Summary
Dans cette étude, la méthodologie est présentée sur la façon d'effectuer des enregistrements électrophysiologiques in vivo multi-sites à partir de la voie hyperdirect sous anesthésie uréthane.
Abstract
La convergence de la preuve montre que de nombreuses maladies neuropsychiatriques doivent être comprises comme des troubles des réseaux neuronaux à grande échelle. Pour mieux comprendre la base pathophysiologique de ces maladies, il est nécessaire de caractériser précisément de quelle manière le traitement de l'information est perturbé entre les différentes parties neuronales du circuit. En utilisant des enregistrements électrophysiologiques extracellulaires in vivo , il est possible de délimiter avec précision l'activité neuronale dans un réseau neuronal. L'application de cette méthode présente plusieurs avantages par rapport aux techniques alternatives, par exemple , l'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle et l'imagerie au calcium, car elle permet une résolution spatiale et spatiale unique et ne repose pas sur des organismes génétiquement modifiés. Cependant, l'utilisation d'enregistrements extracellulaires in vivo est limitée car il s'agit d'une technique invasive qui ne peut être appliquée universellement. Dans cet article, une méthode simple et facile à utiliser est présentée wAvec lequel il est possible d'enregistrer simultanément des potentiels extracellulaires tels que des potentiels de terrain locaux et une activité multi-unités sur plusieurs sites d'un réseau. Il est détaillé comment un ciblage précis des noyaux sous-corticaux peut être réalisé en utilisant une combinaison de chirurgie stéréotaxique et d'analyse en ligne d'enregistrements multi-unités. Ainsi, il est démontré, comment un réseau complet tel que la boucle ganglionale cortico-basale hyperdirect peut être étudié chez les animaux anesthésiés in vivo .
Introduction
Les preuves cumulatives récentes sur différents troubles neuropsychiatriques tels que la maladie de Parkinson (PD) et la schizophrénie suggèrent fortement que leur pathophysiologie est basée sur un dysfonctionnement critique de circuits neuronaux étendus qui impliquent souvent des structures corticales et sous-corticales 1 , 2 , 3 . Selon cette théorie, les manifestations cliniques des maladies résultent d'une capacité de traitement de l'information réduite d'un réseau de cellules au lieu de cellules individuelles ou d'éléments neuronaux spécifiques 1 , 2 , 3 . Afin d'améliorer la compréhension de ce groupe complexe de maladies neuropsychiatriques et de trouver de nouvelles options de traitement, il est obligatoire de caractériser la dynamique neuronale de ces réseaux désordonnés chez les patients humains et dans les modèles animaux en détail. Un excellentLa méthode pour étudier les réseaux à grande échelle chez les sujets vivants est l'enregistrement électrophysiologique multi-sites de potentiels extracellulaires 4 . En utilisant cette méthode, il est possible d'évaluer simultanément les potentiels de terrain locaux (LFP), qui représentent principalement la sommation temporelle des courants postsynaptiques excitateurs et inhibiteurs et de l'activité multi-unité (MUA), générée par des potentiels présynaptiques 5 . L'enregistrement des potentiels extracellulaires présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes alternatives pour étudier les réseaux, par exemple , l'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle et l'imagerie au calcium, car elle fournit une résolution spatiale et spatiale plus élevée et parce qu'elle ne dépend pas des organismes génétiquement modifiés 5 . Cependant, l'utilisation d'enregistrements extracellulaires in vivo est limitée car il s'agit d'une technique invasive qui ne peut être appliquée universellement.
Recette électrophysiologique in vivoLes ordonnances peuvent être effectuées chez les animaux éveillés aussi bien que chez les animaux anesthésiés 6 . Les deux méthodes sont accompagnées d'avantages et d'avantages spécifiques. Des études menées dans des animaux éveillés permettent d'enregistrer des signaux cérébraux lors de l'exécution de tâches comportementales définies, mais sont sujettes à des éléments liés au mouvement et à d'autres artefacts 7 , 8 . Les enregistrements chez les animaux anesthésiés, d'autre part, offrent l'opportunité d'évaluer les LFP et MUA avec un minimum d'artefacts dans des états de synchronisation cortical hautement définis, mais les résultats diffèrent aussi dans une certaine mesure de ce qui se trouve dans les sujets éveillés 9 , 10 , 11 .
