Summary
في هذه الدراسة، يتم تقديم منهجية حول كيفية تنفيذ متعدد المواقع في الجسم الحي التسجيلات الكهربية من مسار هيبيرديركت تحت يوريتان التخدير.
Abstract
وتظهر الأدلة المتقاربة أن العديد من الأمراض العصبية والنفسية ينبغي أن يفهم على أنه اضطرابات في شبكات الخلايا العصبية واسعة النطاق. لفهم أفضل الأساس الفيزيولوجي المرضي لهذه الأمراض، فمن الضروري أن يميز بدقة في الطريقة التي يتم فيها انزعاج معالجة المعلومات بين الأجزاء العصبية المختلفة من الدائرة. باستخدام خارج الخلية في الجسم الحي التسجيلات الكهربية، فمن الممكن أن تحدد بدقة نشاط الخلايا العصبية داخل شبكة الخلايا العصبية. تطبيق هذا الأسلوب له العديد من المزايا على التقنيات البديلة، على سبيل المثال ، التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي والتصوير الكالسيوم، كما أنه يسمح القرار الزماني والمكاني الفريد ولا تعتمد على الكائنات المعدلة وراثيا. ومع ذلك، فإن استخدام خارج الخلية في التسجيلات الجسم الحي محدودة لأنها تقنية الغازية التي لا يمكن تطبيقها عالميا. في هذه المقالة، يتم تقديم طريقة بسيطة وسهلة الاستخدام ثإيث التي من الممكن أن تسجل إمكانات خارج الخلية في وقت واحد مثل إمكانيات الحقل المحلية والنشاط مولتيونيت في مواقع متعددة من الشبكة. ومن المفصل كيف يمكن تحقيق استهداف دقيق من نوى تحت القشرية باستخدام مزيج من الجراحة المجسم والتحليل على الانترنت من تسجيلات متعددة الوحدات. وهكذا، يتضح، كيف يمكن دراسة شبكة كاملة مثل حلقة العقد القاعدية القاعدية هيبيرديركت في الحيوانات تخدير في الجسم الحي .
Introduction
الأدلة التراكمية الأخيرة على مختلف الاضطرابات العصبية والنفسية مثل مرض باركنسون (بد) والفصام تشير بقوة إلى أن الفيزيولوجيا المرضية الخاصة بهم على أساس اختلال وظيفي حرج في الدوائر العصبية الموسعة التي غالبا ما تنطوي على الهياكل القشرية والقشرية تحت القشرية 1 ، 2 ، 3 . وفقا لهذه النظرية، المظاهر السريرية للأمراض تنشأ نتيجة ضعف القدرة على معالجة المعلومات من شبكة من الخلايا بدلا من خلايا واحدة أو العناصر العصبية محددة 1 ، 2 ، 3 . من أجل تعزيز فهم هذه المجموعة المعقدة من الأمراض العصبية والنفسية وإيجاد خيارات جديدة للعلاج، فمن إلزامي لتوصيف ديناميات الخلايا العصبية من تلك الشبكات المختللة في المرضى البشريين وفي النماذج الحيوانية بتفصيل كبير. امتيازطريقة لدراسة الشبكات واسعة النطاق في الكائنات الحية هو تسجيلات الكهربية متعددة المواقع من إمكانيات خارج الخلية 4 . وباستخدام هذه الطريقة، من الممكن تقييم إمكانات المجال المحلي في نفس الوقت، والتي تمثل في المقام الأول التجميد الزمني للتيارات المشبكية المثبطة والتثبيطية والنشاط المتعدد الوحدات (موا)، الذي يتم توليده من خلال إمكانيات ما قبل المشبكية 5 . تسجيل إمكانات خارج الخلية لديه العديد من المزايا على الطرق البديلة لدراسة الشبكات، على سبيل المثال ، التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي والتصوير الكالسيوم، لأنه يوفر أعلى القرار الزماني والمكاني ولأنه لا يعتمد على الكائنات المعدلة وراثيا 5 . ومع ذلك، فإن استخدام خارج الخلية في التسجيلات الجسم الحي محدودة لأنها تقنية الغازية التي لا يمكن تطبيقها عالميا.
في الجسم الحي ريك الكهربيةيمكن تنفيذ الأوامر في مستيقظا وكذلك في الحيوانات تخدير 6 . ويرافق كلتا الطريقتين من إيجابيات وسلبيات محددة. الدراسات في الحيوانات مستيقظا تسمح بتسجيل إشارات الدماغ أثناء أداء المهام السلوكية محددة، ولكن عرضة للحركة ذات الصلة وغيرها من التحف 7 ، 8 . التسجيلات في الحيوانات تخدير من ناحية أخرى توفر الفرصة لتقييم اللاعبين ذوي الإعاقة و موا مع الحد الأدنى من التحف في حالات تزامن القشرية محددة للغاية، ولكن النتائج تختلف أيضا إلى حد ما إلى ما يمكن العثور عليها في المواضيع مستيقظا 9 ، 10 ، 11 .
وقد ثبت في السنوات الأخيرة أن أخذ عينات من الأطراف الفاعلة الحرجية مفيد بوجه خاص لتحديد التغيرات المرضية في نشاط الشبكة. مثال بارز على ذلك هو البحث في الفيزيولوجيا المرضية بد في المريض البشريs والنماذج الحيوانية للمرض، حيث يمكن أن تظهر أن التذبذبات بيتا معززة في حلقة العقد القاعدية القاعدية ترتبط أعراض السيارات باركنسوني 12 ، 13 . ونتيجة لهذا الخط البحثي، يتم التحقيق حاليا إذا كان يمكن استخدام التذبذبات بيتا باعتبارها المؤشرات الحيوية ردود الفعل على الانترنت لتحفيز حلقة عميقة الدماغ العميق 14 ، 15 .
