Summary
In questo studio viene presentata la metodologia su come eseguire registrazioni elettrofisiologiche in vivo multi-site dal percorso iperdirezionale in anestesia uretanica.
Abstract
La convergenza dimostra che molte malattie neuropsichiatrici dovrebbero essere intese come disturbi delle reti neuronali su larga scala. Per capire meglio la base fisiopatologica di queste malattie, è necessario specificare con precisione il modo in cui l'elaborazione delle informazioni è disturbata tra le diverse parti neuronali del circuito. Usando registrazioni elettrofisiologiche extracellulari in vivo , è possibile accuratamente delineare l'attività neuronale all'interno di una rete neuronale. L'applicazione di questo metodo presenta diversi vantaggi rispetto alle tecniche alternative, ad esempio la risonanza magnetica funzionale e l'imaging del calcio, in quanto consente una risoluzione temporale e spaziale unica e non si basa su organismi geneticamente modificati. Tuttavia, l'uso di registrazioni in vivo extracellulari è limitato in quanto è una tecnica invasiva che non può essere applicata universalmente. In questo articolo viene presentato un metodo semplice e facile da usareCon cui è possibile registrare contemporaneamente potenziali extracellulari come potenziali di campo locale e attività multiunitica in siti multipli di una rete. E 'dettagliato come un preciso targeting dei nuclei subcorticali può essere ottenuto utilizzando una combinazione di chirurgia stereotassica e analisi online delle registrazioni multi-unità. Pertanto, è dimostrato come una rete completa come il loop gangliale cortico-basale iperdirezionale possa essere studiata in animali anestetizzati in vivo .
Introduction
Recenti evidenze cumulative su diversi disturbi neuropsichiatrici come la malattia di Parkinson (PD) e la schizofrenia suggeriscono fortemente che la loro fisiopatologia si basa su una disfunzione critica dei circuiti neuronali estesi che spesso coinvolgono strutture corticali e subcorticali 1 , 2 , 3 . Secondo questa teoria, le manifestazioni cliniche delle malattie si presentano come conseguenza di una capacità di elaborazione dell'informazione compromessa di una rete di cellule anziché di singole cellule o di elementi neuronali specifici 1 , 2 , 3 . Per migliorare la comprensione di questo complesso gruppo di malattie neuropsichiatrici e trovare nuove opzioni di trattamento, è obbligatorio caratterizzare le dinamiche neuronali di quelle reti disorganizzate nei pazienti umani e nei modelli animali in grande dettaglio. Un eccellenteMetodo per studiare reti su larga scala nei soggetti viventi è registrazioni elettrofisiologiche multi-siti di potenziali extracellulari 4 . Utilizzando questo metodo, è possibile valutare contemporaneamente i potenziali locali di campo (LFPs), che rappresentano principalmente la somma temporale delle correnti postsinaptiche eccitatorie e inibitorie e dell'attività multi-unità (MUA) generata dai potenziali presinaptici 5 . La registrazione di potenziali extracellulari ha diversi vantaggi rispetto ai metodi alternativi per studiare le reti, ad esempio la risonanza magnetica funzionale e l'imaging del calcio, perché fornisce una risoluzione temporale e spaziale più elevata e perché non dipende da organismi geneticamente modificati 5 . Tuttavia, l'uso di registrazioni in vivo extracellulari è limitato in quanto è una tecnica invasiva che non può essere applicata universalmente.
Ricognizione elettrofisiologica in vivoGli ordings possono essere eseguiti svegli come pure in animali anestetizzati 6 . Entrambi i metodi sono accompagnati da pro e contro specifici. Gli studi sugli animali svegli consentono la registrazione dei segnali del cervello durante l'esecuzione di compiti comportamentali definiti, ma sono soggetti a movimenti e altri artefatti 7 , 8 . Le registrazioni negli animali anestetizzati, invece, offrono l'opportunità di valutare LFP e MUA con un minimo di artefatti in stati di sincronizzazione corticali altamente definiti, ma i risultati sono anche diversi in qualche misura da ciò che si può trovare nei soggetti svegli 9 , 10 , 11 .
