Summary
Neste estudo, a metodologia é apresentada sobre como realizar gravações eletrofisiológicas in vivo multi-site a partir da via hiperdiretiva sob anestesia com uretano.
Abstract
A evidência convergente mostra que muitas doenças neuropsiquiátricas devem ser entendidas como distúrbios das redes neuronais em grande escala. Para entender melhor a base fisiopatológica destas doenças, é necessário caracterizar com precisão de que maneira o processamento da informação é perturbado entre as diferentes partes neuronais do circuito. Usando gravações eletrofisiológicas extracelulares in vivo , é possível delinear com precisão a atividade neuronal dentro de uma rede neuronal. A aplicação deste método tem várias vantagens em relação a técnicas alternativas, por exemplo , ressonância magnética funcional e imagem de cálcio, pois permite uma resolução temporal e espacial única e não depende de organismos geneticamente modificados. No entanto, o uso de gravações extracelulares in vivo é limitado, pois é uma técnica invasiva que não pode ser universalmente aplicada. Neste artigo, um método simples e fácil de usar é apresentado wCom o qual é possível gravar simultaneamente potenciais extracelulares, como potenciais de campo locais e atividade multiunidade em vários sites de uma rede. É detalhado como uma segmentação precisa dos núcleos subcorticais pode ser alcançada usando uma combinação de cirurgia estereotáxica e análise on-line de gravações de várias unidades. Assim, é demonstrado, como uma rede completa, como o loop hiperligado de gânglios cortico basal, pode ser estudada em animais anestesiados in vivo .
Introduction
A evidência cumulativa recente sobre diferentes distúrbios neuropsiquiátricos, como a doença de Parkinson (PD) e esquizofrenia, sugere fortemente que sua fisiopatologia é baseada em uma disfunção crítica de circuitos neuronais estendidos que geralmente envolvem estruturas corticais e subcorticais 1 , 2 , 3 . De acordo com esta teoria, as manifestações clínicas das doenças surgem como conseqüência de uma capacidade de processamento da informação prejudicada de uma rede de células em vez de células únicas ou elementos neuronais específicos 1 , 2 , 3 . A fim de melhorar a compreensão deste complexo grupo de doenças neuropsiquiátricas e encontrar novas opções de tratamento, é obrigatório caracterizar a dinâmica neuronal dessas redes desordenadas em pacientes humanos e modelos animais em grande detalhe. Um excelO método para estudar redes em larga escala em indivíduos vivos é o registro multidisciplinar de potenciais extracelulares 4 . Usando esse método, é possível avaliar simultaneamente potenciais de campo locais (LFPs), que representam principalmente a soma temporal de correntes pós-sinápticas excitatórias e inibitórias e atividade multi-unidade (MUA), que é gerada por potenciais pré-sinápticos 5 . A gravação de potenciais extracelulares tem várias vantagens em relação aos métodos alternativos para estudar redes, por exemplo , imagens de ressonância magnética funcional e imagens de cálcio, porque proporciona uma maior resolução temporal e espacial e não depende de organismos geneticamente modificados 5 . No entanto, o uso de gravações extracelulares in vivo é limitado, pois é uma técnica invasiva que não pode ser universalmente aplicada.
Rec. Eletrofisiológica in vivoAs ordens podem ser realizadas tanto em animais acordados quanto em animais anestesiados 6 . Ambos os métodos são acompanhados por prós e contras específicos. Estudos em animais acordados permitem a gravação de sinais cerebrais durante o desempenho de tarefas comportamentais definidas, mas são propensos a movimentos relacionados e outros artefatos 7 , 8 . As gravações em animais anestesiados, por outro lado, oferecem a oportunidade de avaliar LFPs e MUA com um mínimo de artefatos em estados de sincronização cortical altamente definidos, mas os resultados também diferem em certa medida para o que pode ser encontrado em indivíduos acordados 9 , 10 , 11 .
Nos últimos anos, foi demonstrado que a amostragem de LFPs é especialmente útil para delinear mudanças patológicas da atividade da rede. Um exemplo proeminente disso é a pesquisa sobre a fisiopatologia da PD em paciente humanoS e modelos animais da doença, onde poderia ser demonstrado que as oscilações beta aprimoradas no circuito dos gânglios cortico basal estão ligadas a sintomas motores parkinsonianos 12,13. Como conseqüência dessa linha de pesquisa, atualmente é investigado se as oscilações beta poderiam ser usadas como um biomarcador de feedback online para estimulação cerebral profunda em circuito fechado 14 , 15 .
