Summary
En este estudio, se presenta la metodología sobre cómo realizar registros electrofisiológicos in vivo en múltiples sitios a partir de la vía hiperdirecta bajo anestesia con uretano.
Abstract
Evidencias convergentes muestran que muchas enfermedades neuropsiquiátricas deben ser entendidas como trastornos de redes neuronales a gran escala. Para comprender mejor las bases fisiopatológicas de estas enfermedades, es necesario caracterizar con precisión el modo en que se altera el procesamiento de la información entre las diferentes partes neuronales del circuito. Usando grabaciones electrofisiológicas extracelulares in vivo , es posible delinear con precisión la actividad neuronal dentro de una red neuronal. La aplicación de este método tiene varias ventajas sobre técnicas alternativas, por ejemplo , imágenes de resonancia magnética funcional e imágenes de calcio, ya que permite una resolución temporal y espacial única y no depende de organismos modificados genéticamente. Sin embargo, el uso de grabaciones extracelulares in vivo es limitado, ya que es una técnica invasiva que no puede aplicarse universalmente. En este artículo, se presenta un método simple y fácil de usar wCon lo que es posible registrar simultáneamente potenciales extracelulares tales como potenciales de campo locales y actividad multiunitaria en múltiples sitios de una red. Se detalla cómo una orientación precisa de los núcleos subcortical se puede lograr mediante una combinación de cirugía estereotáctica y análisis en línea de grabaciones de múltiples unidades. Por lo tanto, se demuestra cómo se puede estudiar una red completa tal como el bucle de los ganglios cortico-basales hiperdirecto en animales anestesiados in vivo .
Introduction
La reciente evidencia acumulativa sobre diferentes trastornos neuropsiquiátricos como la enfermedad de Parkinson y la esquizofrenia sugiere claramente que su fisiopatología se basa en una disfunción crítica de los circuitos neuronales extendidos que a menudo involucran estructuras corticales y subcorticales 1 , 2 , 3 . Según esta teoría, las manifestaciones clínicas de las enfermedades surgen como consecuencia de una capacidad de procesamiento de información dañada de una red de células en lugar de células individuales o elementos neuronales específicos 1 , 2 , 3 . Con el fin de mejorar la comprensión de este complejo grupo de enfermedades neuropsiquiátricas y encontrar nuevas opciones de tratamiento, es obligatorio caracterizar la dinámica neuronal de esas redes desordenadas en pacientes humanos y en modelos animales con gran detalle. ExcelenteEl método de estudio de redes a gran escala en sujetos vivos es el registro electrofisiológico multi-sitio de potenciales extracelulares 4 . Utilizando este método, es posible evaluar simultáneamente los potenciales de campo locales (LFPs), que representan principalmente la suma temporal de las corrientes postsinápticas excitatorias e inhibitorias y la actividad de múltiples unidades (MUA), que se genera por los potenciales presinápticos 5 . El registro de los potenciales extracelulares tiene varias ventajas sobre los métodos alternativos para estudiar las redes, por ejemplo , la resonancia magnética funcional y la imagen del calcio, ya que proporciona una mayor resolución temporal y espacial y porque no depende de organismos modificados genéticamente [ 5] . Sin embargo, el uso de grabaciones extracelulares in vivo es limitado, ya que es una técnica invasiva que no puede aplicarse universalmente.
Reconstrucción electrofisiológica in vivoOrdings se puede realizar tanto despierto como en animales anestesiados 6 . Ambos métodos van acompañados de ventajas y desventajas específicas. Los estudios en animales despiertos permiten la grabación de señales cerebrales durante el desempeño de tareas de comportamiento definidas, pero son propensos a los artefactos relacionados con el movimiento y otros 7 , 8 . Por otro lado, las grabaciones en animales anestesiados ofrecen la oportunidad de evaluar LFPs y MUA con un mínimo de artefactos en estados de sincronización cortical altamente definidos, pero los resultados también difieren en cierta medida de lo que puede encontrarse en sujetos despiertos 9 , 10 , 11 .
