Summary
Bu çalışmada, üretan anestezi altında hiperdirect yolaktan çoklu saha in vivo elektrofizyolojik kayıtların nasıl gerçekleştirileceği üzerine metodoloji sunulmuştur.
Abstract
Yakın geçmişteki kanıtlar birçok nöropsikiyatrik hastalığın geniş ölçekli nöronal ağların bozuklukları olarak anlaşılması gerektiğini göstermektedir. Bu hastalıkların patofizyolojik temelini daha iyi anlamak için, hangi işleme yönteminin devrenin farklı nöronal kısımları arasında bozulduğunu kesin olarak belirtmek gerekir. Ekstraselüler in vivo elektrofizyolojik kayıtları kullanarak, bir nöronal ağ içindeki nöronal aktiviteyi doğru bir şekilde çizmek mümkündür. Bu yöntemin uygulanması, benzersiz bir zamansal ve mekansal çözünürlüğe izin verdiği ve genetiği değiştirilmiş organizmalara dayanmadığı için, fonksiyonel manyetik rezonans görüntüleme ve kalsiyum görüntüleme gibi alternatif teknikler üzerinde birçok avantaja sahiptir. Bununla birlikte, hücre dışı in vivo kayıtların kullanımı, evrensel olarak uygulanamayan invaziv bir teknik olduğu için sınırlıdır. Bu yazıda basit ve kullanımı kolay bir yöntem sunulmaktadır.Yerel alan potansiyelleri ve multi-unit aktivite gibi hücre dışı potansiyellerin bir ağın birden çok yerinde aynı anda kaydedilmesi mümkündür. Sterotaktik cerrahi ile çok üniteli kayıtların online analizinin bir kombinasyonu kullanılarak subkortikal çekirdeklerin kesin bir hedeflemesinin nasıl başarılabileceği detaylandırılmıştır. Böylece, hiperdirect kortiko-bazal ganglia döngüsü gibi eksiksiz bir ağın in vivo anestezi altındaki hayvanlarda nasıl çalışılacağı gösterilmektedir.
Introduction
Parkinson hastalığı (PD) ve şizofreni gibi farklı nöropsikiyatrik bozukluklarla ilgili yeni kümülatif bulgular, patofizyolojisinin, genellikle kortikal ve subkortikal yapıları içeren 1 , 2 , 3 nolu geniş nöronal devrelerin kritik bir işlev bozukluğuna dayandığını ileri sürmektedir. Bu teoriye göre, hastalıkların klinik bulguları, tek hücre veya belirli nöronal elemanlar yerine 1 , 2 , 3 nolu hücrelerin bilgi işlem kapasitesinin bozulmasının bir sonucu olarak ortaya çıkmaktadır. Nepropsikiyatrik hastalıkların bu karmaşık grubunun anlaşılmasını arttırmak ve yeni tedavi seçenekleri bulmak için, insan hastalarında ve hayvan modellerinde bu bozuk ağların nöronal dinamiklerini ayrıntılı bir şekilde karakterize etmek zorunludur. Mükemmel bir mükemmellikEntelektüel potansiyellerin çok bölgedeki elektrofizyolojik kayıtları 4'tür . Bu yöntemi kullanarak, esasen, presinaptik potansiyeller tarafından üretilen, uyarıcı ve inhibe edici postsinaptik akımların ve çok birim aktivitenin (MUA) geçici olarak toplamını temsil eden yerel alan potansiyellerini (LFP'ler) aynı anda değerlendirmek mümkündür. Hücre dışı potansiyellerin kaydı, ağları incelemek için alternatif yöntemlere kıyasla birkaç avantaja sahiptir, örneğin işlevsel manyetik rezonans görüntüleme ve kalsiyum görüntüleme, çünkü daha yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük sağlar ve genetik olarak düzenlenmiş organizmalara bağımlı değildir 5 . Bununla birlikte, hücre dışı in vivo kayıtların kullanımı, evrensel olarak uygulanamayan invaziv bir teknik olduğu için sınırlıdır.
In vivo elektrofizyolojik kayıtAnestezi altındaki hayvanlarda olduğu kadar uyanık halde de yapılabilir 6 . Her iki yöntem de belirli artı ve eksileri beraberinde getirir. Uyanık hayvanlar üzerindeki çalışmalar, tanımlanmış davranışsal görevlerin gerçekleştirilmesi sırasında beyin sinyallerinin kaydedilmesine izin verir, ancak hareketle ilgili ve diğer eserlere 7 , 8 eğilimlidir. Anestezi uygulanmış hayvanlardaki kayıtlar, LFP'leri ve MUA'yı, yüksek tanımlı kortikal senkronizasyon durumlarında asgari düzeyde eser ile değerlendirme fırsatı sunar; ancak sonuçlar, bir dereceye kadar uyanık olan 9 , 10 ve 11'de bulunanlara göre de farklılık gösterir.
Son yıllarda, LFP örneklemesinin ağ etkinliğinin patolojik değişimlerini tanımlamak için özellikle yararlı olduğu gösterilmiştir. Bunun önemli bir örneği, insan hastada PD'nin patofizyolojisi üzerine bir araştırmadırS ve hayvan modellerinde, kortiko-bazal gangliyon halkasında gelişmiş beta salınımlarının parkinson motor belirtileri 12 , 13 ile bağlantılı olduğu gösterilebilir. Bu araştırmanın bir sonucu olarak, beta salınımlarının kapalı döngü derin beyin stimülasyonu için çevrimiçi geribildirim biomarkeri olarak kullanılabilmesi şu anda araştırılmaktadır 14,15.