Negli ultimi anni è stato dimostrato che il campionamento di LFP è particolarmente utile per delineare i cambiamenti patologici dell'attività di rete. Un esempio importante di questo è la ricerca sulla fisiopatologia del PD nel paziente umanoI modelli animali della malattia, dove si potrebbe dimostrare che le oscillazioni beta aumentate nel loop del gangliale cortico-basale sono legate ai sintomi motori parkinsoniani 12 , 13 . Come conseguenza di questa linea di ricerca, è attualmente studiato se le oscillazioni beta potrebbero essere utilizzate come biomarker di feedback online per la stimolazione profonda del cervello 14 , 15 .
Nel presente studio viene fornita una descrizione dettagliata delle registrazioni elettrofisiologiche acute di più siti in vivo di LFP e MUA nei ratti anestetizzati con uretano. È dimostrato come una rete completa, come il percorso del gangliale cortico-basale iperdirezionale, possa essere caratterizzata elettrofisiologicamente utilizzando elettrodi standard e personalizzati e come possono essere costruiti gli elettrodi. Viene in particolare sottolineato come un targeting preciso dei nuclei dei gangli basali possa essere raggiunto da coPiù veloce della chirurgia stereotassica insieme alla registrazione online di MUA.
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Protocol
Le procedure sperimentali sono state condotte in conformità alla legge tedesca per il benessere degli animali (ultima riveduta nel 2014) e alle normative europee (2010/63 / UE). Gli esperimenti sono stati approvati dall'autorità locale del benessere degli animali (LaGeSo, Berlino) e conformi alle linee guida locali e internazionali.
NOTA: Nel metodo presentato vengono utilizzati due modelli di elettrodi per registrare dal percorso gangliale cortico-basale iperdirezionale che collega la corteccia motoria primaria (M1) con il nucleo subthalamic (STN) e il substantia nigra pars reticulate (SNr). Per le registrazioni epidurale di electrocorticogram (ECoG) vengono utilizzati gli elettrodi Ag / AgCl a bassa impedenza M1 su misura. Le registrazioni da STN e SNr vengono eseguite con gli elettrodi di tungsteno ad alta impedenza commercialmente disponibili.
1. Costruzione di elettrodi Epidural Ag / AgCl Epidural
- Prendi una ca. Striscia lunga 5 cm di filo d'argento puro 99,99% con diameteR di 200 μm e rimuovere ogni rivestimento se necessario.
- Tenere la punta del filo con la punta verso il basso in una fiamma di un accendino o una candela finché la punta inizia a fondersi. Attendere che la punta sia a forma di sfera e abbia un diametro di circa 1 mm. Tagliare l'elettrodo preformato a una lunghezza totale di 15 mm dall'inizio della punta a forma di palla all'estremità del filo.
- Saldare un connettore di precisione all'estremità del filo, che si adatta al sistema di registrazione elettrofisiologico utilizzato. Coprire il punto di saldatura dall'estremità del filo al connettore con vernice d'argento conduttiva. Ciò aiuta la conduttività e si traduce in una migliore qualità del segnale.
- Dopo che la vernice conduttiva si è asciugata, coprire il punto di saldatura con un tubo termoretraibile da 3 mm a 1 mm. Utilizzare attentamente un martello dell'orologeria per appiattire la punta a forma di palla a metà dello spessore.
- Mettete i guanti di esame e prendete un panno di pulizia privo di pelo con etanolo al 100% per rimuovere la sporcizia e il grasso.
- Inserisci gli elettrodiUn tubo di centrifuga da 15 ml o un tubo di coltura cellulare e riempirlo con candeggina di cloro domestico (ATTENZIONE: contiene 2,8 g di ipocloruro di sodio per 100 g di solvente) finché la punta a forma di pallone è completamente rivestita.
ATTENZIONE: lo candeggio del cloro è corrosivo; Seguire sempre le istruzioni di sicurezza del produttore. - Prendete gli elettrodi fuori dopo 23 minuti e sciacquati generosamente con acqua distillata. L'applicazione efficace di uno strato di cloruro d'argento appare come un cambiamento violaceo omogeneo di colore.
- Asciugare nell'aria. Dopo essiccazione completa, prendete gli elettrodi con pennellini fine. Con un pennello bene applicare l'isolamento elettrico liquido. Avviare il filo direttamente dietro la punta dell'elettrodo e coprire tutto fino al tubo termoretraibile. Lasciare asciugare l'isolamento per almeno 2 ore.