Ces dernières années, il a été démontré que l'échantillonnage des LFP est particulièrement utile pour délimiter les changements pathologiques de l'activité du réseau. Un exemple important de cela est la recherche sur la pathophysiologie de la PD chez le patient humainS et les modèles animaux de la maladie, où il pourrait être démontré que les oscillations bêta améliorées dans la boucle des ganglions cortico-basaux sont liées aux symptômes moteurs parkinsoniens 12 , 13 . En conséquence de cette ligne de recherche, on étudie actuellement si les oscillations bêta pourraient être utilisées comme biomarqueur de rétroaction en ligne pour la stimulation cérébrale profonde en boucle fermée 14 , 15 .
Dans la présente étude, une description détaillée des enregistrements électrophysiologiques multi-sites aigus de LFP et MUA chez les rats anesthésiés avec de l'uréthane est fournie. Il est démontré comment un réseau complet, tel que la voie des ganglions cortico-basaux hyperdirect, peut être caractérisé électrophysiologiquement à l'aide d'électrodes standard et personnalisées et de la façon dont ces électrodes peuvent être construites. Il est particulièrement souligné comment un ciblage précis des noyaux des ganglions de base peut être réalisé par coMbining chirurgie stéréotaxique avec l'enregistrement en ligne des MUA.
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Protocol
Les procédures expérimentales ont été menées conformément à la loi allemande sur le bien-être animal (dernière révisée en 2014) et aux règlements européens (2010/63 / UE). Les expériences ont été approuvées par l'autorité locale de protection des animaux (LaGeSo, Berlin) et sont conformes au département local et aux lignes directrices internationales.
NOTE: Dans la méthode présentée, deux modèles d'électrodes sont utilisés pour enregistrer à partir de la voie des ganglions cortico-basal hyperdirect qui relie le cortex motrice primaire (M1) au noyau subthalamique (STN) et à la substantia nigra pars reticulate (SNr). Pour les enregistrements d'électrocorticogramme épidurale (ECoG) à partir des électrodes Ag / AgCl à faible impédance M1, elles sont utilisées. Les enregistrements de STN et SNr sont réalisés avec des électrodes de tungstène haute impédance disponibles dans le commerce.
1. Construction d'électrodes épidurales Epidural Ag / AgCl
- Prenez une env. Bande de 5 cm de longueur de fil d'argent pur de 99,99% avec un diameteR de 200 μm et enlever tout revêtement si nécessaire.
- Tenez la pointe du fil avec la pointe vers le bas dans une flamme d'un briquet ou d'une bougie jusqu'à ce que la pointe commence à fondre. Attendre jusqu'à ce que la pointe soit en forme de boule et ait un diamètre d'environ 1 mm. Couper l'électrode préformée à une longueur totale de 15 mm du début de la pointe en forme de boule à l'extrémité du fil.
- Souder un connecteur de précision à l'extrémité du fil, qui correspond au système d'enregistrement électrophysiologique utilisé. Couvrir le point de soudure de l'extrémité du fil au connecteur avec un vernis conducteur en argent. Cela aide la conductivité et aboutit à une meilleure qualité du signal.
- Une fois que le vernis conducteur a séché, recouvrir le point de soudure avec un tube thermorétractable de 3 mm à 1 mm. Utilisez avec précaution un marteau d'horloger pour aplatir la pointe en forme de boule à la moitié de l'épaisseur.
- Mettez des gants d'examen et prenez un chiffon sans peluches à 100% d'éthanol pour éliminer toute saleté et graisse.
- Mettez les électrodes dansUn tube de centrifugation de 15 ml ou un tube de culture cellulaire et le remplir avec de l'eau de Javel domestique (ATTENTION: contenant 2,8 g d'hypochlorure de sodium par solvant de 100 g) jusqu'à ce que la pointe en forme de boule soit complètement recouverte.
ATTENTION: L'agent de blanchiment au chlore est corrosif; Respectez toujours les consignes de sécurité du fabricant. - Retirez les électrodes après 23 minutes et lavez-les généreusement avec de l'eau distillée. L'application réussie d'une couche de chlorure d'argent apparaît comme un changement de couleur pourpre homogène.
- Sécher dans l'air. Après avoir complètement séché, prendre les électrodes avec des pinces fines. Avec un pinceau fin, appliquez une isolation électrique liquide. Commencez sur le fil directement derrière l'extrémité de l'électrode et couvrez tout jusqu'au tube thermorétractable. Laissez sécher l'isolant pendant au moins 2 h.