En los últimos años, se ha demostrado que el muestreo de LFPs es especialmente útil para delinear los cambios patológicos de la actividad de la red. Un ejemplo prominente de esto es la investigación sobre la fisiopatología de la DP en pacientes humanosS y modelos animales de la enfermedad, donde se pudo demostrar que las oscilaciones beta mejoradas en el bucle de los ganglios cortico-basales están relacionadas con los síntomas motores parkinsonianos 12,13. Como consecuencia de esta línea de investigación, actualmente se investiga si las oscilaciones beta podría ser utilizado como un biomarcador de retroalimentación en línea para la estimulación cerebral profunda en circuito cerrado 14 , 15 .
En el presente estudio, se proporciona una descripción detallada de grabaciones electrofisiológicas in vivo múltiples en vivo de LFPs y MUA en ratas anestesiadas con uretano. Se demuestra cómo se puede caracterizar electrofisiológicamente una red completa, tal como la vía hipocárdica de los ganglios cortico-basales, utilizando electrodos estándar y personalizados y cómo se pueden construir estos electrodos. Se hace especial hincapié en cómo puede lograrse una focalización precisa de los núcleos de los gangliosMbining la cirugía estereotáctica junto con el registro en línea de MUAs.
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Protocol
Los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de conformidad con la Ley alemana de bienestar animal (última revisión en 2014) y la normativa europea (2010/63 / UE). Los experimentos fueron aprobados por la autoridad local de bienestar animal (LaGeSo, Berlín) y se ajustaron a las directrices del departamento local e internacionales.
NOTA: En el método presentado se utilizan dos modelos de electrodos para registrar la vía hiperdirecta cortical-basal de los ganglios que conecta la corteza motora primaria (M1) con el núcleo subtalámico (STN) y la sustancia negra pars reticulada (SNr). Para el electrocorticograma epidural (ECoG) se usan los registros de los electrodos M1 hechos a medida de baja impedancia Ag / AgCl. Las grabaciones de la STN y SNr se realizan con electrodos de tungsteno de alta impedancia comercialmente disponibles.
1. Construcción de electrodos epidurales epidurales Ag / AgCl
- Tome un aprox. Cinta de 5 cm de largo de alambre de plata puro 99,99% con un diámetroR de 200 μm y retire cualquier revestimiento si es necesario.
- Sostenga la punta del cable con la punta hacia abajo en una llama de un encendedor o una vela hasta que la punta comience a derretirse. Espere hasta que la punta tenga forma de bola y tenga un diámetro de aproximadamente 1 mm. Cortar el electrodo preformado a una longitud total de 15 mm desde el comienzo de la punta en forma de bola hasta el extremo del alambre.
- Soldar un conector de precisión al extremo del alambre, que se ajusta al sistema de registro electrofisiológico usado. Cubra el punto de soldadura desde el extremo del cable hasta el conector con barniz conductor de plata. Esto ayuda a la conductividad y da como resultado una mejor calidad de la señal.
- Después de que el barniz conductor se haya secado, cubra el punto de soldadura con un tubo termorretráctil de 3 mm a 1 mm. Utilice cuidadosamente el martillo de un relojero para aplanar la punta en forma de bola a la mitad del grosor.
- Póngase guantes de examen y tome un paño de limpieza sin pelusa con etanol al 100% para eliminar la suciedad y la grasa.
- Ponga los electrodos enUn tubo de centrifugación de 15 ml o un tubo de cultivo celular y llénelo con cloro doméstico (PRECAUCIÓN, que contiene 2,8 g de hipocloruro de sodio por 100 g de disolvente) hasta que la punta en forma de bola esté completamente cubierta.
PRECAUCIÓN: El cloro es corrosivo; Siga siempre las instrucciones de seguridad del fabricante. - Saque los electrodos después de 23 min y enjuáguelos generosamente con agua destilada. La aplicación exitosa de una capa de cloruro de plata aparece como un cambio de color púrpura homogéneo.
- Seque en el aire. Después de secar completamente, tome los electrodos con pinzas finas. Con un pincel fino, aplique aislamiento eléctrico líquido. Comience en el cable directamente detrás de la punta del electrodo y cubra todo hasta el tubo termorretráctil. Dejar secar el aislante durante al menos 2 h.