في هذه الدراسة، يتم تقديم وصفا تفصيليا من موقع متعدد الحادة في الجسم الحي التسجيلات الكهربية من مركبات القوى العاملة و موا في الفئران تخدير مع يوريتان. ويتبين كيف يمكن لشبكة كاملة، مثل هيبيرديركت كورتيكو-باسال العقد العقد يمكن وصف الكهربية باستخدام أقطاب القياسية والمخصصة وكيف يمكن لتلك الأقطاب أن تكون بناء. ويؤكد بشكل خاص كيف يمكن أن يكون الهدف الدقيق لاستهداف نوى العقد القاعدية من قبل المشتركوربط الجراحة المجسمة جنبا إلى جنب مع تسجيل مواس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت إجراءات تجريبية وفقا لقانون رعاية الحيوان الألماني (التنقيح الأخير في عام 2014) والأنظمة الأوروبية (2010/63 / الاتحاد الأوروبي). تمت الموافقة على التجارب من قبل سلطة رعاية الحيوان المحلية (لاجيسو، برلين)، وتتوافق مع الإدارة المحلية والمبادئ التوجيهية الدولية.
ملاحظة: في طريقة العرض يتم استخدام نموذجين من الأقطاب الكهربائية لتسجيل من مسار العقدة القاعدية القاعدية هيبيرديركت الذي يربط القشرة الحركية الأولية (M1) مع نواة تحت المهاد (ستن) والأصلية نيجرا بارس ريتيكولات (شنر). ل إيبيدورال إليكتروكورتيكوغرام (إكوغ) تسجيلات من M1 مصنوعة خصيصا منخفضة مقاومة أغ / أجكل أقطاب تستخدم. يتم إجراء التسجيلات من ستن و شنر مع المتاحة تجاريا عالية المقاومة أقطاب التنغستن.
1. بناء إبيدورال حج / أجكل إبيدورال أقطاب
- خذ تقريبا. 5 سم شريط طويل من 99.99٪ الفضة النقية الأسلاك مع دياميتيr من 200 ميكرون وإزالة أي طلاء إذا لزم الأمر.
- عقد طرف السلك مع تلميح إلى أسفل إلى لهب أخف وزنا أو شمعة حتى يبدأ طرف تذوب. انتظر حتى طرف على شكل الكرة ويبلغ قطرها حوالي 1 ملم. قطع القطب بريفورمد إلى طول إجمالي 15 ملم من بداية طرف على شكل الكرة إلى نهاية السلك.
- لحام موصل الدقة إلى نهاية الأسلاك، الذي يناسب نظام تسجيل الكهربية المستخدمة. تغطية نقطة لحام من نهاية الأسلاك إلى موصل مع موصل الفضة الورنيش. وهذا يساعد على التوصيلية والنتائج في جودة إشارة أفضل.
- بعد تجفيف الورنيش موصل، وتغطي نقطة لحام مع 3 ملم إلى 1 ملم الحرارة تقلص أنبوب. استخدام بعناية مطرقة الساعاتي لتسطيح طرف على شكل الكرة إلى نصف سمك.
- ضع قفازات الفحص واتخذ قطعة قماش خالية من الوبر مع إيثانول بنسبة 100٪ لإزالة أي أوساخ وشحوم.
- وضع الأقطاب فيأنبوب 15 مل من الطرد المركزي أو أنبوب ثقافة الخلية وملئه مع الكلور المنزلية التبييض (تنبيه؛ تحتوي على 2.8 غرام من هيبوكلوريد الصوديوم لكل 100 غرام المذيبات) حتى غيض على شكل الكرة مغطاة بالكامل.
تنبيه: الكلور التبييض هو تآكل. اتبع دائما تعليمات أمان الشركة الصانعة. - أخذ الأقطاب الكهربائية بعد 23 دقيقة ومسح لهم بسخاء بالماء المقطر. التطبيق الناجح للطبقة كلوريد الفضة يظهر كتغير الأرجواني متجانسة في اللون.
- تجف في الهواء. بعد المجففة تماما، واتخاذ الأقطاب الكهربائية مع ملاقط غرامة. مع فرشاة الطلاء غرامة، وتطبيق العزل الكهربائي السائل. تبدأ على السلك مباشرة خلف طرف القطب وتغطية كل شيء يصل إلى أنبوب تقلص الحرارة. السماح للعزل الجاف لمدة 2 ساعة على الأقل.
- لمراقبة الجودة، إجراء فحص التوصيل الكهربائي مع المتعدد. إذا كان متوفرا، إجراء اختبار مقاومة في 1 كيلو هرتز باستخدام متر المعاوقة المناسبة، في حين أن القطب والاختباريتم وضع التحقيق معا في كلوريد الصوديوم 0.9٪ تحتوي على محلول H 2 O دون لمس بعضها البعض. وينبغي أن تكون قيم المعاوقة عند خز 1 حوالي 8 kΩ.
2. تركيب الأقطاب إلى حامل التجسيمي
ملاحظة: لتسجيل موا و لفبس في نفس الوقت، واستخدام أقطاب ميكروير التنغستن مع مقاومة 1.5 MΩ. إذا كان التركيز من التسجيلات على تسجيلات ذات جودة عالية من وحدات واحدة، واختيار أقطاب ميكروير مع مقاومة أعلى (> 5 MΩ). وإذا كان الهدف من الدراسة موجها فقط إلى الأطراف الفاعلة الحرجية، يمكن أن تكون الأقطاب الكهربائية ذات الممانعات المنخفضة مقبولة. بالنسبة للهياكل الصغيرة، التي غالبا ما تكون التعديلات الضجيجية دورسوفنترال ضرورية، استخدم أزواج من الأقطاب الكهربائية مع فصل طرفي ظهري بطني (في هذه الحالة 250 ميكرون). وعلاوة على ذلك، وهذا يوفر ميزة أكثر مرجعية المحلية القطب، إذا لزم الأمر. يتم قياس الإحداثيات التجسيمي دائما من القطب السفلي و aإعادة حساب في إشارة إلى بريجما.