Bu çalışmada, üretandan anestezi uygulanan sıçanlarda LFP'lerin ve MUA'nın in vivo elektrofizyolojik kayıtlarının akut çoklu bölgesinin ayrıntılı bir tarifi verilmiştir. Hiperdirect kortiko-bazal gangliyon yolu gibi komple bir ağın standart ve özelleştirilmiş elektrotları kullanarak elektrofizyolojik olarak karakterize edilebileceği ve bu elektrotların nasıl oluşturulabileceği gösterilmiştir. Özellikle, bazal gangliyon çekirdeğinin kesin bir şekilde hedeflenmesinin co tarafından nasıl başarılabileceği vurgulanmaktadır.Stereotaktik ameliyatı MUA'ların çevrimiçi kaydı ile birlikte birleştirdik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deneysel prosedürler, Alman Hayvan Refahı Yasası'na (son olarak 2014'de revize edilmiştir) ve Avrupa yönetmeliklerine (2010/63 / AB) uygun olarak yürütülmüştür. Deneyler, yerel hayvan refahı otoritesi (LaGeSo, Berlin) tarafından onaylandı ve yerel departmanlara ve uluslararası kurallara uyuyordu.
NOT: Sunulan yöntemde primer motor korteksi (M1) subtalamik çekirdeği (STN) ve substantia nigra pars reticulate (SNr) ile bağlayan hiperdirect kortiko-bazal gangliyon yolundan kayıt yapmak için iki elektrot modeli kullanılır. Epidural elektrokortikogram (ECoG) kayıtları için M1 ısmarlama düşük empedanslı Ag / AgCl elektrodları kullanılmıştır. STN ve SNr'den alınan kayıtlar piyasada bulunan yüksek empedanslı tungsten elektrotlarla gerçekleştirilir.
1. Epidural Ag / AgCl Epidural Elektrodların Yapımı
- Yaklaşık bir şeyler al. Diameterli,% 99,99 saf gümüş telin 5 cm uzunluğunda şeridiR, 200 μm olmalıdır ve gerekirse herhangi bir kaplamayı çıkarın.
- Tel ucu ucunu ufak bir ışına veya mum alevine doğru ucu eriyene kadar aşağı doğru tutun. İpucu top şeklinde olacak ve yaklaşık 1 mm çapa gelene kadar bekleyin. Önceden şekillendirilmiş elektrodu, top şekilli ucun başlangıcından tel ucuna kadar toplam 15 mm uzunluğa kadar kesin.
- Kullanılmış elektrofizyolojik kayıt sistemine uyan tel uca lehimlenmiş bir konektör. Lehimleme noktasını tel ucundan konnektöre iletken gümüş vernik ile örtün. Bu, iletkenliğe yardımcı olur ve daha iyi bir sinyal kalitesi sağlar.
- İletken vernik kurutulduktan sonra lehimleme noktasını 3 mm ila 1 mm'lik ısı büzüşmeli tüplerle örtün. Top şeklindeki ucu kalınlığın yarısına kadar düzleştirmek için dikkatle saatçi çekiç kullanın.
- Muayene eldivenleri koyun ve herhangi bir kir ve gres temizlemek için% 100 etanol içeren hav bırakmayan bir temizlik bezi kullanın.
- Elektrotları15 mL'lik bir santrifüj tüpü veya hücre kültürü tüpü ve top şeklinde ucu tamamen kaplanıncaya kadar, ev tipi klorlu ağartıcı (DİKKAT: 100 g'lık bir solventte 2.8 g sodyum hipoklorür içeren) doldurun.
DİKKAT: Klorlu ağartıcı aşındırıcıdır; Her zaman üreticinin güvenlik talimatlarını izleyin. - 23 dakika sonra elektrotları çıkarın ve bunları damıtılmış suyla cömertçe yıkayın. Bir gümüş klorid tabakasının başarılı bir şekilde uygulanması renkte homojen bir mor değişim olarak gözükmektedir.
- Kuru havada. Tam kurutulduktan sonra, elektrotları ince cımbızlarla alın. İnce bir fırça ile sıvı elektrik yalıtımı uygulayın. Doğrudan elektrot ucu arkasında tel üzerinde başlayın ve ısı çeken tüp kadar her şeyi kapağı. İzolasyonu en az 2 saat boyunca kurumaya bırakın.
- Kalite kontrolü için, bir multimetre ile elektrik iletkenliğini kontrol edin. Varsa, uygun bir empedans ölçeri kullanarak 1 kHz'de empedans testi yapın, elektrot ve testProb birbirine dokunmadan% 0.9 NaCl içeren H2O çözeltisi içinde bir araya getirilir. 1 kHz'de empedans değerleri yaklaşık 8 kΩ olmalıdır.
2. Elektrotları bir Stereotaksik Tutucuya Yapıştırma
NOT: MUA ve LFP'leri aynı anda kaydetmek için, 1.5 MΩ empedanslı tungsten mikrowire elektrotları kullanın. Kayıtların odağı tek bir ünitenin yüksek kalitede kayıtlarına dayanıyorsa, daha yüksek empedansa (> 5 MΩ) sahip mikrowire elektrotları seçin. Çalışmanın amacı yalnızca LFP'lere yönelikse, daha düşük empedanslı elektrotlar kabul edilebilir. Dorsoventral stereotaksik ayarlamalar çoğunlukla gerekli olan küçük yapılar için, uygun bir dorsoventral uç ayrımı olan (bu durumda 250 μm) elektrot çifti kullanın. Ayrıca, gerekirse, daha yerel bir referans elektrotu avantaj sağlar. Stereotaksik koordinatlar her zaman en alttaki elektrottan ölçülür veBregma'ya referansla hesaplanmıştır.