- Per il controllo di qualità, eseguire un controllo della conducibilità elettrica con un multimetro. Se disponibile, eseguire test di impedenza a 1 kHz utilizzando un misuratore di impedenza appropriato, mentre l'elettrodo e il testSonda vengono messi insieme in una soluzione contenente H 2 O contenente NaCl da 0,9% senza toccarsi l'un l'altro. I valori di impedenza a 1 kHz dovrebbero essere di circa 8 kΩ.
2. Applicare gli elettrodi ad un supporto stereotossico
NOTA: Per registrare contemporaneamente MUA e LFP, utilizzare elettrodi a microfilo a tungsteno con un'impedenza di 1,5 MΩ. Se la messa a fuoco delle registrazioni è su registrazioni di alta qualità di singole unità, scegliere gli elettrodi a microfilo con un'impedenza maggiore (> 5 MΩ). Se lo scopo dello studio è rivolto esclusivamente a LFP, gli elettrodi con impedenze inferiori possono essere accettabili. Per piccole strutture, per le quali sono spesso necessarie regolazioni stereotassiali dorsoventrali, utilizzare coppie di elettrodi con un'adeguata separazione di punta dorsoventrale (in questo caso 250 μm). Inoltre, questo fornisce il vantaggio di un elettrodo di riferimento più locale, se necessario. Le coordinate stereotassiali sono sempre misurate dall'elettrodo più basso e da aCalcolata in riferimento al bregma.
- Prendete un supporto elettrodo-elettrico stereotossico con un blocco e un morsetto acrilico e posizionatelo saldamente su una superficie piana nel campo visivo di un microscopio chirurgico.
- Fissare leggermente la prima coppia di elettrodi al blocco acrilico del supporto con pezzi di nastro adesivo (3 mm x 8 mm) utilizzando pinzette fine. Gli elettrodi devono sporgere il blocco acrilico ca. 12 mm.
- Fissare attentamente il secondo elettrodo bipolare accanto al primo elettrodo. Per il targeting delle strutture del percorso iperdirezionale, la distanza dovrebbe essere di 2 mm ( Figura 1 ). Per la maggior parte degli elettrodi stereotossici standard, questo è il recesso adiacente. Utilizzare un manometro per verificare. Reti diverse possono essere affrontate allo stesso modo. Per questo il blocco acrilico può essere girato in un certo grado.
- Regolare la seconda coppia di elettrodi facendola scivolare attentamente in una posizione in cui la punta più ventrale è di circa 200Μm incassato rispetto al primo elettrodo ( Figura 1 ). Faccia questo sotto la visione microscopica. Per questo, utilizzare una cannula da 30 G (diametro esterno 300 μm) per stimare meglio la distanza.
- Premere sul nastro adesivo e quindi fissare con il morsetto metallico del supporto.
3. Chirurgia
- Per le registrazioni elettrofisiologiche, utilizzare uretano (ATTENZIONE) per l'anestesia.
Attenzione: l'uretano è tossico e cancerogeno, quindi attenersi sempre alle norme di sicurezza e alla scheda dati fornita dal produttore della sostanza. - Preparare una soluzione di 200 mg / ml uretano in soluzione salina medica di NaCl 0.9%.
- Amministrare un totale di 1,3 g / kg di uretano corporeo intraperitonealmente (IP). A seconda del ceppo del ratto potrebbe essere ragionevole dividere la dose in due dosi con un intervallo di 15 minuti tra le iniezioni per aumentare la sicurezza dell'anestesia.
- Controllare la profondità dell'anestesia utilizzando pRiflesso edale e altri riflessi adatti. Se l'anestesia non è abbastanza profonda per eseguire l'intervento chirurgico, iniettare 0,15 g / kg di uretano IP e attendere altri 15 minuti.
- Applicare un occhio per impedire la disidratazione cornea.
- Monitorare costantemente il tasso respiratorio e il riflesso del ritiro del pedale durante l'anestesia. Utilizzare un piccolo rilievo di riscaldamento animale con il controllo della temperatura per assicurare che una temperatura fisiologica del corpo sia mantenuta durante l'intervento chirurgico. Prima di iniziare le registrazioni elettrofisiologiche, passare ad un'alternativa non elettrica ( ad es . Pad di testa acetato di sodio).
- Rasare la pelliccia accanto al lato dorsale della testa per ottenere un campo chirurgico pulito. Disinfettare attorno al sito di incisione con appropriato disinfettante chirurgico. Fissare l'animale nel telaio stereotassico.