- Pour un contrôle de qualité, vérifiez la conductivité électrique avec un multimètre. Si disponible, effectuer un test d'impédance à 1 kHz en utilisant un impédanceur approprié, alors que l'électrode et le testLes sondes sont assemblées dans une solution contenant 0,2% de NaCl contenant H 2 O sans se toucher. Les valeurs d'impédance à 1 kHz doivent être d'environ 8 kΩ.
2. Fixation des électrodes à un support stéréotaxique
REMARQUE: Pour enregistrer MUA et LFP en même temps, utilisez des électrodes à micro-ondes de tungstène avec une impédance de 1,5 MΩ. Si l'accent est mis sur les enregistrements de haute qualité d'unités individuelles, choisissez des électrodes à micro-ondes avec une impédance plus élevée (> 5 MΩ). Si le but de l'étude est uniquement dirigé vers les LFP, les électrodes à impédances inférieures peuvent être acceptées. Pour les petites structures, pour lesquelles des ajustements stéréotaxiques dorsoventral sont souvent nécessaires, utilisez des paires d'électrodes avec une séparation appropriée du boutsoventral (250 μm). En outre, cela fournit l'avantage d'une électrode de référence plus locale, si nécessaire. Les coordonnées stéréotaxiques sont toujours mesurées à partir de l'électrode la plus basse et uneRe calculé en référence au bregma.
- Prenez un support d'électrode stéréotaxique standard avec un bloc acrylique et une pince et placez-le solidement sur une surface plane dans le champ de vision d'un microscope chirurgical.
- Fixez légèrement la première paire d'électrodes au bloc acrylique du support avec des morceaux de ruban adhésif (3 mm x 8 mm) à l'aide d'une pince fine. Les électrodes doivent dépasser le bloc acrylique env. 12 mm.
- Fixez soigneusement la deuxième électrode bipolaire à côté de la première électrode. Pour cibler les structures de la voie hyperdirect, la distance doit être de 2 mm ( Figure 1 ). Pour la plupart des supports d'électrodes stéréotaxiques standard, il s'agit de l'évidement adjacent. Utilisez une jauge d'étanchéité pour vérifier. Différents réseaux peuvent être abordés de la même manière. Pour cela, le bloc acrylique peut être tourné dans une certaine mesure.
- Réglez la deuxième paire d'électrodes en la faisant glisser soigneusement dans une position, dans laquelle la pointe la plus ventrale est d'environ 200Μm encastré par rapport à la première électrode ( figure 1 ). Faites ceci sous une vision microscopique. Pour cela, utilisez une canule 30 G (diamètre extérieur 300 μm) pour mieux estimer la distance.
- Appuyez sur le ruban adhésif, puis fixez-le avec la pince métallique du support.
3. Chirurgie
- Pour les enregistrements électrophysiologiques, utilisez de l'uréthane (ATTENTION) pour l'anesthésie.
Attention: l'uréthane est toxique et cancérogène, respecter les consignes de sécurité et la fiche de données fournies par le fabricant de la substance. - Préparez une solution d'uréthane à 200 mg / ml dans une solution saline médicamenteuse à base de NaCl à 0,9%.
- Administrer un total de 1,3 g / kg d'uréthane par voie intrapéritonéale (IP). En fonction de la souche du rat, il peut être raisonnable de diviser la dose en deux doses avec un intervalle de 15 minutes entre les injections afin d'améliorer la sécurité de l'anesthésie.
- Vérifier la profondeur de l'anesthésie en utilisant pRéflexe de retrait edal et autres réflexes appropriés. Si l'anesthésie n'est pas assez profonde pour effectuer une intervention chirurgicale, injectez 0,15 g / kg de poids corporel d'uréthane et attendez encore 15 minutes.
- Appliquer une pommade oculaire pour prévenir la déshydratation de la cornée.
- Surveiller de manière constante la fréquence respiratoire et le réflexe de retrait de la pédale pendant l'anesthésie. Utilisez un coussin de chauffage animal petit avec contrôle de la température pour assurer une température physiologique du corps pendant toute la chirurgie. Avant le début des enregistrements électrophysiologiques, passez à une alternative non électrique ( p. Ex. Tête de tête d'acétate de sodium).