- Akrilik blok ve kelepçe ile standart bir stereotaksik elektrot tutacağı alın ve cerrahi bir mikroskop alanındaki düz bir yüzeye güvenli bir şekilde yerleştirin.
- İlk çifti, ince cımbız kullanarak yapışkan bant parçaları (3 mm x 8 mm) ile tutucunun akrilik bloğuna gevşek şekilde sabitleyin. Elektrotlar akrilik bloğu yaklaşık olarak çıkıntı yapmalıdır. 12 mm.
- İkinci bipolar elektrotu birinci elektrodun yanına dikkatlice sabitleyin. Hiperdirect yolağının yapılarını hedeflemek için mesafe 2 mm olmalıdır ( Şekil 1 ). Çoğu standart stereotaksik elektrot tutucu için, bu bitişik girintidir. Doğrulamak için kaliper ölçer kullanın. Farklı ağlara aynı şekilde yaklaşılabilir. Bunun için akrilik blok belirli bir dereceye kadar döndürülebilir.
- İkinci elektrot çifti, en ventral ucu yaklaşık 200 olan bir konuma dikkatlice kaydırarak ayarlayınΜm elektrodlara kıyasla gömülmüştür ( Şekil 1 ). Bunu mikroskopik görüş altında yapın. Bunun için mesafeyi daha iyi tahmin etmek için 30 G kanül (300 mm dış çap) kullanın.
- Yapışkan banda bastırın ve ardından tutacağın metal kelepçesi ile sabitleyin.
3. Cerrahi
- Elektrofizyolojik kayıtlar için, anestezi için üretan (DİKKAT) kullanın.
Dikkat: Üretan toksiktir ve kanserojentir, bu nedenle daima madde üreticisi tarafından verilen güvenlik yönetmeliklerine ve bilgi belgelerine uyun. - % 0.9 NaCl tıbbi solüsyonda 200 mg / mL üretan solüsyonu hazırlayın.
- Toplam 1,3 g / kg vücut ağırlığı üretanını intraperitoneal (IP) uygulayın. Sıçan gerginliğine bağlı olarak, anestezinin güvenliğini arttırmak için, enjeksiyonların arasında 15 dakikalık bir aralıkla dozun iki dozuna bölünmesi mantıklı olabilir.
- Anestezi derinliğini p kullanarak kontrol edinEdal çekilme refleksi ve diğer uygun refleksler. Anestezi ameliyatı gerçekleştirmek için yeterince derin değilse, 0.15 g / kg vücut ağırlığı stearant IP verin ve 15 dakika daha bekleyin.
- Korneal dehidrasyonu önlemek için göz merhemi uygulayın.
- Anestezi sırasında respiratuar hızı ve pedal çekme refleksini sürekli izleyin. Ameliyat boyunca fizyolojik bir vücut ısısının korunmasını sağlamak için sıcaklık kontrollü küçük bir hayvan ısıtma pedi kullanın. Elektrofizyolojik kayda başlamadan önce elektriksiz olmayan bir alternatife geçin ( örn. Sodyum asetat kafa yastığı).
- Temiz bir cerrahi alan elde etmek için kürkün başın dorsal yanının yanına tıraş edin. Uygun cerrahi dezenfektanla kesi bölgesini etrafında dezenfekte edin. Hayvanı stereotaktik çerçevede düzeltin.
- Saçlı deri ile sagital yönde 2 cm uzunluğunda kafa derisi kesiği yapın. Kafatası aponörozu hafifçe kazıyıp kafatasını dezenfekte etmek için bir neşter kullanın. Birlikte kullanınKalan tüm dokuları çıkarmak için% 3 H 2 O 2 içinde ıslatılmış tomurcuklar.
- Gerekirse, kanamayı kontrol etmek için bir elektrokotter veya termokoter kullanın. Kanama 1-2 dakika sonra kendiliğinden durmaz ve kafatasına bakış açısını engelleyecek olursa, kafatası kemiklerinden ve hipodermden kanamaları durdurun.
- Baş kafası düz kafatası pozisyonuna getirilinceye kadar kesici çubuğu ayarlayın, yani stereotaksik referans noktaları olan bregma ve lambda aynı düzlemdedir. Yüksek cerrahi hassasiyet elde etmek için bu çok önemlidir. Standart bir stereotaksik sıçan hizalama aracı kullanın, mikroskobik görüş altında bregma için belirlenen ucu kalibre ve bregma ve lambda belirlenen noktaları aynı anda kafatasına dokunma kadar dişli çubuğu ayarlayın.
NOT: Bir taraftan odaklanmış ışık bulunan bir görünüm bu durumu belirlemenize yardımcı olabilir. Alternatif olarak, ince kanülle stereotaksik bir tutucu alın ve Bregma'nın dorsoventral koordinatlarını aNd lambda mikroskopik görüş altında. Bregma ve lambda'nın dorsoventral koordinatları aynı olana kadar kesici çubuğu ayarlayın. - Kanüle sahip bir stereotaksik tutucu kullanın, bregma'ya kalibre edin ve kafatasındaki tüm deliklerin yerlerini hesaplayın. Stereotaksik tutacağı kullanarak delilecek deliklerin yerlerini kafatasına dikkatle çizerek veya bir cerrahi renk işaretleyicisi ile işaretleyin. Bunun koordinatları hedeflere bağlıdır, serebellar referans elektrotları için önerilen koordinatlar da dahil olmak üzere, bregma'ya referansla koordinatlar Tablo 1'deki hiperdirect yolağı için verilmiştir.