- Para el control de calidad, realice una comprobación de la conductividad eléctrica con un multímetro. Si está disponible, realice la prueba de impedancia a 1 kHz usando un medidor de impedancia apropiado, mientras que el electrodo y la pruebaSonda se unen en una solución de NaCl al 0,9% que contiene H2O sin tocarse entre sí. Los valores de impedancia a 1 kHz deben ser de aproximadamente 8 kΩ.
2. Colocación de los electrodos en un soporte estereotáxico
NOTA: Para grabar MUA y LFP al mismo tiempo, utilice electrodos de microondas de tungsteno con una impedancia de 1,5 MΩ. Si el foco de las grabaciones está en grabaciones de alta calidad de unidades individuales, elija electrodos de microwire con una impedancia más alta (> 5 MΩ). Si el objetivo del estudio está dirigido únicamente a los LFP, los electrodos con impedancias más bajas pueden ser aceptables. Para estructuras pequeñas, para las cuales son a menudo necesarios ajustes stersotaxicos dorsoventrales, se utilizan pares de electrodos con una separación dorsoventral adecuada (en este caso 250 μm). Además, esto proporciona la ventaja de un electrodo de referencia más local, si es necesario. Las coordenadas estereotáxicas se miden siempre desde el electrodo más bajo ySe calcula en referencia al bregma.
- Tome un porta electrodos estándar estereotáxico con un bloque de acrílico y abrazadera y colóquelo con seguridad sobre una superficie plana en el campo de visión de un microscopio quirúrgico.
- Fijar el primer par de electrodos al bloque de acrílico del soporte con trozos de cinta adhesiva (3 mm x 8 mm) usando pinzas finas. Los electrodos deben sobresalir del bloque de acrílico aprox. 12 mm.
- Fijar cuidadosamente el segundo electrodo bipolar junto al primer electrodo. Para dirigir las estructuras de la vía hiperdirecta, la distancia debe ser de 2 mm ( Figura 1 ]. Para la mayoría de los soportes de electrodos estándar estereotáxicos, este es el receso adyacente. Utilice un calibrador para verificar. Las diferentes redes se pueden abordar de la misma manera. Para ello, el bloque de acrílico se puede girar hasta cierto grado.
- Ajuste el segundo par de electrodos deslizándolo cuidadosamente a una posición en la que la punta más ventral es de aproximadamente 200Μm empotrado en comparación con el primer electrodo ( Figura 1 ). Haga esto bajo visión microscópica. Para ello, utilice una cánula de 30 G (diámetro exterior 300 μm) para estimar mejor la distancia.
- Presione sobre la cinta adhesiva y, a continuación, asegúrela con la abrazadera metálica del soporte.
3. Cirugía
- Para grabaciones electrofisiológicas, use uretano (PRECAUCIÓN) para la anestesia.
Precaución: El uretano es tóxico y carcinógeno, por lo que debe respetar siempre las normas de seguridad y la hoja de datos proporcionada por el fabricante de la sustancia. - Preparar una solución de 200 mg / ml de uretano en solución salina médica al 0,9% de NaCl.
- Administrar un total de 1,3 g / kg de peso corporal de uretano por vía intraperitoneal (IP). Dependiendo de la cepa de la rata, podría ser razonable dividir la dosis en dos dosis con un intervalo de 15 minutos entre las inyecciones con el fin de mejorar la seguridad de la anestesia.
- Compruebe la profundidad de la anestesia usando pReflejo edal-retirada y otros reflejos adecuados. Si la anestesia no es lo suficientemente profunda para realizar la cirugía, inyectar 0,15 g / kg de peso corporal de uretano IP y esperar otros 15 min.
- Aplique un ungüento para prevenir la deshidratación corneal.
- Controlar constantemente la frecuencia respiratoria y el reflejo de retirada del pedal durante la anestesia. Utilice una almohadilla de calentamiento de animales pequeños con control de temperatura para asegurar que se mantenga una temperatura corporal fisiológica durante toda la cirugía. Antes de las grabaciones electrofisiológicas de inicio, cambiar a una alternativa no eléctrica ( por ejemplo, almohadilla de cabeza de acetato de sodio).