- Eseguire un'incisione del cuoio capelluto lungo 2 cm in direzione sagittale con un bisturi. Utilizzare un bisturi per raschiare leggermente il cranio aponeurosis e disinfettare il cranio. Utilizza coBastoncini di tono imbevuti di 3% di H 2 O 2 per rimuovere qualsiasi tessuto residuo.
- Usare un elettrocauter o un termocarto per controllare il sanguinamento, se necessario. Smettere le emorragie dall'osso del cranio e dall'ipoderma, se il sanguinamento non si ferma spontaneamente dopo 1-2 minuti e ostacola la vista sul cranio.
- Regolare la barra incisiva finché la testa non è posizionata in posizione del cranio piatto, il che significa che i bregma e lambda come punti di riferimento stereotassiali sono nello stesso piano. Questo è più importante per ottenere un'elevata precisione chirurgica. Utilizzare un attrezzo standard di allineamento stereotossico del ratto, calibrare la punta designata al bregma sotto visione microscopica e regolare la barra incisoria finché i punti designati per il bregma e lambda sullo strumento non toccano contemporaneamente il cranio.
NOTA: Una vista da un lato con luce focalizzata dall'altra può aiutare a determinare questa condizione. In alternativa, prendere un porta stereotassia con una bella cannula e misurare le coordinate dorsoventrali di Bregma aNd lambda sotto visione microscopica. Regolare la barra incisoria finché le coordinate dorsoventrali di Bregma e lambda non sono uguali. - Utilizzare un supporto stereotassico con cannula, calibrare sul bregma e calcolare la posizione di tutti i fori di foratura sul cranio. Utilizzando il supporto stereotatico, segnare le posizioni dei fori da forare, accuratamente graffiando il cranio o utilizzando un indicatore di colore chirurgico. Le coordinate per questo dipendono dagli obiettivi, le coordinate con riferimento al bregma sono fornite per il percorso iperdirezionale nella Tabella 1 , incluse le coordinate suggerite per gli elettrodi di riferimento cerebellare.
- Usando un microdrillo, eseguire attentamente tutti i fori. Per STN e SNr, eseguire un foro comune (circa 2 mm x 3 mm di dimensione). Tutti gli altri fori dovrebbero avere un diametro di circa 1 mm.
- Prendete due ottime cannule (almeno 27 G) e piegate le loro punte per formare una forma agganciata, usando una superficie dura o pinzette. Usalo per rimuovere eventuali debriS dai fori di foratura e tagliare con cura e rimuovere la dura mater nel comune foro STN / SNr.
- Lavare i fori di trivellazione con salina fisiologica. Applicare una goccia di salina fisiologica ogni 15 minuti ai fori di foratura per evitare il cervello e duro dall'essiccazione.
- Prendete un microdrillo e una corrispondente microvite in acciaio inossidabile ( es. Una vite M 1,2 mm x 2 mm), forate un foro e avvitate una micro-vite tra i fori di trapano degli elettrodi epidurali di riferimento sopra il cervelletto, fate lo stesso per Elettrodi epidurali M1.
- Far scorrere gli elettrodi epidurali Ag / AgCl auto-costruiti nei fori per gli elettrodi di riferimento e gli elettrodi M1. Guida la punta dell'elettrodo con le piccole pinzette e lo passa direttamente sotto l'osso del cranio nel foro di trapano.
- Fissare tutti gli elettrodi epidurale con acrilico dentale a due componenti. Assicurarsi di non coprire il punto bregma né influenzare il comune foro STN / SNr.
- Inserire il supporto preparato con l'elettrodo a microfilo a tungstenoNel telaio stereotatico.
- Calibrare l'elettrodo ventrale, che è destinato a raggiungere l'STN, al bregma. Regolare la posizione calcolata sopra il foro comune STN / SNr e abbassare gli elettrodi fino al cervello sotto visione microscopica. Assicurarsi che gli elettrodi a microfilo a tungsteno vadano senza intoppi nel cervello.