- Raser la fourrure le long du côté dorsal de la tête pour obtenir un champ chirurgical propre. Désinfectez autour du site d'incision avec un désinfectant chirurgical approprié. Fixez l'animal dans le cadre stéréotaxique.
- Effectuer une incision de 2 cm de long du cuir chevelu dans la direction sagittale avec un scalpel. Utilisez un scalpel pour gratter légèrement l'aponévrose du crâne et désinfecter le crâne. Utilisez coTton bourré dans 3% de H 2 O 2 pour éliminer tout tissu restant.
- Utilisez un électrocuteur ou une thermocoupe pour contrôler les saignements, si nécessaire. Arrêtez les saignements de l'os du crâne et de l'hypoderme, si le saignement ne s'arrête pas spontanément après 1-2 minutes et entrave la vue sur le crâne.
- Réglez la barre d'incisive jusqu'à ce que la tête soit positionnée en position de crâne plate, ce qui signifie que le bregma et lambda sont des points de référence stéréotaxiques dans le même plan. Ceci est très important pour obtenir une haute précision chirurgicale. Utilisez un outil d'alignement stéréotaxique standard pour les rats, calibrez l'extrémité désignée vers le bregma sous une vision microscopique et ajustez la barre des incisives jusqu'à ce que les points désignés pour le bregma et lambda sur l'outil touchent le crâne en même temps.
REMARQUE: Une vue d'un côté avec une lumière focalisée de l'autre peut aider à déterminer cette condition. Alternativement, prenez un support stéréotaxique avec une canule fine et mesurez les coordonnées dorsoventral de Bregma aNd lambda sous vision microscopique. Réglez la barre des incisives jusqu'à ce que les coordonnées dorsoventral de Bregma et lambda soient identiques. - Utilisez un support stéréotaxique avec de la canule, étalonnez sur le bregma, puis calculez la position de tous les trous de forage sur le crâne. En utilisant le support stéréotaxique, marquer les positions des trous à forer soit en grattant soigneusement le crâne ou en utilisant un marqueur de couleur chirurgical. Les coordonnées dépendent des cibles, les coordonnées en référence au bregma sont données pour la voie hyperdirect du tableau 1 , y compris les coordonnées suggérées pour les électrodes de référence cérébelleuses.
- À l'aide d'un microdrille, percez soigneusement tous les trous. Pour le STN et SNr, percer un trou commun (environ 2 mm x 3 mm de taille). Tous les autres forages devraient avoir un diamètre d'environ 1 mm.
- Prenez deux canules fines (au moins 27 G) et pliez leurs pointes pour former une forme accrochée, en utilisant une surface dure ou une pince à épiler. Utilisez-les pour éliminer tout débentS à partir des trous de forage, et couper et retirer soigneusement la dure-mère dans le trou commun STN / SNr.
- Rincer les forages avec une solution physiologique physiologique. Appliquer une goutte de solution saline physiologique toutes les 15 minutes aux trous de forage pour éviter que le cerveau et la dure-mère ne se dessèchent.
- Prenez une microdigue et une micro-vis en acier inoxydable ( p. Ex. Une vis M 1,2 mm x 2 mm), percez un trou et vissez une micro-vis entre les trous de forage des électrodes épidurales de référence au-dessus du cervelet, faites la même chose pour M1 électrodes péridurales.
- Glisser les électrodes péridurales Ag / AgCl auto-construites dans les trous de forage pour les électrodes de référence et les électrodes M1. Guidez l'extrémité de l'électrode avec des pinces fines et faites-le glisser directement sous l'os du crâne dans le trou de forage.
- Réparez toutes les électrodes épidurales à l'acrylique dentaire à deux composants. Assurez-vous de ne pas couvrir le point Bregma ni affecter le trou commun STN / SNr.
- Insérez le support préparé avec l'électrode à micro-ondes de tungstèneEst dans le cadre stéréotaxique.
- Calibrer l'électrode la plus ventrale, destinée à cibler le STN, vers le bregma. Réglez la position calculée au-dessus du trou STN / SNr commun et abaissez les électrodes vers le cerveau sous une vision microscopique. Assurez-vous que les électrodes à micro-ondes de tungstène pénètrent parfaitement dans le cerveau.