- Mikrodalga kullanarak tüm delikleri dikkatli bir şekilde delin. STN ve SNr için ortak bir delik açın (yaklaşık 2 mm x 3 mm boyutunda). Diğer tüm sondaj delikleri yaklaşık 1 mm çapında olmalıdır.
- İki ince kanülü alın (en az 27 G) ve sert bir yüzeyi veya cımbızı kullanarak uçları kanca şeklinde oluşturmak için bükün. Herhangi bir debriyoyu kaldırmak için bunları kullanınS ile delin ve dikkatli bir şekilde kesip, ortak STN / SNr deliğindeki durayı çıkarın.
- Matkap deliklerini fizyolojik salinle yıkayın. Beyni ve durayı kurumasını önlemek için matkap deliklerine her 15 dakikada bir damla fizyolojik salin uygulayın.
- Referans epidural elektrotların beyincik üzerindeki matkap delikleri arasına bir mikro delme ve eşleşen paslanmaz çelik mikro vidalar ( örn . M 1.2 mm x 2 mm vida), delik açma ve mikro vidayı vidalayın, aynı işlemi, M1 epidural elektrotlar.
- Kendi yapımı Ag / AgCl epidural elektrotları, referans elektrodları ve M1 elektrotları için delik deliğine kaydırın. Elektrot ucunu ince cımbızla yöneltin ve kafatası kemiğinin hemen altındaki matkap deliğine kaydırın.
- Tüm epidural elektrotları iki bileşenli diş akrili ile sabitleyin. Bregma noktasını kaplamayın ve ortak STN / SNr deliğini etkilemediğinden emin olun.
- Hazırlanmış tutacağı tungsten mikrowire electrod ile takınStereotaksik çerçeveye sokar.
- STN'yi hedefleyen en ventral elektrodu kalibre edin. Bilinen STN / SNr deliğinin üzerindeki hesaplanan konuma ayarlayın ve elektronları mikroskopik görüş altında beyne indirin. Tungsten mikrowire elektrotların beyne sorunsuz girdiğinden emin olun.
4. Elektrofizyolojik Haritalama ve Kayıtlar
NOT: Bu adım için, bir Faraday kafesi ve çevrimiçi filtreleme ve online sivri sıralama yapabilen kayıt yazılımı olan çok kanallı bir elektrofizyolojik kayıt sistemi gereklidir. Elektrik gürültüsünü ve eserlerini mutlak bir minimum seviyede tutmak için tercihen hayvanların başına yakın bir preamplifikatörle çalışan bir sistem kullanın. Tungsten mikro elyaf elektrotlarının yanı sıra, hiperdirekt yolağının kayıtlarını yapmak için en az bir epidural ve bir referans elektrot gereklidir. Epidural ve referencin eklenmesi önerilirElektrotları birbirlerine dokunmadan ikili olarak tutmak, bu arızalardan dolayı yardımcı olur ve veri analizinde farklı referans türlerine izin verir.
- Stereotaksik çerçevenin üstünde bir mobil Faraday kafesi koyun. Sadece durağan bir Faraday kafesi mevcutsa, stereotaksik çerçeve son konuma gelinceye kadar derin beyin elektrotlarının beynin içine indirilmediğinden emin olarak stereotaksik çerçeveyi Faraday kafesine dikkatlice hareket ettirin.
- Elektrotları elektrofizyolojik kurulumun başlama yerine bağlayın. Referans elektrotlarının uygun referans kanallarına bağlı olduğundan emin olun.
- Kayıt yazılımını kurun: Bandpass filtre (0.05-8.000 Hz) ve ham veri sinyalini yükseltin (1,500-2,000x kazanın). Doğru ayarları (LFP'ler için bant genişliği filtresi 0.05-250 Hz, MUA için bant geçiren filtre 300-8000 Hz) olan çevrimiçi bir LFP ve kuyruk filtresi kullanın. Tüm filtreler için tereyağı tipi filtre kullanın.
- Uygunsa, onlin için bir eşik eşiği ayarlayınBaşak çarpması. Çoğu kayıt yazılımı, üzerinde bir sinyalin bir başak olarak işaretlendiği bir amplitüd değeri olan bir başak eşiğinin ayarlanmasına izin verir. Bu eşik, ya filtrelenmiş diken sinyallerinin ortalama amplitüdünün bir faktörü ya da standart sapması olarak matematiksel olarak belirlenebilir ya da tercihen <500 ms'lik veri kesimlerinin görsel denetimi ile belirlenebilir ve bir grafikte sinyal gürültünün üstünde bir çizgi olarak ayarlanabilir kullanıcı arayüzü.
NOT: Bir eşik eşiğini ayarlamanın amacı, kaç tane nöronun kaydedildiği ve bunların sivri uçlarının nasıl şekillendirildiğine ilişkin bilgi sağlamak için sivri uçları saymak ve birimleri sıralamaktır. - Hiperdirect yolağı için STN olan hedefin 1 mm dorsaline yavaşça tungsten mikrowire elektrotları indirin. Gerekirse sinyalin dengelenmesini bekleyin.