- Afeitar la piel junto al lado dorsal de la cabeza para lograr un campo quirúrgico limpio. Desinfecte alrededor del sitio de la incisión con desinfectante quirúrgico apropiado. Fijar el animal en el marco estereotáctico.
- Realizar una incisión de 2 cm de largo del cuero cabelludo en la dirección sagital con un bisturí. Use un bisturí para raspar ligeramente la aponeurosis del cráneo y desinfectar el cráneo. Usar coTton empapados en H 2 O 2 al 3% para eliminar cualquier tejido restante.
- Utilice un electrocauter o termocauador para controlar el sangrado, si es necesario. Detener las hemorragias del hueso craneal e hipodermia, si la hemorragia no se detiene espontáneamente después de 1-2 min y obstaculiza la vista en el cráneo.
- Ajustar la barra incisiva hasta que la cabeza esté colocada en posición plana del cráneo, lo que significa que el bregma y el lambda como puntos de referencia estereotáxicos están en el mismo plano. Esto es lo más importante para lograr una alta precisión quirúrgica. Utilice una herramienta estereotáctica estándar de alineación de ratas, calibre la punta designada al bregma bajo visión microscópica y ajuste la barra incisiva hasta que los puntos designados para el bregma y lambda en la herramienta toquen el cráneo al mismo tiempo.
NOTA: Una vista desde un lado con luz enfocada desde el otro puede ayudar a determinar esta condición. Alternativamente, tomar un soporte estereotáxico con una cánula fina y medir las coordenadas dorsoventral de Bregma aNd lambda bajo visión microscópica. Ajusta la barra incisiva hasta que las coordenadas dorsoventral de Bregma y lambda sean iguales. - Utilice un soporte estereotáxico con una cánula, calibre el bregma y luego calcule la posición de todos los orificios en el cráneo. Usando el soporte estereotáxico, marque las posiciones de los orificios que se van a perforar rascando cuidadosamente el cráneo o usando un marcador de color quirúrgico. Las coordenadas para esto dependen de los objetivos, se dan coordenadas con referencia al bregma para la ruta hiperdirecta en la Tabla 1 , incluyendo las coordenadas sugeridas para los electrodos de referencia cerebelosos.
- Usando un microdrill cuidadosamente taladre todos los agujeros. Para la STN y SNr, taladre un agujero común (aproximadamente 2 mm x 3 mm de tamaño). Todos los demás taladros deben tener un diámetro de aproximadamente 1 mm.
- Tomar dos cánulas finas (por lo menos 27 G) y doblar sus puntas para formar una forma enganchada, usando una superficie dura o pinzas. Utilice estos para eliminar cualquier debriS de los taladros, y cuidadosamente cortar y quitar la duramadre en el agujero común de STN / SNr.
- Enjuague los orificios con solución salina fisiológica. Aplique una gota de solución salina fisiológica cada 15 min a los orificios para evitar que el cerebro y la duramadre se sequen.
- Tome un microdrill y un micro tornillo de acero inoxidable ( por ejemplo, un tornillo de 1,2 mm x 2 mm), taladre un orificio y atornille un micro tornillo entre los orificios de los electrodos epidurales de referencia por encima del cerebelo, haga lo mismo para el M1 electrodos epidurales.
- Deslice los electrodos epidurales Ag / AgCl auto-construidos en los orificios para los electrodos de referencia y los electrodos M1. Guíe la punta del electrodo con pinzas finas y deslícela directamente debajo del hueso del cráneo dentro del taladro.
- Fijar todos los electrodos epidurales con dos componentes de acrílico dental. Asegúrese de no cubrir el punto bregma ni afectar el agujero común STN / SNr.
- Inserte el soporte preparado con el electrodo de tungstenoEs en el marco estereotáxico.
- Calibre el electrodo más ventral, que está destinado a dirigirse a la STN, al bregma. Ajuste a la posición calculada sobre el agujero común de STN / SNr y baje los electrodos abajo al cerebro bajo visión microscópica. Asegúrese de que los electrodos de micrófono de tungsteno van dentro del cerebro suavemente.