No presente estudo, fornece-se uma descrição detalhada das gravações eletrofisiológicas multi-site agudas de LFPs e MUA em ratos anestesiados com uretano. Está demonstrado como uma rede completa, como a via ganglionar cortico-basal hiperdirecional, pode ser caracterizada eletrofisiologicamente usando eletrodos padrão e personalizados e como esses eletrodos podem ser construídos. É especialmente enfatizado como uma segmentação precisa dos núcleos dos gânglios basais pode ser alcançada por coMbining cirurgia estereotáxica, juntamente com o registro on-line de MUAs.
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Protocol
Os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com a Lei alemã de bem-estar animal (última revisão em 2014) e regulamentos europeus (2010/63 / UE). As experiências foram aprovadas pela autoridade local de bem-estar animal (LaGeSo, Berlim), e em conformidade com o departamento local e diretrizes internacionais.
NOTA: No método apresentado, dois modelos de eletrodos são usados para registrar a partir da via ganglionar cortico-basal hiperdirecional que conecta o córtex motor primário (M1) com o núcleo subtalâmico (STN) e a substância nigra pars reticulada (SNr). Para as gravações de eletrocorticograma peridural (ECoG) dos eletrodos Ag / AgCl personalizados de baixa impedância M1, são usados. As gravações da STN e SNr são realizadas com eletrodos de tungstênio de alta impedância comercialmente disponíveis.
1. Construção de eletrodos epidurais Epidural Ag / AgCl
- Pegue um aprox. Faixa de 5 cm de comprimento de fio de prata puro de 99,99% com um diameteR de 200 μm e remova qualquer revestimento, se necessário.
- Segure a ponta do fio com a ponta para baixo em uma chama de um isqueiro ou vela até a ponta começar a derreter. Aguarde até que a ponta seja em forma de bola e tenha um diâmetro de aproximadamente 1 mm. Corte o eletrodo pré-formado até um comprimento total de 15 mm desde o início da ponta em forma de bola até a extremidade do fio.
- Solde um conector de precisão para a extremidade do fio, que se adapta ao sistema de gravação eletrofisiológico usado. Cubra o ponto de soldagem da extremidade do fio ao conector com verniz de prata condutor. Isso ajuda a condutividade e resulta em uma melhor qualidade de sinal.
- Após o verniz condutor ter secado, cubra o ponto de soldagem com um tubo termoretrante de 3 mm a 1 mm. Use cuidadosamente o martelo de um relojoeiro para aplainar a ponta em forma de bola para metade da espessura.
- Coloque as luvas de exame e tome um pano de limpeza sem fiapos com 100% de etanol para remover qualquer sujeira e graxa.
- Coloque os eletrodos emUm tubo de centrifugação de 15 mL ou um tubo de cultura de células e preenchê-lo com cloro de cloro doméstico (CUIDADO: contendo 2,8 g de hipoclorídio de sódio por 100 g de solvente) até a ponta em forma de bola estar totalmente coberta.
CUIDADO: O cloro é corajoso; Siga sempre as instruções de segurança do fabricante. - Retire os eletrodos após 23 minutos e elimine-os generosamente com água destilada. A aplicação bem sucedida de uma camada de cloreto de prata aparece como uma mudança de cor marrom homogênea.
- Seca no ar. Depois de completamente seco, leve os eletrodos com uma pinça fina. Com um pincel fino, aplique isolamento elétrico líquido. Comece no fio diretamente atrás da ponta do eletrodo e cubra tudo até o tubo de encolhimento de calor. Deixe o isolamento secar durante pelo menos 2 h.
- Para controle de qualidade, realize uma verificação da condutividade elétrica com um multímetro. Se disponível, execute testes de impedância a 1 kHz usando um medidor de impedância apropriado, enquanto o eletrodo e testeA sonda é colocada em uma solução contendo H2O contendo 0,9% sem tocar entre si. Os valores de impedância a 1 kHz devem ser de aproximadamente 8 kΩ.
2. Afixando os eletrodos a um suporte estereotáxico
NOTA: Para gravar MUA e LFPs ao mesmo tempo, use eletrodos de microondas de tungstênio com uma impedância de 1,5 MΩ. Se o foco das gravações estiverem em gravações de alta qualidade de unidades únicas, escolha eletrodos de microwire com uma impedância maior (> 5 MΩ). Se o objetivo do estudo for direcionado exclusivamente para LFPs, os eletrodos com impedâncias mais baixas podem ser aceitáveis. Para pequenas estruturas, para as quais os ajustes estereotáxicos dorsoventrais são freqüentemente necessários, use pares de eletrodos com uma separação adequada da ponta dorsoventral (neste caso, 250 μm). Além disso, isso proporciona a vantagem de um eletrodo de referência mais local, se necessário. As coordenadas estereotáxicas são sempre medidas a partir do eletrodo mais baixo e umaÉ calculado em referência ao bregma.