- اتخاذ معيار حامل التجسيمي القطب مع كتلة الاكريليك والمشبك ووضعه بشكل آمن على سطح مستو في مجال الرؤية من المجهر الجراحي.
- ضع على نحو فضفاض الزوج الأول من الأقطاب الكهربائية إلى كتلة الاكريليك من حامل مع قطعة من الشريط اللاصق (3 مم × 8 مم) باستخدام ملاقط غرامة. الأقطاب يجب أن تبرز كتلة الاكريليك تقريبا. 12 مم.
- إصلاح بعناية القطب القطبين الثاني بجوار القطب الأول. لاستهداف هياكل المسار هيبيرديركت، يجب أن تكون المسافة 2 مم ( الشكل 1 ). بالنسبة لمعظم حاملي القطب التجسيمي القياسية، وهذا هو العطلة المجاورة. استخدام مقياس الفرجار للتحقق. ويمكن الاتصال بشبكات مختلفة بنفس الطريقة. لهذا، يمكن أن تحول كتلة الاكريليك إلى درجة معينة.
- ضبط الزوج الثاني من الأقطاب الكهربائية عن طريق تحريك بعناية إلى الموقف، الذي معظم طرف بطني حوالي 200ميكرون راحة بالمقارنة مع القطب الأول ( الشكل 1 ). القيام بذلك تحت الرؤية المجهرية. لهذا، استخدم قنية 30 G (القطر الخارجي 300 ميكرون) إلى تقدير أفضل للمسافة.
- اضغط على الشريط اللاصق، ومن ثم تأمين مع المشبك المعدني حامل.
3. الجراحة
- للتسجيلات الكهربية، واستخدام يوريتان (تنبيه) للتخدير.
تنبيه: يوريتان سامة ومسرطنة، لذلك دائما التمسك لوائح السلامة وصحيفة البيانات المقدمة من قبل الشركة المصنعة للمادة. - إعداد محلول من 200 ملغ / مل يوريتان في 0.9٪ كلوريد الصوديوم محلول ملحي طبي.
- إدارة ما مجموعه 1.3 غرام / كجم من وزن الجسم يوريتان داخل الصفاق (إب). اعتمادا على سلالة الفئران قد يكون من المعقول تقسيم الجرعة إلى جرعتين مع فاصل 15 دقيقة بين الحقن من أجل تعزيز سلامة التخدير.
- تحقق من عمق التخدير باستخدام pإدال الانسحاب المنعكس وردود الفعل الأخرى المناسبة. إذا كان التخدير ليست عميقة بما فيه الكفاية لإجراء عملية جراحية، وضخ 0.15 غرام / كجم من وزن الجسم من يوريتان الملكية الفكرية وانتظر آخر 15 دقيقة.
- تطبيق مرهم العين لمنع الجفاف القرنية.
- رصد باستمرار معدل التنفس ودواسة الانسحاب منعكس أثناء التخدير. استخدام وسادة صغيرة التدفئة الحيوانية مع التحكم في درجة الحرارة لضمان الحفاظ على درجة حرارة الجسم الفسيولوجية طوال الجراحة. قبل بدء التسجيلات الكهربية، والتغيير إلى بديل غير الكهربائية (على سبيل المثال الصوديوم خلات لوحة الرأس).
- يحلق الفراء جنبا إلى جنب مع الجانب الظهري من الرأس لتحقيق حقل جراحي نظيف. تطهير حول موقع شق مع مطهر الجراحية المناسبة. إصلاح الحيوان في الإطار المجسم.
- إجراء شق 2 سم طويلة من فروة الرأس في الاتجاه السهمي مع مشرط. استخدام مشرط ل كشط قليلا قبالة سفاق الجمجمة وتطهير الجمجمة. استخدام كوتون براعم غارقة في 3٪ H 2 O 2 لإزالة أي الأنسجة المتبقية.
- استخدام كهربي أو المكثف للسيطرة على النزيف، إذا لزم الأمر. وقف النزيف من عظام الجمجمة والأديم السفلي، إذا كان النزيف لا تتوقف تلقائيا بعد 1-2 دقيقة ويعوق البصر على الجمجمة.
- ضبط شريط إنسيسور حتى يتم وضع الرأس في موقف الجمجمة شقة، وهو ما يعني بريجما وامدا كنقاط مرجعية التجسيمي هي في نفس الطائرة. هذا هو الأكثر أهمية لتحقيق عالية الدقة الجراحية. استخدام أداة التجميع الفئران التجسيمي القياسية، معايرة طرف معين إلى بريجما تحت الرؤية المجهرية وضبط شريط إنسيسور حتى النقاط المعينة ل بريجما وامدا على أداة تلمس الجمجمة في نفس الوقت.