4. Cartografía y registros electrofisiológicos
NOTA: Para este paso se necesita una jaula de Faraday y un sistema de grabación electrofisiológico multicanal con software de grabación capaz de filtrar en línea y clasificar en línea. Preferiblemente utilice un sistema que funcione con un preamplificador situado cerca de la cabeza de los animales para mantener el ruido eléctrico y artefactos a un mínimo absoluto. Además de los electrodos de microrretrodos de tungsteno, al menos un epidural y un electrodo de referencia son necesarios para realizar grabaciones de la vía hiperdirecta. Se recomienda insertar la epidural y la referenciaE electrodos por parejas sin que se toquen entre sí, esto ayuda en caso de mal funcionamiento y permite diferentes tipos de referencia en el análisis de datos.
- Ponga una jaula de Faraday móvil por encima del marco estereotáxico. Si sólo está disponible una jaula estacionaria de Faraday, mueva cuidadosamente el marco estereotáxico a la jaula de Faraday mientras se asegura de que los electrodos profundos del cerebro no bajen al cerebro hasta que el marco estereotáxico esté en su posición final.
- Conecte los electrodos al headstage de la configuración electrofisiológica. Asegúrese de que los electrodos de referencia estén conectados a los canales de referencia apropiados.
- Configure el software de grabación: Filtro de paso de banda (0.05-8.000 Hz) y amplifique (ganancia 1.500-2.000x) la señal de datos sin procesar. Utilice un filtro LFP y espiga en línea con ajustes apropiados (filtro de paso de banda de 0,05 a 250 Hz para LFP, filtro de paso de banda 300-8,000 Hz para MUA). Para todos los filtros, utilice un filtro tipo butterworth.
- Configurar un umbral de pico, si corresponde, para onlinE clasificación por punta. La mayoría de software de grabación permite configurar un umbral de pico, que es un valor de amplitud por encima del cual una señal está marcada como un pico por el software. Este umbral puede determinarse matemáticamente como un factor o una desviación estándar de la amplitud media de la señal de pico filtrada, o puede determinarse preferiblemente mediante inspección visual de segmentos de datos <500 ms y configurado como una línea por encima del ruido de señal en un gráfico interfaz de usuario.
NOTA: La intención al establecer un umbral de pico es contar picos y unidades de clasificación para proporcionar información sobre cuántas neuronas se registran actualmente y cómo se forman sus picos. - Lentamente baje los electrodos de micrófono de tungsteno a 1 mm dorsal de la diana, que es STN para vía hiperdirecta. Espere a que la señal se estabilice si es necesario.
- Para el mapeo electrofisiológico, avance los electrodos ventralmente en pasos de 100 μm. En cada paso, evalúe el patrón de disparo, disparando rComió y forma de picos. Compare estos con los ejemplos típicos dados en la Figura 2 . Normalmente, los núcleos densos muestran clavos rápidos y continuos sobre varios pasos dorsoventral, mientras que las estructuras ricas en fibra muestran bajos índices de disparo y menos actividad de pico homogénea en pasos ventrales posteriores.
- Para la vía hiperdirecta, asegúrese de que el electrodo más ventral esté dentro de STN.
NOTA: La STN se alcanza cuando se detecta un aumento considerable de MUA ventral de la Zona incerta. Ventral a la STN, el clavado para casi completamente porque el electrodo ha alcanzado la cápsula interna. Cuando el electrodo más ventral está en STN, la configuración de los microelectrodos de tungsteno asegura que el segundo electrodo posterior esté en SNr. Dorsoventral ajuste en pequeños incrementos podría ser necesario para registrar MUA típico en STN y SNr al mismo tiempo. Tenga en cuenta que la frecuencia de MUA depende del número de neuronas realmente registradas y en el nivel de cerebroactivación. - Una vez que los electrodos están en las estructuras deseadas, configure el filtrado en línea y la clasificación por punta (vea la Figura 4 ), y luego inicie la grabación de los datos. Los ejemplos típicos para los diferentes estados de sincronización cortical que pueden ser identificados en las grabaciones LFP se muestran en la Figura 3 .
5. Fin del experimento
- Cuando se hacen las grabaciones, levante lentamente los electrodos fuera del cerebro y enjuáguelos instantáneamente con solución salina fisiológica. Los electrodos pueden ser reutilizados después de una limpieza completa e inspección visual. Electrodos de plegado de descarga.