- Elektrofizyolojik haritalama için, elektrotları 100 μm'lik adımlarla ventral olarak ilerletin. Her adımda, ateşleme modelini değerlendirin, ateşleyin.Sivri yedi ve şekli. Bunları Şekil 2'de verilen tipik örneklerle karşılaştırın. Çoğunlukla, yoğun çekirdekler çeşitli dorsoventral adımlar üzerinde hızlı ve sürekli bir şekilde sarmal gösterirken, elyafdan zengin yapılar daha düşük atış hızları gösterir ve sonraki ventral basamaklarda daha az homojen spike aktivitesi gösterir.
- Hiperdirect yolağı için, en çok ventral elektrotun STN içerisine girdiğinden emin olun.
NOT: MNA'da belirgin bir artış Zona incertanın ventrali tespit edildiğinde STN'e ulaşılır. Ventral STN'ye yayılma, neredeyse tamamen durur, çünkü elektrot dahili kapsüle ulaşmıştır. En ventral elektrot STN'de olduğunda, tungsten mikroelektrodların konfigürasyonu posterior, ikinci elektrodun SNr'de olmasını sağlar. Tipik MUA'yı STN ve SNr'ye aynı anda kaydetmek için küçük artışlarla dorsoventral ince ayar yapılması gerekebilir. MUA sıklığının aslında kaydedilen nöron sayısına ve seviyedeki beyin sayısına bağlı olduğunu unutmayın.aktivasyonu. - Elektrotlar istenen yapıdaysa, çevrimiçi süzme ve sivri uçlu sıralama ( Şekil 4'e bakın) ayarlayın ve ardından verilerin kaydını başlatın. LFP kayıtlarında tanımlanabilen farklı kortikal senkronizasyon durumları için tipik örnekler Şekil 3'te gösterilmektedir.
5. Deneyin Sonu
- Kayıtlar yapılırken, elektronları beyinden yavaşça kaldırın ve anında fizyolojik tuzlu su ile yıkayın. Elektrodlar, yıkama ve gözle muayene işlemlerinden sonra tekrar kullanılabilir. Bükme elektrotlarını boşaltın.
- Hayvanları aşırı dozda bir üretan (2.5 gr / kg vücut ağırlığı) IP enjeksiyonuyla euthanize edin.
NOT: Üretan sadece nihai prosedürler için kullanılmalıdır. - Elektrot konumunun histolojik olarak doğrulanması veya diğer histolojik boyama prosedürleri gerekiyorsa, kafatasından beyini çıkarın veDoku uygun bir şekilde.
NOT: İstenen boyama yöntemlerine bağlı olarak, transkardiyal perfüzyon gerekli olabilir. Elektrot pozisyonunun post-mortem doğrulaması için, standart bir Nissl boyama çoğu durumda koronal beyin bölümleri gibi elektrot rotasını görselleştirmek için yeterlidir. Histolojik hedef doğrulamayı kolaylaştırmaya yönelik daha başka yaklaşımlar, kayıt elektrodları yoluyla elektrik akımı uygulayarak veya elektrot ilavesi öncesinde biyouyumlu olan boya uygulamasıyla beyin dokusuna elektrikle uyarılmış lezyonların kullanılmasını içerir 16,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada kullanılan kayıt elektrotları ile birincil motor korteks, subtalamik çekirdek ve substantia nigra pars reticulata ve MUA'dan gelen LFP'leri STN ve SNr'den örneklemek mümkündür. Başlangıçta, LFP'ler ve çok üniteli etkinlik geniş bant sinyaliyle birlikte kaydedilir. Bundan sonra, LFP'ler ve MUA'lar bant geçiren filtrelerle ayrılır (LFP'ler için 0,05-250 Hz ve MUA için 300-4,000 Hz).
Subkortikal çekirdeklerin, özellikle STN gibi küçük yapıların doğru hedeflenmesi için, planlanan stereotaksik koordinatları online kaydedilmiş MUA sinyaliyle hizalamak avantajlıdır. STN özelliğini hedefleyen elektrod yörüngesi için MUA paterni kaydedilebilir ( Şekil 2 ) 9 , 20 .
Analizin sonraki adımları için,Çoğunlukla çok bileşenli aktiviteden tek birimleri tanımlamak için zorunludur ( Şekil 4 ).
M1'den gelen LFP kayıtlarında iki kendiliğinden dönüşümlü kortikal senkronizasyon durumu tanımlanabilir: Aktifleştirilmiş Durum (AS) ve Yavaş Dalga Aktivitesi (SWA) durumu ( Şekil 3 ) 18 , 19 . SWA durumu, yaklaşık 1 Hz'lik yüksek amplitüdli yavaş salınımlara sahipken, AS daha düşük amplitüdlü daha hızlı salınımlarla karakterizedir ( Şekil 3 ).