4. Mappatura e registrazioni elettrofisiologiche
NOTA: Per questo passo, è necessaria una gabbia di Faraday e un sistema di registrazione elettrofisiologico multicanale con software di registrazione in grado di filtrare in linea e di ordinare il punteggio in linea. Preferibilmente utilizzare un sistema che funziona con un preamplificatore posizionato vicino alla testa degli animali per mantenere il rumore e gli artefatti elettrici ad un minimo assoluto. Oltre agli elettrodi a microfilo a tungsteno, sono necessari almeno un elettrodo epidurale e uno di riferimento per eseguire registrazioni del percorso iperdirezionale. Si raccomanda di inserire epidurale e referenzeGli elettrodi in coppia senza che si toccano, questo aiuta in caso di malfunzionamento e consente diversi tipi di riferimenti nell'analisi dei dati.
- Mettere una gabbia mobile Faraday sopra il telaio stereotatico. Se è disponibile solo una gabbia di Faraday stazionaria, spostare con attenzione il telaio stereotatico nella gabbia di Faraday, assicurandosi che gli elettrodi cervicali profondi non siano abbassati nel cervello fino a che il telaio stereotatico non sia nella sua posizione finale.
- Collegare gli elettrodi al headstage della configurazione elettrofisiologica. Assicurarsi che gli elettrodi di riferimento siano collegati a canali di riferimento appropriati.
- Impostare il software di registrazione: Filtro a banda passante (0,05-8,000 Hz) e amplificare (guadagno 1,500-2,000x) il segnale di dati grezzo. Utilizzare un filtro LFP e un filtro a spina in linea con impostazioni appropriate (filtro passa-banda da 0,05-250 Hz per LFP, filtro passa-banda da 300-8,000 Hz per MUA). Per tutti i filtri, utilizzare un filtro tipo butterworth.
- Impostare una soglia di spike, se applicabile, per onlinE spike sorting. La maggior parte dei software di registrazione consente di impostare una soglia di picco, che è un valore di ampiezza sopra il quale un segnale è segnato come un picco dal software. Questa soglia può essere determinata in modo matematico come fattore o deviazione standard dell'ampiezza media del segnale a spruzzo filtrato o può essere preferibilmente determinato mediante ispezione visiva dei segmenti di dati <500 ms e impostato come una riga superiore al rumore del segnale in un grafico interfaccia utente.
NOTA: L'intenzione di impostare una soglia di picco è quella di contare i picchi e ordinare le unità per fornire informazioni su quanti neuroni sono attualmente registrati e come i loro picchi sono modellati. - Abbassare lentamente gli elettrodi microfilo a tungsteno fino a 1 mm dorsale del bersaglio, che è STN per il percorso iperdirezionale. Attendere che il segnale si stabilizzi se necessario.
- Per la mappatura elettrofisiologica, avanzare gli elettrodi ventralmente in passi di 100 μm. Ad ogni passo, valutare lo schema di cottura, sparando rMangiato e forma di picchi. Confrontiamo quelli con gli esempi tipici riportati in Figura 2 . Di solito, nuclei densi mostrano una rapida e continua penetrazione su diversi gradini dorsoventrali, mentre le strutture ricche di fibre mostrano bassi livelli di combustione e attività di picco meno omogenea nelle successive fasi ventrali.
- Per il percorso iperdirezionale, assicurarsi che l'elettrodo ventrale sia all'interno di STN.
NOTA: L'STN è raggiunto quando un rilevante aumento di MUA è rilevato ventrale della zona incerta. Ventrale all'STN, la rotazione si ferma quasi completamente perché l'elettrodo ha raggiunto la capsula interna. Quando l'elettrodo ventrale è in STN, la configurazione dei microelettri di tungsteno assicura l'elettrodo posteriore, secondo è in SNr. Il fine-tuning Dorsoventral a piccoli incrementi potrebbe essere necessario per registrare tipicamente MUA in STN e SNr contemporaneamente. Si noti che la frequenza di MUA dipende dal numero di neuroni effettivamente registrati e dal livello del cervelloAttivazione. - Una volta che gli elettrodi si trovano nelle strutture desiderate, impostare il filtraggio on-line e l'ordinamento dei picchi (vedere la Figura 4 ) e avviare la registrazione dei dati. Esempi tipici per i diversi stati di sincronizzazione corticale che possono essere identificati nelle registrazioni LFP sono mostrati in Figura 3 .
5. Fine dell'esperimento
- Quando le registrazioni vengono fatte, lentamente sollevate gli elettrodi dal cervello e li sciacquano istantaneamente con soluzione salina fisiologica. Gli elettrodi possono essere riutilizzati dopo una completa lavata e ispezione visiva. Elettrodi di curvatura di scarico.