4. Cartographie électrophysiologique et enregistrements
REMARQUE: pour cette étape, une cage Faraday et un système d'enregistrement électrophysiologique multicanal avec un logiciel d'enregistrement capable de filtrer en ligne et de tri en ligne est nécessaire. Utilisez de préférence un système qui fonctionne avec un préamplificateur placé près de la tête des animaux afin de garder le bruit électrique et les artefacts au minimum. Outre les électrodes à micro-ondes de tungstène, au moins une électrode péridurale et une électrode de référence sont nécessaires pour effectuer des enregistrements de la voie hyperdirect. Il est recommandé d'insérer la péridurale et la référenceE les électrodes par paire sans qu'elles se touchent, cela aide en cas de dysfonctionnement et permet différents types de référencement dans l'analyse des données.
- Placez une cage mobile Faraday au-dessus du cadre stéréotaxique. Si seulement une cage stationnaire de Faraday est disponible, déplacer soigneusement le cadre stéréotaxique dans la cage de Faraday tout en s'assurant que les électrodes profondes du cerveau ne sont pas abaissées dans le cerveau jusqu'à ce que le cadre stéréotaxique soit dans sa position finale.
- Connectez les électrodes à la prise de courant de la configuration électrophysiologique. Assurez-vous que les électrodes de référence sont connectées aux canaux de référence appropriés.
- Configurez le logiciel d'enregistrement: Filtre passe-bande (0.05-8.000 Hz) et amplifiez (gain 1,500-2,000x) le signal de données brutes. Utilisez un filtre en ligne LFP et spike avec les paramètres appropriés (filtre passager 0.05-250 Hz pour les LFP, filtre passe-bande 300-8,000 Hz pour MUA). Pour tous les filtres, utilisez un filtre type butterworth.
- Mettre en place un seuil de pointe, le cas échéant, pour onlinE spike sorting. La plupart des logiciels d'enregistrement permettent la mise en place d'un seuil de pointe, qui est une valeur d'amplitude au-dessus de laquelle un signal est marqué comme un point par le logiciel. Ce seuil peut être déterminé mathématiquement en tant que facteur ou écart type de l'amplitude moyenne du signal de pointe filtré, ou peut être déterminé de préférence par inspection visuelle de segments de données <500 ms et configuré comme une ligne au-dessus du bruit de signal dans un graphique interface utilisateur.
REMARQUE: l'intention dans la configuration d'un seuil de pointe est de compter les pointes et les unités de tri afin de fournir des informations sur le nombre de neurones actuellement enregistrés et sur la façon dont leurs pointes sont façonnées. - Abaissez lentement les électrodes à micro-ondes de tungstène à 1 mm de dorsale de la cible, qui est STN pour une voie hyperdirect. Attendez que le signal se stabilise si nécessaire.
- Pour la cartographie électrophysiologique, avancez progressivement les électrodes par étapes de 100 μm. À chaque étape, évaluer le modèle de tir, tirerMangé et forme des pointes. Comparez ceux avec les exemples typiques donnés dans la Figure 2 . Généralement, les noyaux denses montrent des pointes rapides et continues sur plusieurs étapes dorsoventales, tandis que les structures riches en fibres présentent des taux de tir bas et une activité de pic moins homogène dans les étapes ventrales subséquentes.
- Pour la voie hyperdirect, assurez-vous que l'électrode la plus ventrale est à l'intérieur de STN.
NOTE: Le STN est atteint lorsqu'une augmentation considérable de MUA est détectée ventral de Zona incerta. Ventral à la STN, le pointage s'arrête presque complètement parce que l'électrode a atteint la capsule interne. Lorsque l'électrode la plus ventrale est en STN, la configuration des microélectrodes de tungstène garantit que la seconde électrode postérieure est en SNr. Dorsoventral de réglage fin en petits incréments pourrait être nécessaire pour enregistrer MUA typique dans STN et SNr en même temps. Notez que la fréquence de MUA dépend du nombre de neurones effectivement enregistrés et au niveau du cerveauActivation. - Une fois que les électrodes sont dans les structures souhaitées, configurez le filtrage en ligne et le tri de pointes (voir la Figure 4 ), puis commencez l'enregistrement des données. Des exemples typiques pour les différents états de synchronisation cortical qui peuvent être identifiés dans les enregistrements LFP sont présentés à la Figure 3 .