- Eutanizar a los animales mediante una inyección IP de una sobredosis de uretano (2,5 g / kg de peso corporal).
NOTA: El uretano sólo debe usarse para los procedimientos finales. - Si se requiere una verificación histológica de la posición del electrodo u otros procedimientos de tinción histológica, retire el cerebro del cráneo y procese elApropiadamente.
NOTA: Dependiendo de los métodos de tinción deseados, la perfusión transcardial puede ser necesaria. Para la verificación post mortem de la posición del electrodo, una tinción Nissl estándar es suficiente en la mayoría de los casos para visualizar la trayectoria del electrodo en, por ejemplo, secciones cerebrales coronales. Otros enfoques para facilitar la verificación histológica de blancos incluyen el uso de lesiones inducidas eléctricamente al tejido cerebral mediante la aplicación de corriente eléctrica a través de los electrodos de registro o la aplicación de tinte biocompatible antes de la inserción de electrodo 16 , 17 .
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Representative Results
Con los electrodos de registro usados en la presente memoria, es posible muestrear LFPs de la corteza motora primaria, el núcleo subtalámico y la sustancia negra pars reticulata y MUA de la STN y SNr. Inicialmente, los LFP y la actividad de múltiples unidades se graban juntos en una señal de banda ancha. A continuación, los LFP y los MUA se separan mediante filtros de paso de banda (0,05 - 250 Hz para LFPs y 300 - 4000 Hz para MUA).
Para la orientación correcta de los núcleos subcorticales, especialmente de estructuras pequeñas como la STN, es ventajoso alinear las coordenadas estereotáxicas planeadas con la señal MUA registrada en línea. Para la orientación de la trayectoria del electrodo se puede registrar el patrón MUA característica de la STN ( Figura 2 ) 9 , 20 .
Para los pasos posteriores del análisis,A menudo obligatoria para definir unidades individuales de la actividad de múltiples unidades por el análisis de componentes principales ( Figura 4 ].
En las grabaciones LFP de la M1 se pueden identificar dos estados de sincronización cortical alternados espontáneamente: el estado activado (AS) y el estado de actividad de onda lenta (SWA) ( Figura 3 ) 18 , 19 . Mientras que el estado SWA está dominado por oscilaciones lentas de alta amplitud de alrededor de 1 Hz, el AS se caracteriza por oscilaciones más rápidas con una amplitud más baja ( Figura 3 ).
Figura 1: Montaje de los electrodos de micrófono de cerebro profundo en un soporte estereotáxico estándar. Observe la separación de la punta entre A, el par de electrodos paraSTN y B, el par de electrodos para el SNr en dirección dorsoventral de aprox. 200 μm y dirección anterioposterior de aprox. 2 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Actividad de múltiples unidades característica de una trayectoria de electrodo dorsoventral Segmentación de la STN. ( A ) Grabaciones en unidades múltiples del núcleo talámico ventral póstero-medial (VPM), la zona incerta (ZI), el núcleo subtalámico (STN) y la sustancia negra pars reticularis (SNr). El VPM exhibe picos espaciados e irregulares de alta amplitud. Este patrón de picos cesa al acercarse a la ZI. Cuando el electrodo entra en la STN un típico patrón de disparo de alta frecuencia con ráfagas cortas con amplitud mediaUde se puede observar. El SNr puede ser identificado por su alta amplitud y el patrón de disparo regular. ( B) STN-trayectorias superpuestas sobre las imágenes de una rata estereotáctica atlas [ 21] . Parte superior: plano coronal. Parte inferior: plano sagital. Observe el paso de la punta del electrodo a través de VPM y ZI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Estados de sincronización cortical en grabaciones LFP de la corteza motora primaria durante la anestesia con uretano. ( A ) Representación de 600 s LFP registro de la corteza motora primaria. Períodos de tiempo con alta frecuencia, actividad de baja amplitud correspondiente al estado activado (i) y períodos de tiempo con un ritmo más lento y alto La amplitud correspondiente al estado de actividad de la onda lenta (ii) puede diferenciarse. ( B ) Diagrama de tiempo-frecuencia correspondiente a un intervalo de 600 s que ilustra la potencia relativa de 0-20 Hz de los LFPs presentados en (A). Los colorantes más cálidos indican una mayor potencia relativa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Clasificación de unidades individuales de la actividad de unidades múltiples STN. ( A ) Vista tridimensional de los grupos de unidades en el espacio de características después del análisis del componente principal. Cada grupo representa una sola unidad putativa. ( B ) Formas de onda de pico y medias de forma de onda de pico correspondientes a los conglomerados en (A).0fig4large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Coordenadas de Bregma | STN | SNr | M1 | Referencia 1 | Referencia 2 |
| anterior posterior | -3,6 | -4,8 | +3,0 | -10,0 | -10,0 |
| Medial lateral | +2,5 | +2,5 | +3,0 | +3,0 | -3,0 |
| Dorsal ventral | -8,0 | n / A | n / A | n / A | n / A |
Tabla 1: Coordenadas estereotáxicas para la grabación del Hyperdirect CoRtico-basal Ganglia Pathway. Todos los puntos se miden desde el punto de referencia bregma en el cráneo en mm; Na- no es aplicable.