ملاحظة: قد يساعد عرض من جانب واحد مع تركيز الضوء من جهة أخرى على تحديد هذه الحالة. بدلا من ذلك، واتخاذ حامل التجسيمي مع قنية غرامة وقياس إحداثيات دورسوفنترال من بريجماند لامدا تحت الرؤية المجهرية. ضبط شريط إنسيسور حتى إحداثيات دورسوفنترال من بريجما وامدا هي نفسها. - استخدام حامل التجسيمي مع قنية، معايرة إلى بريجما ومن ثم حساب موقف جميع ثقوب الحفر على الجمجمة. باستخدام حامل التجسيمي، بمناسبة مواقف الثقوب المراد حفرها إما عن طريق خدش بعناية الجمجمة أو باستخدام علامة لون الجراحية. الإحداثيات لهذا يعتمد على الأهداف، ينسق مع الإشارة إلى بريجما وتعطى للمسار هيبيرديركت في الجدول 1 ، بما في ذلك الإحداثيات المقترحة للأقطاب مرجعية المخيخ.
- باستخدام ميكرودريل حفر بعناية جميع الثقوب. ل ستن و شنر، حفر ثقب مشترك (حوالي 2 ملليمتر x 3 ملليمتر في حجم). يجب أن يبلغ قطر جميع ثقوب الحفر الأخرى حوالي 1 مم.
- أخذ اثنين من قنية غرامة (على الأقل 27 ز) وثني نصائحهم لتشكيل شكل مدمن مخدرات، وذلك باستخدام سطح صلب أو ملاقط. استخدام هذه لإزالة أي دبريثانية من ثقوب الحفر، وقطع بعناية وإزالة الأم الجافية في ثقب ستن / شنر المشترك.
- مسح ثقوب الحفر مع المالحة الفسيولوجية. تطبيق قطرة من المياه المالحة الفسيولوجية كل 15 دقيقة إلى ثقوب الحفر لمنع الدماغ والجافية من الجفاف التدريجي.
- اتخاذ ميكرودريل ومطابقة الفولاذ المقاوم للصدأ المسمار الصغير (على سبيل المثال مم 1.2 مم × 2 مم المسمار)، حفر ثقب والمسمار في المسمار الصغير بين الثقوب الحفر من الأقطاب إيبيدورال المرجعية فوق المخيخ، ونفعل الشيء نفسه ل M1 إيبيدورال أقطاب.
- حرك الأقطاب إيغورال أغ / أجكل التي يتم بناؤها ذاتيا في ثقوب الحفر للأقطاب المرجعية والأقطاب M1. توجيه طرف القطب مع ملاقط غرامة والانزلاق مباشرة تحت عظمة الجمجمة في حفرة الحفر.
- إصلاح جميع الأقطاب إيبيدورال مع اثنين-- مكون الأسنان الاكريليك. تأكد من عدم تغطية نقطة بريجما ولا تؤثر على ثقب ستن / شنر المشترك.
- إدراج حامل استعداد مع التنغستن ميكروير إليكترودإس في الإطار التجسيمي.
- معايرة القطب البطني الأكثر، والذي يهدف إلى استهداف ستن، إلى بريجما. ضبط إلى موقف محسوبة فوق ثقب ستن / شنر المشترك وانخفاض الأقطاب أسفل إلى الدماغ تحت الرؤية المجهرية. تأكد من أن أقطاب ميكروير التنغستن تذهب داخل الدماغ بسلاسة.
4. رسم الخرائط الكهربية والتسجيلات
ملاحظة: لهذه الخطوة، قفص فاراداي ونظام تسجيل الكهربية متعدد القنوات مع برنامج تسجيل قادر على التصفية عبر الإنترنت والفرز على الانترنت ارتفاع الفرز ضروري. ويفضل استخدام نظام يعمل مع مضخم مسبقا وضع بالقرب من رأس الحيوانات للحفاظ على الضوضاء الكهربائية والتحف إلى الحد الأدنى المطلق. إلى جانب الأقطاب الكهربائية التنغستن ميكروير، على الأقل إيبيدورال واحد القطب مرجعية ضرورية لأداء تسجيلات مسار هيبيرديركت. فمن المستحسن لإدراج فوق الجافية والإشارةe الأقطاب الزوجية دون لهم لمس بعضها البعض، وهذا يساعد في حالة خلل ويسمح لأنواع مختلفة من المرجعية في تحليل البيانات.
- وضع قفص فاراداي المحمول فوق الإطار التجسيمي. إذا كان فقط قفص فاراداي ثابتة هو متاح، والانتقال بعناية الإطار التجسيمي في قفص فاراداي في حين التأكد من أقطاب الدماغ عميقة لا يتم تخفيضها في الدماغ حتى الإطار التجسيمي هو في موقفها النهائي.
- ربط الأقطاب إلى هادستاج من الإعداد الكهربية. تأكد من توصيل أقطاب المرجعية إلى القنوات المرجعية المناسبة.
- إعداد برنامج التسجيل: مرشح الموجة الخلفية (0،05-8،000 هرتز) وتضخيم (كسب 1،500-2،000x) إشارة البيانات الخام. استخدام لفب على الانترنت وارتفاع مرشح مع الإعدادات المناسبة (مرشح الموجة العريضة 0.05-250 هرتز ل لفبس، مرشح الموجة 300-8،000 هرتز ل موا). بالنسبة إلى جميع الفلاتر، استخدم فلتر من نوع بوترورث.
- إعداد عتبة ارتفاع، إن وجدت، ل أونلينe ارتفاع الفرز. وتسمح معظم برامج التسجيل بإعداد عتبة ارتفاعية، وهي قيمة اتساع فوق الإشارة التي توصف بأنها ارتفاع من قبل البرنامج. ويمكن تحديد هذه العتبة حسابيا كعامل أو انحراف معياري لمتوسط الاتساع لإشارة السنبلة المصفاة أو يمكن تحديدها على نحو مفضل عن طريق الفحص البصري لقطاعات البيانات <500 مس وإعدادها كسطر فوق ضوضاء الإشارة في رسم بياني واجهة المستخدم.