5. Fin de l'expérience
- Lorsque les enregistrements sont terminés, élevez lentement les électrodes hors du cerveau et évacuez-les instantanément avec une solution saline physiologique. Les électrodes peuvent être réutilisées après un rinçage complet et une inspection visuelle. Electrodes de flexion de décharge.
- Euthanaser les animaux par injection IP d'un surdosage d'uréthane (2,5 g / kg de poids corporel).
REMARQUE: L'uréthane ne doit être utilisé que pour les procédures finales. - Si une vérification histologique de la position de l'électrode ou d'autres procédures de coloration histologique est nécessaire, retirez le cerveau du crâne etLes tissus de manière appropriée.
NOTE: Selon les méthodes de coloration prévues, une perfusion transcardiale peut être nécessaire. Pour la vérification post mortem de la position de l'électrode, une coloration Nissl standard est suffisante dans la plupart des cas pour visualiser la trajectoire de l'électrode, par exemple dans les coupes coronal du cerveau. D'autres approches pour faciliter la vérification de la cible histologique comprennent l'utilisation de lésions induites par l'électricité dans le tissu cérébral en appliquant un courant électrique via les électrodes d'enregistrement ou l'application de colorant biocompatible avant l'insertion d'électrode 16 , 17 .
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Representative Results
Avec les électrodes d'enregistrement utilisées ici, il est possible d'échantillonner les LFP du cortex moteur primaire, du noyau subthalamique et de la substantia nigra pars reticulata et MUA de STN et SNr. Initialement, les LFP et les activités multi-unités sont enregistrées ensemble dans un signal à large bande. Par la suite, les LFP et les MUA sont séparés par des filtres passe-bande (0,05-250 Hz pour les LFP et 300-4 000 Hz pour MUA).
Pour le ciblage correct des noyaux sous-corticaux, en particulier des petites structures telles que le STN, il est avantageux d'aligner les coordonnées stéréotaxiques planifiées avec le signal MUA enregistré en ligne. Pour la trajectoire de l'électrode ciblant la caractéristique STN, le modèle MUA peut être enregistré ( Figure 2 ) 9 , 20 .
Pour les étapes ultérieures de l'analyse, il estSouvent obligatoire pour définir des unités individuelles à partir de l'activité multi-unités par analyse de composants principaux ( Figure 4 ).
Dans les enregistrements LFP de la M1, deux états de synchronisation corticale alternant spontanément peuvent être identifiés: l'état activé (AS) et l'état de l'activité des ondes lente (SWA) ( Figure 3 ) 18 , 19 . Alors que l'état SWA est dominé par des oscillations lentes à grande amplitude d'environ 1 Hz, l'AS se caractérise par des oscillations plus rapides avec une amplitude inférieure ( Figure 3 ).
Figure 1: Mise en place des électrodes Deep Brain Microwire dans un support stéréotaxique standard. Notez la séparation des pointes entre A, la paire d'électrodes pour laSTN et B, la paire d'électrodes pour SNr en direction dorsoventral d'env. 200 μm et direction antério-directionnelle d'env. 2 mm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Caractéristique Activité multi-unité d'une trajectoire d'électrode Dorsoventral ciblant la STN. ( A ) Enregistrements multi-unités du noyau thalamique posteromedial ventral (VPM), de la zona incerta (ZI), du noyau subthalamique (STN) et de la substantia nigra pars reticularis (SNr). Le VPM présente des pointes spacieuses et irrégulières à grande amplitude. Ce schéma de pointes cesse d'approcher le ZI. Lorsque l'électrode entre dans le STN un modèle typique de tir à haute fréquence avec des rafales courtes avec un amplit moyenUde peut être observé. Le SNr peut être identifié par son amplitude élevée et son modèle de tir régulier. ( B) Trajectoires STN superposées aux images d'un atlas stéréotaxique de rat 21 . Partie supérieure: plan coronal. Partie inférieure: plan sagittal. Notez le passage de la pointe de l'électrode via VPM et ZI. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3. États de synchronisation corticale dans les enregistrements LFP du cortex principal du moteur lors de l'anesthésie uréthane. ( A ) Représentant 600 s Enregistrement LFP du cortex moteur primaire. Périodes de temps avec une activité à haute fréquence, faible amplitude correspondant à l'état activé (i) et périodes avec un rythme plus lent et plus élevé L'amplitude de l'amplitude correspondant à l'état de l'activité de la vague lente (ii) peut être différenciée. ( B ) Placage temps-fréquence correspondant sur un intervalle de 600 s illustrant la puissance relative 0-20 Hz des LFP présentés dans (A). Les colorants plus chauds indiquent une puissance relative plus élevée. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Tri des unités individuelles de STN Multi-Unit Activity. ( A ) Vue tridimensionnelle des clusters d'unités dans l'espace de fonctionnalité après analyse des composants principaux. Chaque grappe représente une seule unité putative. ( B ) Les formes d'onde de Spike et les moyennes de forme d'onde de pointe correspondent aux grappes dans (A).0fig4large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Coordonnées de Bregma | STN | SNr | M1 | Référence 1 | Référence 2 |
| antérieur postérieur | -3,6 | -4,8 | +3.0 | -10,0 | -10,0 |
| Médian-latéral | +2,5 | +2,5 | +3.0 | +3.0 | -3,0 |
| Dorsale-ventrale | -8,0 | n / a | n / a | n / a | n / a |
Tableau 1: Coordonnées stéréotaxiques pour l'enregistrement de Hyperdirect CoRicanal Ganglia Pathway. Tous les points sont mesurés à partir du point de référence bregma sur le crâne en mm; Na- non applicable.