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Discussion
En el presente estudio se demuestra cómo registrar las señales electrofisiológicas extracelulares simultáneamente a partir de múltiples sitios de una red dada, utilizando el ejemplo de la vía hipocárdica de los ganglios cortico-basales que conecta la M1 con la STN y SNr en los roedores.
Un paso crítico en el registro de estructuras subcorticales pequeñas tales como el STN es la inserción guiada con precisión de los electrodos de registro en el blanco. En el método presentado, el cuidado de dos pasos cruciales asegura una alta precisión de la orientación. Cuando se prepara al animal en el aparato estereotáctico antes de introducir los electrodos en el cerebro, es absolutamente obligatorio asegurarse de que el cráneo se lleva a la posición de "cráneo plano" 22 . Para lograr la posición plana del cráneo, la posición de la barra incisiva del marco estereotáctico se cambia hasta las alturas de los puntos de referencia bregma y lambda oN el cráneo está en el mismo plano dorsoventral 21 . Solamente asegurando esta posición, las coordenadas encontradas en los atlas estereotácticos se pueden aplicar con alto nivel de precisión al animal de laboratorio individual, puesto que los atlas se basan en la posición plana del cráneo 21 . Además, la evidencia experimental demuestra que la precisión de la orientación con una posición de cráneo plano individualizado es superior a un ajuste fijo de la barra incisiva 23 . La posición de los electrodos de grabación en el plano dorsoventral debe ajustarse mediante el registro constante de la actividad de múltiples unidades. Los diferentes núcleos y estructuras de materia blanca a lo largo de la trayectoria del electrodo muestran patrones de fuego característicos ( Figura 2 ), que pueden usarse para reajustar la posición del electrodo 9 , 20 .
Otro paso importante en el método presentado es la colocación del rElectrodo de referencia. En el protocolo presentado, se eligió una posición por encima de la corteza cerebelosa, porque en este punto el electrodo de referencia no detecta la actividad de los ganglios cortico-basales que fue el punto central del estudio. En estudios con interés en los métodos de análisis que son susceptibles a la conducción volumétrica se debe favorecer una referencia más local 5 .
El uretano es un anestésico ampliamente utilizado para el registro de potenciales neuronales extracelulares en la investigación con animales 11 , 18 , 24 , 25 , 2 6 . La razón de esto es que una sola dosis de uretano puede producir una narcosis estable y duradera durante 8 - 12 h con sólo una depresión limitada de la actividad del sistema nervioso central en comparación con otros anestésicos [ 27] . Sin embargo, la urethane anesthesiA también activa el sistema nervioso simpático, que puede resultar en efectos secundarios no deseados como por ejemplo hiperglucemia [ 27] . Debido a su acción de larga duración ya la falta de un fármaco potente para antagonizar su efecto anestésico, el uretano no debe usarse para experimentos repetidos que están separados por horas o días. Si se planea realizar múltiples sesiones de grabación en el mismo animal o si hay una razón técnica para no usar uretano, entonces la anestesia con gas con isoflurano y las inyecciones de fármacos como ketamina y xilazina pueden ser alternativas razonables para experimentos electrofisiológicos in vivo 28 , 29 . La desventaja de estos regímenes de narcosis es que requieren un seguimiento y ajustes más frecuentes que el uso de uretano, debido a su corta vida media ya la acumulación de los fármacos a lo largo del tiempo. Además, existe evidencia de que el uretano podría interferir menos con el b fisiológico Lluvia actividad que otros anestésicos 30 .