ملاحظة: النية في إنشاء عتبة ارتفاع هو لحساب المسامير ووحدات الفرز من أجل توفير معلومات عن عدد الخلايا العصبية المسجلة حاليا وكيفية تشكيلها المسامير. - خفض ببطء أقطاب ميكروير التنغستن إلى 1 ملم الظهرية من الهدف، وهو ستن للمسار هيبيرديركت. انتظر حتى تستقر الإشارة إذا لزم الأمر.
- لرسم الخرائط الكهربية، وتقدم أقطاب بطني في خطوات من 100 ميكرون. في كل خطوة، وتقييم نمط اطلاق النار، وإطلاق صأكل وشكل من المسامير. مقارنة تلك مع الأمثلة النموذجية الواردة في الشكل 2 . عادة، تظهر نوى كثيفة تساقط سريع ومستمر على عدة خطوات دورسوفنترال، في حين أن الهياكل الغنية بالألياف تظهر معدلات اطلاق منخفضة وأقل نشاط متجانسة ارتفاع في الخطوات البطنية اللاحقة.
- للمسار هيبيرديركت، تأكد من أن القطب الأكثر بطني هو داخل ستن.
ملاحظة: يتم التوصل إلى ستن عندما يتم الكشف عن زيادة كبيرة في موا بطني من إنسونا. فينترال إلى ستن، يتوقف ارتفاع تقريبا تقريبا لأن القطب قد وصلت إلى كبسولة الداخلية. عندما القطب البطني الأكثر في ستن، وتكوين ميكرولتروديس التنغستن يضمن الخلفي، القطب الثاني هو في شنر. قد يكون من الضروري ضبط ظهري ظهري في زيادات صغيرة لتسجيل موا نموذجية في ستن و شنر في نفس الوقت. لاحظ أن تردد موا يعتمد على عدد من الخلايا العصبية المسجلة فعلا وعلى الدماغ المستوىالتنشيط. - وبمجرد أن الأقطاب في الهياكل المطلوبة، وإعداد تصفية على الانترنت وارتفاع الفرز (انظر الشكل 4 )، ومن ثم بدء تسجيل البيانات. أمثلة نموذجية لمختلف حالات تزامن القشرية التي يمكن تحديدها في تسجيلات لفب مبينة في الشكل 3 .
5. نهاية التجربة
- عندما يتم التسجيلات، ببطء رفع الأقطاب الكهربائية من الدماغ وعلى الفور تدفق لهم مع المالحة الفسيولوجية. الأقطاب يمكن إعادة استخدامها بعد التنظيف الدقيق والتفتيش البصري. تفريغ أقطاب الانحناء.
- الموت ببطء الحيوانات عن طريق حقن إب جرعة زائدة من يوريتان (2.5 غرام / كجم من وزن الجسم).
ملاحظة: يوريتان ينبغي أن تستخدم فقط للإجراءات النهائية. - إذا كان المطلوب التحقق النسيجي من موقف القطب أو إجراءات تلطيخ النسيجية الأخرى، وإزالة الدماغ من الجمجمة ومعالجةالأنسجة بشكل مناسب.
ملاحظة: اعتمادا على طرق تلطيخ المقصود، قد يكون نضح ترانسكارديال ضروري. للتحقق بعد الوفاة من موقف القطب، وتلطيخ نيسل القياسية كافية في معظم الحالات لتصور مسار القطب في أقسام الدماغ على سبيل المثال الاكليلية. مزيد من النهج لتسهيل التحقق من الهدف النسيجي وتشمل استخدام الآفات التي يسببها كهربائيا إلى أنسجة المخ عن طريق تطبيق التيار الكهربائي عن طريق أقطاب تسجيل أو تطبيق صبغ حيوي قبل الإدراج الكهربائي 16 ، 17 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مع هنا تستخدم أقطاب تسجيل، فمن الممكن أن عينة من اللاعبين ذوي الاحتياجات الخاصة من القشرة الحركية الأولية، النواة تحت المهاد والأرضية نيجرا بارس ريتيكولاتا و موا من ستن و شنر. في البداية، يتم تسجيل الأنشطة متعددة اللاعبين والنشاط متعدد الوحدات معا في إشارة النطاق العريض. وبعد ذلك، تفصل مركبات القوى العاملة والمحطات البحرية المحلية بمرشحات ممرات الموجات (0،05-250 هرتز للمركبات ذات الترددات المنخفضة و 300-4 هز ل موا).
لاستهداف الصحيح من نوى تحت القشرية، وخاصة من الهياكل الصغيرة مثل ستن، فمن المفيد لمحاذاة الإحداثيات التجسيمي المخطط لها مع إشارة موا المسجلة على الانترنت. لمسار القطب استهداف ستن مميزة نمط موا يمكن تسجيلها ( الشكل 2 ) 9 ، 20 .
لخطوات لاحقة من التحليل، هو عليهوغالبا ما تكون إلزامية لتحديد وحدات واحدة من النشاط متعدد الوحدات من خلال تحليل المكون الرئيسي ( الشكل 4 ).
في تسجيلات لفب من M1 اثنين بالتناوب تلقائيا تزامن القشرية الحالات يمكن تحديدها: الدولة المنشطة (أس) والنشاط موجة بطيئة (سوا) الدولة ( الشكل 3 ) 18 ، 19 . في حين أن حالة سوا تهيمن عليها التذبذبات البطيئة عالية السعة حوالي 1 هرتز، وتتميز أس بتذبذبات أسرع مع اتساع أقل ( الشكل 3 ).