Şekil 1: Derin Beyin Microwire Elektrotlarının Standart Stereotaksik Tutacağıda kurulması. A için elektrot çifti arasındaki uç ayrımına dikkat edin.STN ve B, SNR için dorsoventral doğrultudaki elektrot çifti yaklaşık. 200 μm ve anterioposterior yön yaklaşık. 2 mm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: STN'yi hedefleyen bir Dorsoventral Elektrod Yörüngesinden Karakteristik Çok Birim Aktivite. ( A ) Ventral posteromedial talamik çekirdek (VPM), zona incerta (ZI), subtalamik çekirdek (STN) ve substantia nigra pars reticularis'in (SNr) çok üniteli kayıtları. VPM seyrek ve düzensiz aralıklı yüksek amplitüdlü sivri görüntüler. ZI'ye yaklaşırken bu yükselme paterni durur. Elektrot STN'ye girdiğinde, orta amplitüdlü kısa patlama ile tipik bir yüksek frekanslı ateşleme paterniUde gözlemlenebilir. SNr, yüksek amplitüd ve düzenli ateşleme paterniyle tanımlanabilir. ( B) bir sıçan stereotaktik atlas 21 görüntüleri üzerine bindirilmiş STN yörüngeler. Üst kısım: koronal plan. Alt kısım: sagittal düzlem. Elektrot ucunun VPM ve ZI yoluyla geçirilmesine dikkat edin. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3. Üretan Anestezi Sırasındaki Birincil Motor Korteksden LFP Kayıtlarındaki Kortikal Senkronizasyon Durumları. ( A ) Birincil motor korteksin temsilcisi 600 s LFP kaydı. Yüksek frekansta, düşük amplitüd aktivitesi ile Aktifleştirilmiş Durum (i) ve daha yavaş bir ritim ve yüksek periyotlarla Yavaş dalga aktivitesi durumuna (ii) karşılık gelen er genliği ayırt edilebilir. ( B ) (A) 'da sunulan LFP'lerin 0-20 Hz'lik göreli gücünü gösteren 600 s'lik bir aralık boyunca karşılık gelen zaman-frekans arsa. Isıtıcı renklendiriciler göreceli gücü daha yüksek gösterir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: Tek Birimlerin STN Çok Birimli Faaliyetten Sınıflandırılması. ( A ) Ana bileşen analizi sonrasında özellik alanındaki birim kümelerin üç boyutlu görünümü. Her küme, varsayılan bir tek birimi temsil eder. ( B ) (A) 'daki kümelere karşılık gelen başak dalga biçimleri ve başak dalga formu ortalamaları.0fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bu figürde daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
| Bregma'dan koordinatlar | STN | SNr | M1 | Referans 1 | Referans 2 |
| Ön-arka | -3,6 | -4.8 | 3,0 | -10.0 | -10.0 |
| medial yan | 2,5 | 2,5 | 3,0 | 3,0 | -3.0 |
| dorsal-ventral | -8.0 | na | na | na | na |
Tablo 1: Hyperdirect Co Kayıt için Stereotaksik KoordinatlarRtico-basal Ganglia Pathway. Tüm noktalar kafatasındaki bregma referans noktasından mm olarak ölçülür; Na- uygulanamaz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut çalışmada, yöntem, kemirgenlerde M1'i STN ve SNr'ye bağlayan hiperdirect kortiko-bazal gangliyon yolunun örneğini kullanarak, belirli bir ağın birden fazla bölgesinden eşzamanlı olarak hücre dışı elektrofizyolojik sinyallerin nasıl kaydedileceği gösterilmiştir.
STN gibi küçük subkortikal yapıların kayıt altına alınmasında kritik bir adım, kayıt elektrotlarının hedefe tam olarak rehberlik ettirilmesidir. Sunulan yöntemde, iki önemli adıma dikkat ederek hedeflemenin yüksek doğruluğu garanti edilir. Elektronlar beynin içine girmeden önce stereotaktik aparatta hayvanı hazırlarken, kafatasının "düz kafatası" pozisyonuna getirildiğinden emin olmanız kesinlikle zorunludur 22 . Düz kafatası pozisyonunu elde etmek için, stereotaktik çerçevenin kesici çubuğunun konumu, bregma ve lambda referans noktalarının yüksekliği olana kadar değiştirilir.Kafatası aynı dorsoventral düzlemde 21 . Atlaslar düz kafa kafatası pozisyonuna dayandığı için, sadece stereotaktik atlaslarda bulunan koordinatlar, bu pozisyonun sağlanmasıyla bireysel laboratuvar hayvana yüksek hassasiyetle uygulanabilir. Ayrıca, deneysel kanıtlar, bireyselleşmiş düz kafatası pozisyonunu kullanarak hedefleme doğruluğunun, kesici çubuğun 23 sabit bir ayarlamasından daha üstün olduğunu ispatlamaktadır. Kayıt elektrotlarının dorsoventral düzlemdeki pozisyonu, çok üniteli aktivitenin kaydedilmesi ile ince ayarlanmalıdır. Elektrod yörüngesi boyunca farklı çekirdek ve beyaz madde yapıları, elektrot 9 , 20'nin konumunu yeniden ayarlamak için kullanılabilen karakteristik ateş şekillerini göstermektedir ( Şekil 2 ).
Sunulan metodun bir diğer önemli adımı da,Elektron elektrodu. Sunulan protokolde serebellar korteksin üstünde bir pozisyon seçildi, çünkü bu noktada referans elektrodu, çalışmanın merkez noktası olan kortiko-bazal gangliyon aktivitesini bulmadı. Hacim iletime duyarlı analiz yöntemlerine ilgi gösteren çalışmalarda daha yerel bir referans önerilmelidir 5 .