- Eutanizzare gli animali da un'iniezione IP di un sovradosaggio di uretano (2,5 g / kg di peso corporeo).
NOTA: Urethane deve essere utilizzato solo per le procedure definitive. - Se è richiesta la verifica istologica della posizione dell'elettrodo o di altre procedure di colorazione istologica, rimuovere il cervello dal cranio e procedereTessuto appropriatamente.
NOTA: A seconda dei metodi di colorazione previsti, può essere necessaria una perfusione transcloscale. Per la verifica post-mortem della posizione dell'elettrodo, una colorazione Nissl standard è sufficiente nella maggior parte dei casi per visualizzare la traiettoria dell'elettrodo in ad es . Sezioni del cervello coronale. Ulteriori approcci per facilitare la verifica istologica del bersaglio includono l'uso di lesioni elettricamente indotte al tessuto cerebrale applicando corrente elettrica tramite elettrodi di registrazione o l'applicazione di colorante biocompatibile prima dell'inserzione dell'elettrodo 16 , 17 .
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Representative Results
Con gli elettrodi di registrazione qui utilizzati, è possibile campionare LFP dalla corteccia motore primaria, dal nucleo subthalamic e dalla substantia nigra pars reticulata e dalla MUA da STN e SNr. Inizialmente, i LFP e l'attività multi-unità vengono registrati insieme in un segnale a banda larga. Successivamente, i LFP e gli MUA sono separati da filtri a banda passante (0,05-250 Hz per LFP e 300-4,000 Hz per MUA).
Per il corretto targeting dei nuclei subcorticali, in particolare di piccole strutture come lo STN, è opportuno allineare le coordinate stereotassiali programmate con il segnale MUA registrato online. Per la traiettoria dell'elettrodo che punta alla caratteristica STN può essere registrata la figura MUA ( Figura 2 ) 9 , 20 .
Per i passaggi successivi dell'analisi, èSpesso obbligatori per definire le unità singole dall'attività multi-unità per principalmente l'analisi dei componenti ( Figura 4 ).
Nelle registrazioni LFP dall'M1 si possono identificare due stati di sincronizzazione corticale alternati spontaneamente: lo stato attivato (AS) e lo stato SWA ( Figura 3 ) 18 , 19 . Mentre lo stato SWA è dominato da oscillazioni lente ad alta ampiezza di circa 1 Hz, l'AS è caratterizzato da oscillazioni più veloci con una minima ampiezza ( Figura 3 ).
Figura 1: Impostazione degli elettrodi Microwire del cervello profondo in un supporto stereotossico standard. Si noti la separazione della punta tra A, la coppia di elettrodi per laSTN e B, la coppia di elettrodi per SNr in direzione dorsoventrale di ca. 200 μm e direzione anterioposterior di ca. 2 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Caratteristica attività multi-unità da una traiettoria di elettrodi Dorsoventral Targeting dello STN. ( A ) Registrazioni a più unità del nucleo thalamic (VPM) posteromediale ventrale, zona incerta (ZI), nucleo subthalamic (STN) e substantia nigra pars reticularis (SNr). Il VPM presenta picchi spartiti e irregolari distanziati ad alta ampiezza. Questo modello di picchi cessa quando si avvicina allo ZI. Quando l'elettrodo entra nello STN un tipico pattern di cottura ad alta frequenza con brevi brevi con ampiezza mediaSi può osservare. La SNr può essere identificata dalla sua ampiezza elevata e dal normale schema di cottura. ( B) STN traiettorie sovrapposte a immagini da un atlante stereotattico ratto 21 . Parte superiore: piano coronale. Parte inferiore: piano sagittale. Notare il passaggio della punta dell'elettrodo attraverso VPM e ZI. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Stati di sincronizzazione corticale in registrazioni LFP dalla corteccia motore primario durante l'anestesia in uretano. ( A ) Rappresentante Registrazione LFP a 600 s della corteccia motore primaria. Periodi di tempo con attività ad alta frequenza e bassa ampiezza corrispondenti allo stato attivato (i) e periodi di tempo con un ritmo più lento e alto Può essere differenziata l'ampiezza corrispondente allo stato Slow Wave Activity (ii). ( B ) corrispondente trama di frequenza di tempo su un intervallo di 600 s che illustra la potenza relativa di 0-20 Hz dei LFP presentati in (A). I coloranti più caldi indicano un potere relativo più elevato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Ordinamento di singole unità da attività multi-unità STN. ( A ) Visualizzazione tridimensionale dei cluster di unità nello spazio delle funzioni dopo l'analisi dei componenti principali. Ogni cluster rappresenta un'unità singola supposta. ( B ) Le forme d'onda dello Spike e le medie delle forme d'onda di picco corrispondenti ai cluster di (A).0fig4large.jpg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Coordinate da Bregma | STN | SNr | M1 | Riferimento 1 | Riferimento 2 |
| antero-posteriore | -3.6 | -4.8 | 3,0 | -10.0 | -10.0 |
| mediale-laterale | 2,5 | 2,5 | 3,0 | 3,0 | -3.0 |
| dorso-ventrale | -8.0 | n / a | n / a | n / a | n / a |
Tabella 1: Coordinate stereotossiche per la registrazione della Hyperdirect CoRtico-basal Ganglia Pathway. Tutti i punti sono misurati dal punto di riferimento del bregma sul cranio in mm; Non applicabile.