الشكل 1: إعداد الأقطاب ميكروير عميق الدماغ في حامل التجسيمي القياسية. لاحظ فصل طرف بين A، زوج القطب لستن، و B، زوج القطب ل شنر في اتجاه دورسوفنترال تقريبا. 200 ميكرون والاتجاه أنتريوبوستيريور تقريبا. 2 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مميزة متعددة وحدة النشاط من مسار القطبية ظهاري المستقيم استهداف ستن. ( A ) تسجيلات متعددة الوحدات من النواة المهادية البطانية البطنانية (فم)، و إنزرتا المنطقة (زي)، نواة تحت المهاد (ستن) و المادة النيجرية بارس ريتيكولاريس (شنر). و فم يعرض متفرق وغير منتظمة متباعدة ارتفاع المسامير السعة. هذا النمط من المسامير يتوقف عند الاقتراب من زي. عندما يدخل القطب ستن نموذج اطلاق النار عالية التردد نموذجي مع رشقات نارية قصيرة مع أمبليت المتوسطةأود يمكن ملاحظتها. ويمكن التعرف على شنر من خلال السعة العالية ونمط اطلاق العادية. ( B) ستن مسارات فرضه على الصور من الأطلس المجسم الفئران 21 . الجزء العلوي: طائرة الاكليلية. الجزء السفلي: طائرة سهمي. لاحظ تمرير طرف القطب من خلال فم و زي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. الدول التزامن القشرية في لفب تسجيلات من اللحاء المحرك الرئيسي خلال يوريتان التخدير. ( A ) ممثل 600 S لفب تسجيل القشرة الحركية الأولية. الفترات الزمنية ذات التردد العالي، ونشاط السعة المنخفض المقابل للدولة المنشطة (ط) والفترات الزمنية ذات الإيقاع البطيء والارتفاع إر المقابلة لحالة النشاط الموجة البطيئة (إي) يمكن أن تكون متباينة. ( B ) مؤامرة التردد الزمني المقابلة على مدى فاصل من 600 ثانية توضح القوة النسبية 0-20 هرتز من القوى العاملة المحلية المعروضة في (A). تشير الألوان الأكثر دفئا إلى قوة نسبية أعلى. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: فرز وحدات واحدة من ستن متعددة وحدة النشاط. ( A ) عرض ثلاثي الأبعاد لمجموعات الوحدات في الفضاء ميزة بعد تحليل المكون الرئيسي. تمثل كل مجموعة وحدة واحدة مفترضة. ( B ) الطول الموجي سبايك ومتوسط الطول الموجي الموافق للمجموعات في (A).0fig4large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الإحداثيات من بريجما | STN | SNR | M1 | المرجع 1 | المرجع 2 |
| الخلفية الأمامية | -3.6 | -4.8 | +3.0 | -10،0 | -10،0 |
| سطي-الوحشي | +2.5 | +2.5 | +3.0 | +3.0 | -3.0 |
| ظهري، بطني | -8.0 | غ | غ | غ | غ |
الجدول 1: التجسيمي الإحداثيات لتسجيل شركة هايبيرديركترتيكو-باسال، العقد، درب. يتم قياس جميع النقاط من نقطة مرجعية بريجما على الجمجمة في ملم. لا ينطبق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة، وتظهر طريقة كيفية تسجيل الإشارات الكهربية خارج الخلية في وقت واحد من مواقع متعددة من شبكة معينة باستخدام مثال هيبيرديركت القشرية القاعدية مسار العقد الذي يربط M1 مع ستن و شنر في القوارض.
وهناك خطوة حاسمة في تسجيل الهياكل تحت القشرية الصغيرة مثل ستن هو الإدراج الموجهة بدقة من أقطاب تسجيل في الهدف. في الطريقة المعروضة، مع الحرص على خطوتين حاسمة يضمن دقة عالية من الاستهداف. عند إعداد الحيوان في الجهاز المجسم قبل إدخال الأقطاب في الدماغ، فمن الضروري للغاية للتأكد من أن الجمجمة يتم جلبها إلى "الجمجمة شقة" موقف 22 . لتحقيق موقف الجمجمة شقة، يتم تغيير موقف شريط القاطعة من الإطار المجسم حتى مرتفعات بريجما والنقاط المرجعية لامدا سن الجمجمة هي في نفس الطائرة دورسوفنترال 21 . فقط من خلال ضمان هذا الموقف، والإحداثيات وجدت في الأطالس المجسم يمكن تطبيقها مع مستوى عال من الدقة للحيوانات المختبر الفردية، منذ تستند الأطالس على موقف الجمجمة شقة 21 . أيضا، أدلة تجريبية تثبت أن دقة الاستهداف باستخدام موقف الجمجمة شقة الفردية متفوقة على تعديل ثابت من شريط القاطعة 23 . موقف أقطاب التسجيل في الطائرة دورسوفنترال ينبغي أن يكون صقلها عن طريق تسجيل باستمرار نشاط متعدد الوحدات. نوى مختلفة وهياكل المادة البيضاء على طول مسار القطب تظهر أنماط النار مميزة ( الشكل 2 )، والتي يمكن استخدامها لتعديل موقف القطب 9 ، 20 .
وثمة خطوة هامة أخرى في الطريقة المعروضة هي وضع rالإلكترود. في البروتوكول المقدم، تم اختيار موقف فوق القشرة المخيخية، لأنه في هذه المرحلة القطب المرجعي لا يكشف عن العقد العقد القاعدية القاعدية التي كانت النقطة المركزية للدراسة. في الدراسات التي لديها اهتمام في أساليب التحليل التي هي عرضة لحجم التوصيل ينبغي تفضيل أكثر المحلية إشارة 5 .