Üretan hayvan araştırmalarında nöronal hücre dışı potansiyellerin kaydedilmesi için yaygın olarak kullanılan bir anesteziktir 11,18,24,25,26. Bunun nedeni, tek bir üretan dozunun 8 - 12 saat boyunca merkezi sinir sistemi aktivitesinin sınırlı bir depresyonuyla diğer anesteziklerle karşılaştırıldığında stabil ve uzun süreli bir narkoz oluşturabilmesidir27. Bununla birlikte, üretan anesteziA aynı zamanda sempatik sinir sistemini harekete geçirir, bu da örneğin hiperglisemi 27 gibi istenmeyen yan etkilere neden olabilir. Uzun süren aksiyonu ve anestetik etkisini antagonize edecek güçlü bir ilacın bulunmaması nedeniyle, üretan saatler veya günler ayrılmış tekrarlanan deneyler için kullanılmamalıdır. Aynı hayvanda birden fazla kayıt seansı yapılması ya da üretan kullanılmaması için teknik bir neden varsa, isofluran ile gaz anestezi ve ketamin ve ksilazin gibi ilaçların enjeksiyonları elektrofizyolojik in vivo deneyler için makul alternatifler olabilir 28 , 29 . Bu narkoz rejimlerinin dezavantajı, yarılanma ömrünün kısalmasına ve ilaçların zamanla birikmesine bağlı olarak, üretanın kullanımına göre daha sık gözlem ve ayarlamaları gerektirmesidir. Ayrıca, üreticinin fizyolojik b ile daha az müdahale edebileceğine dair kanıtlar vardır Yağmuru diğer anesteziklerden daha fazla 30 .
Buradaki detaylı kayıt koşulları, elde edilen verilerin çevrimdışı olarak nasıl işlenip analiz edileceğini eleştirel olarak belirlemektedir, bu nedenle tüm ayarları, planlanan analiz aşamalarının gerekliliklerine göre ayarlamak zorunludur. Çok kanallı ekstraselüler kayıtların analizi için birçok seçenek bulunduğu için mevcut açık kaynaklı araç kutularının kullanımı avantajlı olabilir 31 .
Hücre dışı potansiyellerin in vivo olarak kaydedilmesi, fonksiyonel manyetik rezonans görüntüleme ve kalsiyum görüntüleme 5 gibi alternatif yöntemlerden üstün olan beyin sinyallerinin benzersiz zamansal ve mekansal çözünürlüğünü sunan bir yöntemdir. Sunulan yöntem, sadece hiperdirect yolunun kaydına uygulanamaz, ancak çeşitli diğer deneysel modeller ve araştırma soruları için kolayca ayarlanabilirF "> 24 , 32 , 33. Ancak stereotaktik ameliyatı içerdiğinden uygulanamayacağı ve invaziv olmayan bir yöntem seçilecek çok sayıda araştırma ayarı vardır.
Gelecekte, yeni tedaviler bulmak için farklı nöropsikiyatrik hastalıkların altında yatan ağ disfonksiyonu konusundaki anlayışımızı daha da artırmak için, sunulan hücre dışı çok alanlı kayıt tekniğinin optogenetik araçlar ile bir kombinasyonu gerçekleştirilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Çalışmamızı finanse etmek için Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), KFO 247'ye teşekkür ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ag/AgCl custom epidural electrodes | Goodfellow GmbH D-61213 Bad Nauheim, Germany info@goodfellow.com |
Product-ID AG005127 for 99.99% silver wire | Ag/AgCl electrodes will allow for better signal quality, but may only be used in acute experiments. Possible replacement: Stainless steel electrodes |
| Stereotaxic holder with acrylic block | David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA |
Product ID Model 1770 Standard Electrode Holder | Make sure the acrylic block has recesses which suit the electrode setup for the desired target. Acrylic blocks can easily be modified with a file to obtain the desired configuration. Possible replacement: Self-constructed electrode holders |
| Tungsten microwire electrodes 1.5 MΩ impedance | Microprobes.com 18247-D Flower Hill Way Gaithersburg, Maryland, 20879 USA |
Product-ID WE3ST31.5A5-250um | The 1.5 MΩ is necessary to record MUA and LFP at the same time. Possible replacement: Microelectrodes of different materials can be used. The electrodes have to be straight, robust and as thin as possible. |
| Rat alignment tool | David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA |
Product ID Model 944 Rat Alignment Tool | Allows the exact orientation of the brain to match stereotaxic atlases. Possible replacement: Stereotaxic holder with a cannula |
| Two-component dental acrylic | Associated Dental Products Ltd. Kemdent Works, Purton, Swindon Wiltshire, SN5 4HT, United Kingdom |
Simplex Rapid Powder Clear 225g, Product code: ACR803; Simplex Rapid Liquid 150ml, Product code: ACR920 | Depending in the electrodes used, superglue might be an easy alternative, if the electrodes are small and lightweight. Possible replacement: Superglue (Cyanacrylate-based) |
| Faraday cage | Self-construction | A proper Faraday cage will be the best protection from electromagnetic artifacts, but everything which can be formed into a box shape or applied to a frame and is made of conductive material may help. Possible replacement: Aluminum foil or copper mesh | |
| Electrophysiological setup with recording software and online spike-sorting capabilities | OmniPlex® Neural Data Acquisition System Plexon Inc 6500 Greenville Avenue, Suite 700 Dallas, Texas 75206 USA |
Offline sorting software is a potential alternative, multiple scripts and softwares can be found for free in the open source community. |
References
- Lozano, A. M., Lipsman, N. Probing and regulating dysfunctional circuits using deep brain stimulation. Neuron. 77 (3), 406-424 (2013).
- Mathalon, D. H., Sohal, V. S. Neural Oscillations and Synchrony in Brain Dysfunction and Neuropsychiatric Disorders: It's About Time. JAMA Psychiatry. 72 (8), 840-844 (2015).