- Pegue um suporte de eletrodo estereotáxico padrão com um bloco de acrílico e aperte e coloque-o com segurança sobre uma superfície plana no campo de visão de um microscópio cirúrgico.
- Coloque suavemente o primeiro par de eletrodos no bloco acrílico do suporte com pedaços de fita adesiva (3 mm x 8 mm) usando uma pinça fina. Os eletrodos devem protrusar o bloco de acrílico aprox. 12 mm.
- Coloque cuidadosamente o segundo eletrodo bipolar ao lado do primeiro eletrodo. Para segmentar as estruturas da via hiperdiretada, a distância deve ser de 2 mm ( Figura 1 ). Para a maioria dos suportes de eletrodos estereotáxicos padrão, este é o recesso adjacente. Use um medidor de calibre para verificar. Diferentes redes podem ser abordadas da mesma maneira. Para isso, o bloco de acrílico pode ser girado até certo ponto.
- Ajuste o segundo par de eletrodos deslizando-o cuidadosamente para uma posição, na qual a ponta mais ventral é de aproximadamente 200Μm recesso comparado ao primeiro eletrodo ( Figura 1 ). Faça isso sob visão microscópica. Para isso, use uma cânula de 30 G (diâmetro externo de 300 μm) para melhor estimar a distância.
- Pressione a fita adesiva e, em seguida, segure com a braçadeira de metal do suporte.
3. Cirurgia
- Para gravações eletrofisiológicas, use uretano (CUIDADO) para anestesia.
Cuidado: O uretano é tóxico e carcinogênico, portanto, siga sempre os regulamentos de segurança e a folha de dados fornecida pelo fabricante da substância. - Prepare uma solução de 200 mg / mL de uretano em solução salina médica de NaCl a 0,9%.
- Administrar um total de 1,3 g / kg de uretano corporal por via intraperitoneal (IP). Dependendo da cepa do rato, pode ser razoável dividir a dose em duas doses com um intervalo de 15 min entre as injeções, a fim de aumentar a segurança da anestesia.
- Verifique a profundidade da anestesia usando pReflexo de retirada de edal e outros reflexos adequados. Se a anestesia não for suficientemente profunda para realizar uma cirurgia, injete 0,15 g / kg de peso corporal de uretano IP e espere mais 15 min.
- Aplique uma pomada ocular para evitar a desidratação da córnea.
- Monitorar constantemente a freqüência respiratória e o reflexo de retirada do pedal durante a anestesia. Use uma almofada de aquecimento de pequenos animais com controle de temperatura para garantir que uma temperatura corporal fisiológica seja mantida durante toda a cirurgia. Antes do início das gravações eletrofisiológicas, mude para uma alternativa não elétrica ( por exemplo , almofada de cabeça de acetato de sódio).
- Raspar o pêlo ao lado do lado dorsal da cabeça para conseguir um campo cirúrgico limpo. Desinfecte em torno do local da incisão com desinfetante cirúrgico apropriado. Corrigir o animal no quadro estereotáxico.
- Execute uma incisão de 2 cm de comprimento no couro cabeludo na direção sagital com um bisturi. Use um bisturi para raspar ligeiramente a aponeurose do crânio e desinfecte o crânio. Use coTton buds embebido em 3% de H 2 O 2 para remover qualquer tecido restante.
- Use um electrocauter ou termocauter para controlar o sangramento, se necessário. Pare as sangramentos do osso do crânio e hipoderma, se o sangramento não parar espontaneamente após 1-2 minutos e dificulta a visão no crânio.
- Ajuste a barra do incisivo até que a cabeça esteja posicionada na posição plana do crânio, o que significa que o bregma e lambda como pontos de referência estereotáxicos estão no mesmo plano. Isso é mais importante para obter alta precisão cirúrgica. Use uma ferramenta padrão de alinhamento de ratos estereotáxicos, calibre a ponta designada para o bregma sob visão microscópica e ajuste a barra do incisivo até que os pontos designados para a bregma e lambda na ferramenta toquem o crânio ao mesmo tempo.