يوريتان هو مخدر على نطاق واسع لتسجيل إمكانيات الخلايا العصبية خارج الخلية في البحوث الحيوانية 11 ، 18 ، 24 ، 25 ، 2 6 . والسبب في ذلك هو أن جرعة واحدة من يوريتان يمكن أن تنتج تخدير مستقر وطويل الأمد لمدة 8-12 ساعة مع الاكتئاب فقط من نشاط الجهاز العصبي المركزي مقارنة مع التخدير الأخرى 27 . ومع ذلك، يوريثان التخديركما ينشط الجهاز العصبي الودي، والتي يمكن أن تؤدي إلى آثار جانبية غير مرغوب فيها مثل ارتفاع السكر في الدم على سبيل المثال 27 . بسبب عملها طويلة الأمد وعدم وجود دواء قوي لعداء تأثير مخدر، لا ينبغي أن تستخدم يوريتان للتجارب المتكررة التي يتم فصلها ساعات أو أيام. إذا كان من المقرر أن تفعل جلسات تسجيل متعددة على نفس الحيوان أو إذا كان هناك سبب فني لعدم استخدام يوريتان، ثم التخدير الغاز مع الأيزوفلورين وحقن المخدرات مثل الكيتامين وزيلازين يمكن أن تكون بدائل معقولة للكهربية في التجارب المجراة 28 ، 29 . وعيب هذه النظم المخدرة هو أنها تتطلب المزيد من الرصد والتكيف أكثر من استخدام يوريتان، بسبب نصف عمرها القصير وتراكم المخدرات مع مرور الوقت. وعلاوة على ذلك، هناك أدلة على أن يوريتان قد تتداخل أقل مع الفسيولوجية ب نشاط المطر من التخدير الأخرى 30 .
جميع شروط التسجيل التفصيلية هنا تحدد بشكل حاسم كيف يمكن الحصول على مزيد من المعالجة البيانات التي تم الحصول عليها وتحليلها حاليا، ولذلك فمن إلزامي لضبط كافة الإعدادات لمتطلبات متطلبات التحليل المخطط لها. وبما أن هناك العديد من الخيارات لتحليل التسجيلات خارج الخلية متعددة القنوات، واستخدام الأدوات المتاحة مفتوحة المصدر يمكن أن تكون مفيدة 31 .
تسجيل إمكانات خارج الخلية في الجسم الحي هو الأسلوب الذي يقدم قرار الزماني والمكاني فريدة من إشارات الدماغ التي هي متفوقة على أساليب بديلة مثل التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي والتصوير الكالسيوم 5 . لا يمكن تطبيق الطريقة المعروضة فقط على تسجيل مسار هيبيرديركت، ولكن يمكن تعديلها بسهولة لمجموعة متنوعة من النماذج التجريبية الأخرى والأسئلة البحثيةf "> 24 ، 32 ، 33. ومع ذلك، لأنه ينطوي على جراحة المجسم، وهناك العديد من إعدادات البحث حيث لا يمكن تطبيقها وحيث ينبغي اختيار طريقة غير الغازية.
في المستقبل، ينبغي أن تتحقق مجموعة من عرض خارج الخلية تقنية تسجيل موقع متعدد مع أدوات أوبتوجينيتيك لتعزيز فهمنا للخلل الشبكة الكامنة وراء الأمراض العصبية والنفسية المختلفة من أجل العثور على علاجات جديدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر دويتشه فورسشونغزجيمينشافت (دفغ)، كفو 247، لتمويل دراستنا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ag/AgCl custom epidural electrodes | Goodfellow GmbH D-61213 Bad Nauheim, Germany info@goodfellow.com |
Product-ID AG005127 for 99.99% silver wire | Ag/AgCl electrodes will allow for better signal quality, but may only be used in acute experiments. Possible replacement: Stainless steel electrodes |
| Stereotaxic holder with acrylic block | David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA |
Product ID Model 1770 Standard Electrode Holder | Make sure the acrylic block has recesses which suit the electrode setup for the desired target. Acrylic blocks can easily be modified with a file to obtain the desired configuration. Possible replacement: Self-constructed electrode holders |
| Tungsten microwire electrodes 1.5 MΩ impedance | Microprobes.com 18247-D Flower Hill Way Gaithersburg, Maryland, 20879 USA |
Product-ID WE3ST31.5A5-250um | The 1.5 MΩ is necessary to record MUA and LFP at the same time. Possible replacement: Microelectrodes of different materials can be used. The electrodes have to be straight, robust and as thin as possible. |
| Rat alignment tool | David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA |
Product ID Model 944 Rat Alignment Tool | Allows the exact orientation of the brain to match stereotaxic atlases. Possible replacement: Stereotaxic holder with a cannula |
| Two-component dental acrylic | Associated Dental Products Ltd. Kemdent Works, Purton, Swindon Wiltshire, SN5 4HT, United Kingdom |
Simplex Rapid Powder Clear 225g, Product code: ACR803; Simplex Rapid Liquid 150ml, Product code: ACR920 | Depending in the electrodes used, superglue might be an easy alternative, if the electrodes are small and lightweight. Possible replacement: Superglue (Cyanacrylate-based) |
| Faraday cage | Self-construction | A proper Faraday cage will be the best protection from electromagnetic artifacts, but everything which can be formed into a box shape or applied to a frame and is made of conductive material may help. Possible replacement: Aluminum foil or copper mesh | |
| Electrophysiological setup with recording software and online spike-sorting capabilities | OmniPlex® Neural Data Acquisition System Plexon Inc 6500 Greenville Avenue, Suite 700 Dallas, Texas 75206 USA |
Offline sorting software is a potential alternative, multiple scripts and softwares can be found for free in the open source community. |
References
- Lozano, A. M., Lipsman, N. Probing and regulating dysfunctional circuits using deep brain stimulation. Neuron. 77 (3), 406-424 (2013).