- Uhlhaas, P. J., Singer, W. Neuronal dynamics and neuropsychiatric disorders: toward a translational paradigm for dysfunctional large-scale networks. Neuron. 75 (6), 963-980 (2012).
- Buzsaki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).
- Buzsaki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
- Brazhnik, E., Novikov, N., McCoy, A. J., Cruz, A. V., Walters, J. R. Functional correlates of exaggerated oscillatory activity in basal ganglia output in hemiparkinsonian rats. Exp Neurol. 261, 563-577 (2014).
- Avila, I., et al. Beta frequency synchronization in basal ganglia output during rest and walk in a hemiparkinsonian rat. Exp Neurol. 221 (2), 307-319 (2010).
- Javor-Duray, B. N., et al. Early-onset cortico-cortical synchronization in the hemiparkinsonian rat model. J Neurophysiol. 113 (3), 925-936 (2015).
- Beck, M. H., et al. Short- and long-term dopamine depletion causes enhanced beta oscillations in the cortico-basal ganglia loop of parkinsonian rats. Exp Neurol. 286, 124-136 (2016).
- Magill, P. J., Bolam, J. P., Bevan, M. D. Relationship of activity in the subthalamic nucleus-globus pallidus network to cortical electroencephalogram. J Neurosci. 20 (2), 820-833 (2000).
- Magill, P. J., et al. Changes in functional connectivity within the rat striatopallidal axis during global brain activation in vivo. J Neurosci. 26 (23), 6318-6329 (2006).
- Brown, P. Abnormal oscillatory synchronisation in the motor system leads to impaired movement. Curr Opin Neurobiol. 17 (6), 656-664 (2007).
- Stein, E., Bar-Gad, I. beta oscillations in the cortico-basal ganglia loop during parkinsonism. Exp Neurol. 245, 52-59 (2013).
- Little, S., Brown, P. What brain signals are suitable for feedback control of deep brain stimulation in Parkinson's disease? Ann N Y Acad Sci. 1265, 9-24 (2012).
- Priori, A., Foffani, G., Rossi, L., Marceglia, S. Adaptive deep brain stimulation (aDBS) controlled by local field potential oscillations. Exp Neurol. , 77-86 (2013).
- Brozoski, T. J., Caspary, D. M., Bauer, C. A. Marking multi-channel silicon-substrate electrode recording sites using radiofrequency lesions. J Neurosci Methods. 150 (2), 185-191 (2006).
- Schjetnan, A. G., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. (56), (2011).
- Mallet, N., et al. Disrupted dopamine transmission and the emergence of exaggerated beta oscillations in subthalamic nucleus and cerebral cortex. J Neurosci. 28 (18), 4795-4806 (2008).
- Steriade, M. Corticothalamic resonance, states of vigilance and mentation. Neuroscience. 101 (2), 243-276 (2000).
- Maesawa, S., et al. Long-term stimulation of the subthalamic nucleus in hemiparkinsonian rats: neuroprotection of dopaminergic neurons. J Neurosurg. 100 (4), 679-687 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1998).
- Oliveira, L. M. O., Dimitrov, D. Methods for Neural Ensemble Recordings Frontiers in Neuroscience. Nicolelis, M. A. L. , (2008).
- Torres, E. M., et al. Increased efficacy of the 6-hydroxydopamine lesion of the median forebrain bundle in small rats, by modification of the stereotaxic coordinates. J Neurosci Methods. 200 (1), 29-35 (2011).
- Hadar, R., et al. Rats overexpressing the dopamine transporter display behavioral and neurobiological abnormalities with relevance to repetitive disorders. Sci Rep. 6, 39145 (2016).
- Parr-Brownlie, L. C., Poloskey, S. L., Bergstrom, D. A., Walters, J. R. Parafascicular thalamic nucleus activity in a rat model of Parkinson's disease. Exp Neurol. 217 (2), 269-281 (2009).
- Steriade, M., Nunez, A., Amzica, F. A novel slow (< 1 Hz) oscillation of neocortical neurons in vivo: depolarizing and hyperpolarizing components. J Neurosci. 13 (8), 3252-3265 (1993).
- Maggi, C. A., Meli, A. Suitability of urethane anesthesia for physiopharmacological investigations in various systems. Part 1: General considerations. Experientia. 42 (2), 109-114 (1986).
- Goldberg, J. A., Kats, S. S., Jaeger, D. Globus pallidus discharge is coincident with striatal activity during global slow wave activity in the rat. J Neurosci. 23 (31), 10058-10063 (2003).
- Karain, B., Xu, D., Bellone, J. A., Hartman, R. E., Shi, W. X. Rat globus pallidus neurons: functional classification and effects of dopamine depletion. Synapse. 69 (1), 41-51 (2015).
- Paasonen, J., et al. Comparison of seven different anesthesia protocols for nicotine pharmacologic magnetic resonance imaging in rat. Eur Neuropsychopharmacol. 26 (3), 518-531 (2016).
- Mahmud, M., Vassanelli, S. Processing and Analysis of Multichannel Extracellular Neuronal Signals: State-of-the-Art and Challenges. Front Neurosci. 10, 248 (2016).
- Hadar, R., et al. Altered neural oscillations and elevated dopamine levels in the reward pathway during alcohol relapse. Behav Brain Res. 316, 131-135 (2017).
- Voget, M., et al. Altered local field potential activity and serotonergic neurotransmission are further characteristics of the Flinders sensitive line rat model of depression. Behav Brain Res. 291, 299-305 (2015).
