas 75206 USA |
Offline sorting software is a potential alternative, multiple scripts and softwares can be found for free in the open source community. |
References
- Lozano, A. M., Lipsman, N. Probing and regulating dysfunctional circuits using deep brain stimulation. Neuron. 77 (3), 406-424 (2013).
- Mathalon, D. H., Sohal, V. S. Neural Oscillations and Synchrony in Brain Dysfunction and Neuropsychiatric Disorders: It's About Time. JAMA Psychiatry. 72 (8), 840-844 (2015).
- Uhlhaas, P. J., Singer, W. Neuronal dynamics and neuropsychiatric disorders: toward a translational paradigm for dysfunctional large-scale networks. Neuron. 75 (6), 963-980 (2012).
- Buzsaki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).
- Buzsaki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
- Brazhnik, E., Novikov, N., McCoy, A. J., Cruz, A. V., Walters, J. R. Functional correlates of exaggerated oscillatory activity in basal ganglia output in hemiparkinsonian rats. Exp Neurol. 261, 563-577 (2014).
- Avila, I., et al. Beta frequency synchronization in basal ganglia output during rest and walk in a hemiparkinsonian rat. Exp Neurol. 221 (2), 307-319 (2010).
- Javor-Duray, B. N., et al. Early-onset cortico-cortical synchronization in the hemiparkinsonian rat model. J Neurophysiol. 113 (3), 925-936 (2015).
- Beck, M. H., et al. Short- and long-term dopamine depletion causes enhanced beta oscillations in the cortico-basal ganglia loop of parkinsonian rats. Exp Neurol. 286, 124-136 (2016).
- Magill, P. J., Bolam, J. P., Bevan, M. D. Relationship of activity in the subthalamic nucleus-globus pallidus network to cortical electroencephalogram. J Neurosci. 20 (2), 820-833 (2000).
- Magill, P. J., et al. Changes in functional connectivity within the rat striatopallidal axis during global brain activation in vivo. J Neurosci. 26 (23), 6318-6329 (2006).
- Brown, P. Abnormal oscillatory synchronisation in the motor system leads to impaired movement. Curr Opin Neurobiol. 17 (6), 656-664 (2007).
- Stein, E., Bar-Gad, I. beta oscillations in the cortico-basal ganglia loop during parkinsonism. Exp Neurol. 245, 52-59 (2013).
- Little, S., Brown, P. What brain signals are suitable for feedback control of deep brain stimulation in Parkinson's disease? Ann N Y Acad Sci. 1265, 9-24 (2012).
- Priori, A., Foffani, G., Rossi, L., Marceglia, S. Adaptive deep brain stimulation (aDBS) controlled by local field potential oscillations. Exp Neurol. , 77-86 (2013).
- Brozoski, T. J., Caspary, D. M., Bauer, C. A. Marking multi-channel silicon-substrate electrode recording sites using radiofrequency lesions. J Neurosci Methods. 150 (2), 185-191 (2006).
- Schjetnan, A. G., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. (56), (2011).
- Mallet, N., et al. Disrupted dopamine transmission and the emergence of exaggerated beta oscillations in subthalamic nucleus and cerebral cortex. J Neurosci. 28 (18), 4795-4806 (2008).
- Steriade, M. Corticothalamic resonance, states of vigilance and mentation. Neuroscience. 101 (2), 243-276 (2000).
- Maesawa, S., et al. Long-term stimulation of the subthalamic nucleus in hemiparkinsonian rats: neuroprotection of dopaminergic neurons. J Neurosurg. 100 (4), 679-687 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1998).
- Oliveira, L. M. O., Dimitrov, D. Methods for Neural Ensemble Recordings Frontiers in Neuroscience. Nicolelis, M. A. L. , (2008).
- Torres, E. M., et al. Increased efficacy of the 6-hydroxydopamine lesion of the median forebrain bundle in small rats, by modification of the stereotaxic coordinates. J Neurosci Methods. 200 (1), 29-35 (2011).
- Hadar, R., et al. Rats overexpressing the dopamine transporter display behavioral and neurobiological abnormalities with relevance to repetitive disorders. Sci Rep. 6, 39145 (2016).
- Parr-Brownlie, L. C., Poloskey, S. L., Bergstrom, D. A., Walters, J. R. Parafascicular thalamic nucleus activity in a rat model of Parkinson's disease. Exp Neurol. 217 (2), 269-281 (2009).
- Steriade, M., Nunez, A., Amzica, F. A novel slow (< 1 Hz) oscillation of neocortical neurons in vivo: depolarizing and hyperpolarizing components. J Neurosci. 13 (8), 3252-3265 (1993).
- Maggi, C. A., Meli, A. Suitability of urethane anesthesia for physiopharmacological investigations in various systems. Part 1: General considerations. Experientia. 42 (2), 109-114 (1986).
- Goldberg, J. A., Kats, S. S., Jaeger, D. Globus pallidus discharge is coincident with striatal activity during global slow wave activity in the rat. J Neurosci. 23 (31), 10058-10063 (2003).
- Karain, B., Xu, D., Bellone, J. A., Hartman, R. E., Shi, W. X. Rat globus pallidus neurons: functional classification and effects of dopamine depletion. Synapse. 69 (1), 41-51 (2015).
- Paasonen, J., et al. Comparison of seven different anesthesia protocols for nicotine pharmacologic magnetic resonance imaging in rat. Eur Neuropsychopharmacol. 26 (3), 518-531 (2016).
- Mahmud, M., Vassanelli, S. Processing and Analysis of Multichannel Extracellular Neuronal Signals: State-of-the-Art and Challenges. Front Neurosci. 10, 248 (2016).
- Hadar, R., et al. Altered neural oscillations and elevated dopamine levels in the reward pathway during alcohol relapse. Behav Brain Res. 316, 131-135 (2017).
- Voget, M., et al. Altered local field potential activity and serotonergic neurotransmission are further characteristics of the Flinders sensitive line rat model of depression. Behav Brain Res. 291, 299-305 (2015).