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Discussion
Dans la présente étude, la méthode montre comment enregistrer simultanément les signaux électrophysiologiques extracellulaires à partir de sites multiples d'un réseau donné en utilisant l'exemple de la voie des ganglions cortico-basal hyperdirect qui relie le M1 avec le STN et SNr chez les rongeurs.
Une étape critique dans l'enregistrement de petites structures sous-corticales telles que le STN est l'insertion guidée avec précision des électrodes d'enregistrement dans la cible. Dans la méthode présentée, la prise en charge de deux étapes cruciales garantit une grande précision du ciblage. Lors de la préparation de l'animal dans l'appareil stéréotaxique avant que les électrodes ne soient introduites dans le cerveau, il est absolument obligatoire de s'assurer que le crâne est introduit dans la position "crâne plat" 22 . Pour atteindre la position plate du crâne, la position de la barre incisive du cadre stéréotaxique est modifiée jusqu'à la hauteur des points de référence bregma et lambda oLe crâne est au même plan dorsoventral 21 . Seulement en assurant cette position, les coordonnées trouvées dans les atlas stéréotaxiques peuvent être appliquées avec un niveau de précision élevé à l'animal de laboratoire individuel, puisque les atlas sont basés sur la position plate du crâne 21 . En outre, des preuves expérimentales prouvent que la précision de ciblage utilisant une position de crâne plate individualisée est supérieure à un ajustement fixe de la barre d'incisive 23 . La position des électrodes d'enregistrement dans le plan dorsoventral doit être affinée en enregistrant constamment l'activité multi-unités. Les différentes structures de noyaux et de matières blanches le long de la trajectoire de l'électrode montrent des motifs de feu caractéristiques ( Figure 2 ) qui peuvent être utilisés pour réajuster la position de l'électrode 9 , 20 .
Une autre étape importante dans la méthode présentée est le placement du rÉlectrode de distribution. Dans le protocole présenté, une position au-dessus du cortex cérébelleux a été choisie, car à ce stade, l'électrode de référence ne détecte pas l'activité des ganglions cortico-basal qui était le point central de l'étude. Dans les études intéressant les méthodes d'analyse qui sont sensibles à la conduction du volume, une référence plus locale devrait être favorisée 5 .
L'uréthane est un anesthésique largement utilisé pour l'enregistrement des potentiels extracellulaires neuronaux dans la recherche sur les animaux 11 , 18 , 24 , 25 , 2 6 . La raison en est qu'une dose unique d'uréthane peut produire une narcose stable et durable pendant 8 à 12 h avec seulement une dépression limitée de l'activité du système nerveux central par rapport à d'autres anesthésiques 27 . Cependant, l'anesthésie d'uréthaneA active également le système nerveux sympathique, ce qui peut entraîner des effets secondaires indésirables tels que, par exemple, une hyperglycémie 27 . En raison de son action durable et de l'absence d'un médicament puissant pour antagoniser son effet anesthésique, l'uréthane ne doit pas être utilisé pour des expériences répétées qui sont séparées par des heures ou des jours. Si l'on envisage de faire plusieurs sessions d'enregistrement sur un même animal ou s'il existe une raison technique pour ne pas utiliser l'uréthane, l'anesthésie gazeuse avec l'isoflurane et les injections de médicaments comme la kétamine et la xylazine peuvent être des alternatives raisonnables pour les expériences électrophysiologiques in vivo 28 , 29 . L'inconvénient de ces régimes de narcosis est qu'ils nécessitent une surveillance et des ajustements plus fréquents que l'utilisation de l'uréthane, en raison de leur faible demi-vie et de l'accumulation des médicaments au fil du temps. En outre, il est prouvé que l'uréthane pourrait interférer moins avec le b physiologique Activité de pluie que d'autres anesthésiques 30 .