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Discussion
Nel presente studio, il metodo è stato dimostrato come registrare contemporaneamente segnali elettrofisiologici extracellulari da siti multipli di una determinata rete utilizzando l'esempio del percorso gangliale cortico-basale iperdirezionale che collega M1 con STN e SNr nei roditori.
Un passo critico nella registrazione di piccole strutture subcorticali come lo STN è l'inserimento preciso delle elettrodi di registrazione nell'obiettivo. Nel metodo presentato, prendersi cura di due passi fondamentali assicura un'alta precisione del targeting. Quando si prepara l'animale nell'apparato stereotassico prima che gli elettrodi vengano introdotti nel cervello, è assolutamente obbligatorio assicurarsi che il cranio venga portato nella posizione "cranio piatto" 22 . Per ottenere la posizione del cranio piatto, la posizione della barra incisoria del telaio stereotassico viene modificata fino a quando le altezze dei punti di riferimento bregma e lambdaN il cranio sono allo stesso piano dorsoventrale 21 . Solo garantendo questa posizione, le coordinate trovate in atlante stereotassiche possono essere applicate con un elevato livello di precisione all'animale di laboratorio in quanto le atlante si basano sulla posizione del cranio piatto 21 . Inoltre, le prove sperimentali dimostrano che l'accuratezza di targeting utilizzando una posizione personalizzata del cranio piatto è superiore a una regolazione fissa della barra incisiva 23 . La posizione degli elettrodi di registrazione nel piano dorsoventrale deve essere regolata in modo da registrare costantemente l'attività multi-unità. Le diverse strutture del nucleo e della materia bianca lungo la traiettoria dell'elettrodo mostrano caratteristiche caratteristiche di fuoco ( Figura 2 ), che possono essere utilizzate per reimpostare la posizione dell'elettrodo 9 , 20 .
Un altro passo importante nel metodo presentato è il posizionamento del rElettrodo di eference. Nel protocollo presentato è stata scelta una posizione sopra la corteccia cerebellare, in quanto a questo punto l'elettrodo di riferimento non rileva l'attività dei gangli cortico-basali che era il punto centrale dello studio. Negli studi con un interesse a metodi di analisi suscettibili di conduzione del volume, dovrebbe essere favorito un riferimento più locale 5 .
L'uretano è un anestetico ampiamente usato per la registrazione di potenziali extracellulari neuronali nella ricerca animale 11 , 18 , 24 , 25 , 2 6 . La ragione di questo è che una singola dose di uretano può produrre una narcosi stabile e duratura per 8-12 h con solo una depressione limitata dell'attività del sistema nervoso centrale rispetto ad altre anestetiche 27 . Tuttavia, l'anestesi di uretanoA attiva anche il sistema nervoso simpatico, che può portare ad effetti collaterali indesiderati come ad es. Iperglicemia 27 . A causa della sua azione duratura e della mancanza di un potente farmaco per antagonizzare il suo effetto anestetico, l'uretano non deve essere utilizzato per ripetuti esperimenti separati da ore o giorni. Se si prevede di effettuare più sessioni di registrazione sul medesimo animale o se esiste un motivo tecnico per non utilizzare uretano, l'anestesia a gas con isoflurano e le iniezioni di farmaci quali la ketamina e xilazina possono essere alternative ragionevoli per gli esperimenti elettrofisiologici in vivo 28 , 29 . Lo svantaggio di questi regimi di narcosi è che richiedono più frequenti controlli e regolazioni rispetto all'uso dell'uretano, a causa della loro breve emivita e dell'accumulazione dei farmaci nel tempo. Inoltre, ci sono prove che l'uretano potrebbe interferire meno con la fisiologia b Attività piovana rispetto ad altre anestetiche 30 .