Todas las condiciones de grabación detalladas en el presente documento determinan críticamente cómo se pueden procesar y analizar los datos obtenidos fuera de línea, por lo que es obligatorio ajustar todos los ajustes a los requisitos de las etapas de análisis planificadas. Puesto que hay muchas opciones para el análisis de grabaciones extracelulares multicanal, el uso de las cajas de herramientas de código abierto disponibles puede ser ventajoso [ 31] .
El registro de los potenciales extracelulares in vivo es un método que ofrece una única resolución temporal y espacial de las señales cerebrales que es superior a los métodos alternativos como la resonancia magnética funcional y la formación de imágenes de calcio [ 5] . El método presentado no sólo puede aplicarse al registro de la vía hiperdirecta, sino que puede ajustarse fácilmente a una variedad de otros modelos experimentales y preguntas de investigaciónSin embargo, como se trata de cirugía estereotáctica, hay muchos escenarios de investigación donde no se puede aplicar y donde se debe seleccionar un método no invasivo.
En el futuro, se debe realizar una combinación de la técnica de grabación extracelular multi-sitio presentada con herramientas optogenéticas para mejorar aún más nuestra comprensión de la disfunción de la red subyacente a diferentes enfermedades neuropsiquiátricas con el fin de encontrar nuevos tratamientos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), KFO 247, por financiar nuestro estudio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ag/AgCl custom epidural electrodes | Goodfellow GmbH D-61213 Bad Nauheim, Germany info@goodfellow.com |
Product-ID AG005127 for 99.99% silver wire | Ag/AgCl electrodes will allow for better signal quality, but may only be used in acute experiments. Possible replacement: Stainless steel electrodes |
| Stereotaxic holder with acrylic block | David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA |
Product ID Model 1770 Standard Electrode Holder | Make sure the acrylic block has recesses which suit the electrode setup for the desired target. Acrylic blocks can easily be modified with a file to obtain the desired configuration. Possible replacement: Self-constructed electrode holders |
| Tungsten microwire electrodes 1.5 MΩ impedance | Microprobes.com 18247-D Flower Hill Way Gaithersburg, Maryland, 20879 USA |
Product-ID WE3ST31.5A5-250um | The 1.5 MΩ is necessary to record MUA and LFP at the same time. Possible replacement: Microelectrodes of different materials can be used. The electrodes have to be straight, robust and as thin as possible. |
| Rat alignment tool | David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA |
Product ID Model 944 Rat Alignment Tool | Allows the exact orientation of the brain to match stereotaxic atlases. Possible replacement: Stereotaxic holder with a cannula |
| Two-component dental acrylic | Associated Dental Products Ltd. Kemdent Works, Purton, Swindon Wiltshire, SN5 4HT, United Kingdom |
Simplex Rapid Powder Clear 225g, Product code: ACR803; Simplex Rapid Liquid 150ml, Product code: ACR920 | Depending in the electrodes used, superglue might be an easy alternative, if the electrodes are small and lightweight. Possible replacement: Superglue (Cyanacrylate-based) |
| Faraday cage | Self-construction | A proper Faraday cage will be the best protection from electromagnetic artifacts, but everything which can be formed into a box shape or applied to a frame and is made of conductive material may help. Possible replacement: Aluminum foil or copper mesh | |
| Electrophysiological setup with recording software and online spike-sorting capabilities | OmniPlex® Neural Data Acquisition System Plexon Inc 6500 Greenville Avenue, Suite 700 Dallas, Texas 75206 USA |
Offline sorting software is a potential alternative, multiple scripts and softwares can be found for free in the open source community. |
References
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