Toutes les conditions d'enregistrement détaillées ici déterminent de manière critique comment les données obtenues peuvent être traitées plus avant et analysées hors ligne, il est donc obligatoire d'ajuster tous les paramètres aux exigences des étapes d'analyse planifiées. Comme il existe de nombreuses options pour l'analyse d'enregistrements extracellulaires multicanaux, l'utilisation de boîtes à outils open-source disponibles peut être avantageuse 31 .
L'enregistrement des potentiels extracellulaires in vivo est une méthode qui offre une résolution temporelle et spatiale unique des signaux cérébraux qui est supérieure à d'autres méthodes telles que l'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle et l'imagerie au calcium 5 . La méthode présentée peut non seulement être appliquée à l'enregistrement de la voie hyperdirect, mais peut être facilement ajustée à d'autres modèles expérimentaux et des questions de rechercheF "> 24 , 32 , 33. Cependant, puisqu'il implique une chirurgie stéréotaxique, il existe de nombreux paramètres de recherche où il ne peut pas être appliqué et où une méthode non invasive doit être sélectionnée.
À l'avenir, une combinaison de la technique d'enregistrement extra-cellulaire extra-cellulaire présentée avec des outils opto-génétiques devrait être améliorée afin de mieux comprendre le dysfonctionnement du réseau sous-jacent à différentes maladies neuropsychiatriques afin de trouver de nouveaux traitements.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Nous remercions la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), KFO 247, de financer notre étude.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ag/AgCl custom epidural electrodes | Goodfellow GmbH D-61213 Bad Nauheim, Germany info@goodfellow.com |
Product-ID AG005127 for 99.99% silver wire | Ag/AgCl electrodes will allow for better signal quality, but may only be used in acute experiments. Possible replacement: Stainless steel electrodes |
| Stereotaxic holder with acrylic block | David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA |
Product ID Model 1770 Standard Electrode Holder | Make sure the acrylic block has recesses which suit the electrode setup for the desired target. Acrylic blocks can easily be modified with a file to obtain the desired configuration. Possible replacement: Self-constructed electrode holders |
| Tungsten microwire electrodes 1.5 MΩ impedance | Microprobes.com 18247-D Flower Hill Way Gaithersburg, Maryland, 20879 USA |
Product-ID WE3ST31.5A5-250um | The 1.5 MΩ is necessary to record MUA and LFP at the same time. Possible replacement: Microelectrodes of different materials can be used. The electrodes have to be straight, robust and as thin as possible. |
| Rat alignment tool | David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA |
Product ID Model 944 Rat Alignment Tool | Allows the exact orientation of the brain to match stereotaxic atlases. Possible replacement: Stereotaxic holder with a cannula |
| Two-component dental acrylic | Associated Dental Products Ltd. Kemdent Works, Purton, Swindon Wiltshire, SN5 4HT, United Kingdom |
Simplex Rapid Powder Clear 225g, Product code: ACR803; Simplex Rapid Liquid 150ml, Product code: ACR920 | Depending in the electrodes used, superglue might be an easy alternative, if the electrodes are small and lightweight. Possible replacement: Superglue (Cyanacrylate-based) |
| Faraday cage | Self-construction | A proper Faraday cage will be the best protection from electromagnetic artifacts, but everything which can be formed into a box shape or applied to a frame and is made of conductive material may help. Possible replacement: Aluminum foil or copper mesh | |
| Electrophysiological setup with recording software and online spike-sorting capabilities | OmniPlex® Neural Data Acquisition System Plexon Inc 6500 Greenville Avenue, Suite 700 Dallas, Texas 75206 USA |
Offline sorting software is a potential alternative, multiple scripts and softwares can be found for free in the open source community. |
References
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