Tutte le condizioni dettagliate di registrazione dettagliate determinano in che modo i dati ottenuti possono essere ulteriormente elaborati e analizzati in modalità non in linea, quindi è obbligatorio adeguare tutte le impostazioni ai requisiti dei passaggi di analisi previsti. Poiché ci sono molte opzioni per l'analisi di registrazioni extracellulari multicanale, l'utilizzo di toolbox open-source disponibili può essere vantaggioso 31 .
La registrazione di potenziali extracellulari in vivo è un metodo che offre una risoluzione temporale e spaziale univoca dei segnali del cervello che è superiore a metodi alternativi come la risonanza magnetica funzionale e l'imaging di calcio 5 . Il metodo presentato non può essere applicato solo alla registrazione del percorso iperdirezionale, ma può essere facilmente adattato a vari altri modelli sperimentali e alle domande di ricercaF "> 24 , 32 , 33. Tuttavia, poiché coinvolge la chirurgia stereotassica, ci sono molte impostazioni di ricerca in cui non può essere applicata e dove è necessario selezionare un metodo non invasivo.
In futuro, una combinazione della presentata tecnica di registrazione extracellulare multi-sito con strumenti optogenetici dovrebbe essere realizzata per migliorare ulteriormente la nostra comprensione della disfunzione di rete sottostante diverse malattie neuropsichiatrici al fine di trovare nuovi trattamenti.
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Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), KFO 247, per finanziare il nostro studio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ag/AgCl custom epidural electrodes | Goodfellow GmbH D-61213 Bad Nauheim, Germany info@goodfellow.com |
Product-ID AG005127 for 99.99% silver wire | Ag/AgCl electrodes will allow for better signal quality, but may only be used in acute experiments. Possible replacement: Stainless steel electrodes |
| Stereotaxic holder with acrylic block | David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA |
Product ID Model 1770 Standard Electrode Holder | Make sure the acrylic block has recesses which suit the electrode setup for the desired target. Acrylic blocks can easily be modified with a file to obtain the desired configuration. Possible replacement: Self-constructed electrode holders |
| Tungsten microwire electrodes 1.5 MΩ impedance | Microprobes.com 18247-D Flower Hill Way Gaithersburg, Maryland, 20879 USA |
Product-ID WE3ST31.5A5-250um | The 1.5 MΩ is necessary to record MUA and LFP at the same time. Possible replacement: Microelectrodes of different materials can be used. The electrodes have to be straight, robust and as thin as possible. |
| Rat alignment tool | David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA |
Product ID Model 944 Rat Alignment Tool | Allows the exact orientation of the brain to match stereotaxic atlases. Possible replacement: Stereotaxic holder with a cannula |
| Two-component dental acrylic | Associated Dental Products Ltd. Kemdent Works, Purton, Swindon Wiltshire, SN5 4HT, United Kingdom |
Simplex Rapid Powder Clear 225g, Product code: ACR803; Simplex Rapid Liquid 150ml, Product code: ACR920 | Depending in the electrodes used, superglue might be an easy alternative, if the electrodes are small and lightweight. Possible replacement: Superglue (Cyanacrylate-based) |
| Faraday cage | Self-construction | A proper Faraday cage will be the best protection from electromagnetic artifacts, but everything which can be formed into a box shape or applied to a frame and is made of conductive material may help. Possible replacement: Aluminum foil or copper mesh | |
| Electrophysiological setup with recording software and online spike-sorting capabilities | OmniPlex® Neural Data Acquisition System Plexon Inc 6500 Greenville Avenue, Suite 700 Dallas, Texas 75206 USA |
Offline sorting software is a potential alternative, multiple scripts and softwares can be found for free in the open source community. |
References
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