- Mathalon, D. H., Sohal, V. S. Neural Oscillations and Synchrony in Brain Dysfunction and Neuropsychiatric Disorders: It's About Time. JAMA Psychiatry. 72 (8), 840-844 (2015).
- Uhlhaas, P. J., Singer, W. Neuronal dynamics and neuropsychiatric disorders: toward a translational paradigm for dysfunctional large-scale networks. Neuron. 75 (6), 963-980 (2012).
- Buzsaki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).
- Buzsaki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
- Brazhnik, E., Novikov, N., McCoy, A. J., Cruz, A. V., Walters, J. R. Functional correlates of exaggerated oscillatory activity in basal ganglia output in hemiparkinsonian rats. Exp Neurol. 261, 563-577 (2014).
- Avila, I., et al. Beta frequency synchronization in basal ganglia output during rest and walk in a hemiparkinsonian rat. Exp Neurol. 221 (2), 307-319 (2010).
- Javor-Duray, B. N., et al. Early-onset cortico-cortical synchronization in the hemiparkinsonian rat model. J Neurophysiol. 113 (3), 925-936 (2015).
- Beck, M. H., et al. Short- and long-term dopamine depletion causes enhanced beta oscillations in the cortico-basal ganglia loop of parkinsonian rats. Exp Neurol. 286, 124-136 (2016).
- Magill, P. J., Bolam, J. P., Bevan, M. D. Relationship of activity in the subthalamic nucleus-globus pallidus network to cortical electroencephalogram. J Neurosci. 20 (2), 820-833 (2000).
- Magill, P. J., et al. Changes in functional connectivity within the rat striatopallidal axis during global brain activation in vivo. J Neurosci. 26 (23), 6318-6329 (2006).
- Brown, P. Abnormal oscillatory synchronisation in the motor system leads to impaired movement. Curr Opin Neurobiol. 17 (6), 656-664 (2007).
- Stein, E., Bar-Gad, I. beta oscillations in the cortico-basal ganglia loop during parkinsonism. Exp Neurol. 245, 52-59 (2013).
- Little, S., Brown, P. What brain signals are suitable for feedback control of deep brain stimulation in Parkinson's disease? Ann N Y Acad Sci. 1265, 9-24 (2012).
- Priori, A., Foffani, G., Rossi, L., Marceglia, S. Adaptive deep brain stimulation (aDBS) controlled by local field potential oscillations. Exp Neurol. , 77-86 (2013).
- Brozoski, T. J., Caspary, D. M., Bauer, C. A. Marking multi-channel silicon-substrate electrode recording sites using radiofrequency lesions. J Neurosci Methods. 150 (2), 185-191 (2006).
- Schjetnan, A. G., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. (56), (2011).
- Mallet, N., et al. Disrupted dopamine transmission and the emergence of exaggerated beta oscillations in subthalamic nucleus and cerebral cortex. J Neurosci. 28 (18), 4795-4806 (2008).
- Steriade, M. Corticothalamic resonance, states of vigilance and mentation. Neuroscience. 101 (2), 243-276 (2000).
- Maesawa, S., et al. Long-term stimulation of the subthalamic nucleus in hemiparkinsonian rats: neuroprotection of dopaminergic neurons. J Neurosurg. 100 (4), 679-687 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1998).
- Oliveira, L. M. O., Dimitrov, D. Methods for Neural Ensemble Recordings Frontiers in Neuroscience. Nicolelis, M. A. L. , (2008).
- Torres, E. M., et al. Increased efficacy of the 6-hydroxydopamine lesion of the median forebrain bundle in small rats, by modification of the stereotaxic coordinates. J Neurosci Methods. 200 (1), 29-35 (2011).
- Hadar, R., et al. Rats overexpressing the dopamine transporter display behavioral and neurobiological abnormalities with relevance to repetitive disorders. Sci Rep. 6, 39145 (2016).
- Parr-Brownlie, L. C., Poloskey, S. L., Bergstrom, D. A., Walters, J. R. Parafascicular thalamic nucleus activity in a rat model of Parkinson's disease. Exp Neurol. 217 (2), 269-281 (2009).
- Steriade, M., Nunez, A., Amzica, F. A novel slow (< 1 Hz) oscillation of neocortical neurons in vivo: depolarizing and hyperpolarizing components. J Neurosci. 13 (8), 3252-3265 (1993).
- Maggi, C. A., Meli, A. Suitability of urethane anesthesia for physiopharmacological investigations in various systems. Part 1: General considerations. Experientia. 42 (2), 109-114 (1986).
- Goldberg, J. A., Kats, S. S., Jaeger, D. Globus pallidus discharge is coincident with striatal activity during global slow wave activity in the rat. J Neurosci. 23 (31), 10058-10063 (2003).
- Karain, B., Xu, D., Bellone, J. A., Hartman, R. E., Shi, W. X. Rat globus pallidus neurons: functional classification and effects of dopamine depletion. Synapse. 69 (1), 41-51 (2015).
- Paasonen, J., et al. Comparison of seven different anesthesia protocols for nicotine pharmacologic magnetic resonance imaging in rat. Eur Neuropsychopharmacol. 26 (3), 518-531 (2016).
- Mahmud, M., Vassanelli, S. Processing and Analysis of Multichannel Extracellular Neuronal Signals: State-of-the-Art and Challenges. Front Neurosci. 10, 248 (2016).
- Hadar, R., et al. Altered neural oscillations and elevated dopamine levels in the reward pathway during alcohol relapse. Behav Brain Res. 316, 131-135 (2017).
- Voget, M., et al. Altered local field potential activity and serotonergic neurotransmission are further characteristics of the Flinders sensitive line rat model of depression. Behav Brain Res. 291, 299-305 (2015).