NOTA: Uma visão de um lado com luz focada do outro pode ajudar a determinar esta condição. Alternativamente, tome um suporte estereotáxico com uma cânula fina e mande as coordenadas dorsoventral da Bregma aNd lambda sob visão microscópica. Ajuste a barra do incisivo até que as coordenadas dorsoventrais de Bregma e lambda sejam as mesmas. - Use um suporte estereotáxico com cânula, calibre para o bregma e depois calcule a posição de todos os furos no crânio. Usando o suporte estereotáxico, marque as posições dos furos a serem perfurados, coçando com cuidado o crânio ou usando um marcador de cor cirúrgica. As coordenadas para isso dependem dos alvos, as coordenadas com referência ao bregma são dadas para a via hiperdiretada na Tabela 1 , incluindo as coordenadas sugeridas para eletrodos de referência cerebelares.
- Usando uma microdrill cuidadosamente perfurar todos os buracos. Para a STN e SNr, perfure um furo comum (aproximadamente 2 mm x 3 mm de tamanho). Todos os outros furos devem ter um diâmetro de cerca de 1 mm.
- Pegue duas cânulas finas (pelo menos 27 G) e dobre suas pontas para formar uma forma de ganchos, usando uma superfície dura ou uma pinça. Use estes para remover qualquer debriS dos furos, e cuidadosamente cortar e remover a dura-máter no buraco comum STN / SNr.
- Desligue os furos com solução salina fisiológica. Aplique uma gota de solução salina fisiológica a cada 15 minutos até os orifícios de perfuração para evitar que o cérebro ea duraçao se desabafam.
- Pegue uma microdrill e um micro-parafuso de aço inoxidável correspondente ( por exemplo, um parafuso M 1,2 mm x 2 mm), perfure um furo e rosqueie um micro-parafuso entre os furos dos eletrodos epidural de referência acima do cerebelo, faça o mesmo para o Eletrodos epidurais M1.
- Deslize os eletrodos peridurais Ag / AgCl auto-construídos nos furos para os eletrodos de referência e os eletrodos M1. Guie a ponta do eletrodo com pinças finas e deslize-o diretamente abaixo do osso do crânio no furo.
- Corrigir todos os eletrodos epidural com acrílico dental de dois componentes. Certifique-se de não cobrir o ponto de bregma nem afetar o buraco STN / SNr comum.
- Insira o suporte preparado com o eletrodo de microondas de tungstênioEstá no quadro estereotáxico.
- Calibre o eletrodo mais ventral, que se destina a direcionar a STN, para o bregma. Ajuste para a posição calculada acima do buraco comum STN / SNr e abaixe os eletrodos até o cérebro sob visão microscópica. Certifique-se de que os eletrodos de microondas de tungstênio entrem no interior do cérebro sem problemas.
4. Mapeamento eletrofisiológico e gravações
NOTA: Para esta etapa, é necessária uma gaiola Faraday e um sistema de gravação eletrofisiológica multicanal com software de gravação capaz de filtrar on-line e classificar por linha. De preferência, use um sistema que funcione com um pré-amplificador posicionado perto da cabeça dos animais para manter o ruído elétrico e os artefatos no mínimo absoluto. Além dos eletrodos de microondas de tungstênio, pelo menos um eletrodo epidural e um eletrodo de referência são necessários para realizar gravações da via hiperdiretária. Recomenda-se inserir epidural e referenciarE eletrodos em par, sem que eles se toquem, isso ajuda em caso de mau funcionamento e permite diferentes tipos de referência na análise de dados.
- Coloque uma gaiola móvel Faraday acima do quadro estereotáxico. Se apenas uma gaiola estacionária de Faraday estiver disponível, mova cuidadosamente o quadro estereotáxico para a gaiola de Faraday, assegurando que os eletrodos do cérebro profundo não estejam abaixados no cérebro até o quadro estereotáxico estar em sua posição final.
- Conecte os eletrodos ao headstage da instalação eletrofisiológica. Verifique se os eletrodos de referência estão conectados a canais de referência apropriados.
- Configure o software de gravação: filtro Bandpass (0,05-8,000 Hz) e amplifique (ganho 1,500-2,000x) o sinal de dados brutos. Use um filtro LFP e espiga on-line com as configurações apropriadas (filtro passa-banda 0,05-250 Hz para LFPs, filtro passa-banda 300-8,000 Hz para MUA). Para todos os filtros, use um filtro tipo butterworth.
- Configure um limite de pico, se aplicável, para onlinE spike classing. A maioria dos softwares de gravação permite a configuração de um limite de espiga, que é um valor de amplitude acima do qual um sinal é marcado como um pico pelo software. Este limiar pode ser determinado matematicamente como um fator ou desvio padrão da amplitude média do sinal de espiga filtrada, ou pode preferencialmente ser determinado por inspeção visual de segmentos de dados <500 ms e configurado como uma linha acima do ruído de sinal em um gráfico interface de usuário.
NOTA: A intenção na configuração de um limite de espiga é contar picos e unidades de ordenação para fornecer informações sobre quantos neurônios estão atualmente gravados e como seus picos são moldados. - Abaixe lentamente os eletrodos de microondas de tungstênio a 1 mm de dorsal do alvo, que é STN para hiperdireito. Aguarde até que o sinal se estabilize, se necessário.
- Para o mapeamento eletrofisiológico, avance os eletrodos ventralmente em passos de 100 μm. Em cada passo, avalie o padrão de disparo, disparandoComia e forma de espigas. Compare aqueles com os exemplos típicos dados na Figura 2 . Comumente, os núcleos densos mostram espetadas rápidas e contínuas em várias etapas dorsoventrais, enquanto que as estruturas ricas em fibras mostram baixas taxas de disparo e atividade de espiga menos homogênea nas subseqüentes etapas ventrais.
- Para o percurso hiperdireito, verifique se o eletrodo mais ventral está dentro da STN.
NOTA: O STN é atingido quando um aumento considerável no MUA é detectado ventral da Zona incerta. Ventral para a STN, o pico termina quase completamente porque o eletrodo atingiu a cápsula interna. Quando o eletrodo mais ventral está em STN, a configuração dos microeletrodos de tungstênio garante que o posterior e segundo eletrodo esteja em SNr. O ajuste fino de Dorsoventral em pequenos incrementos pode ser necessário para gravar MUA típico em STN e SNr ao mesmo tempo. Observe que a freqüência de MUA depende do número de neurônios realmente registrados e no nível de cérebroativação. - Uma vez que os eletrodos estão nas estruturas desejadas, configure filtragem on-line e classificação por espiga (veja a Figura 4 ) e, em seguida, comece a gravação dos dados. Exemplos típicos para os diferentes estados de sincronização cortical que podem ser identificados nas gravações LFP são mostrados na Figura 3 .
5. Fim da experiência
- Quando as gravações são feitas, levante lentamente os eletrodos do cérebro e, instantaneamente, elimine-os com solução salina fisiológica. Os eletrodos podem ser reutilizados após uma lavagem completa e inspeção visual. Eléctrodos de dobra de descarga.
- Eutanizar os animais por uma injeção IP de uma sobredosagem de uretano (2,5 g / kg de peso corporal).
NOTA: O uretano só deve ser usado para procedimentos finais. - Se for necessária verificação histológica da posição do eletrodo ou outros procedimentos de coloração histológica, remova o cérebro do crânio e processe oTecido adequadamente.
NOTA: Dependendo dos métodos de coloração pretendidos, a perfusão transcardial pode ser necessária. Para a verificação pós-mortem da posição do eletrodo, uma coloração padrão de Nissl é suficiente na maioria dos casos para visualizar a trajetória do eletrodo, por exemplo, nas seções coronais do cérebro. Outras abordagens para facilitar a verificação do alvo histológico incluem o uso de lesões induzidas eletricamente no tecido cerebral aplicando corrente elétrica através dos eletrodos de gravação ou a aplicação de corante biocompatível antes da inserção do eletrodo 16 , 17 .
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Representative Results
Com os eletrodos de gravação aqui utilizados, é possível amostrar LFPs do córtex motor primário, o núcleo subtalâmico e a substância nigra pars reticulata e MUA da STN e SNr. Inicialmente, LFPs e atividade de várias unidades são gravadas em conjunto em um sinal de banda larga. Posteriormente, LFPs e MUAs são separados por filtros de passagem de banda (0,05-250 Hz para LFPs e 300-4,000 Hz para MUA).
Para a segmentação correta dos núcleos subcorticais, especialmente de pequenas estruturas, como a STN, é vantajoso alinhar as coordenadas estereotáxicas planejadas com o sinal MUA registrado online. Para a trajetória do eléctrodo visando a característica STN, o padrão MUA pode ser gravado ( Figura 2 ) 9 , 20 .
Para as etapas posteriores da análise, éMuitas vezes obrigatório para definir unidades únicas a partir de atividades de múltiplas unidades por análise de componentes principais ( Figura 4 ).
Nas gravações LFP do M1, podem ser identificados dois estados de sincronização cortical espontaneamente alternados: o Estado ativado (AS) e o estado da atividade de onda lenta (SWA) ( Figura 3 ) 18 , 19 . Enquanto o estado SWA é dominado por oscilações lentas de alta amplitude de cerca de 1 Hz, o AS é caracterizado por oscilações mais rápidas com menor amplitude ( Figura 3 ).
Figura 1: Configuração dos eléctrodos Microwire do cérebro profundo em um suporte estereotáxico padrão. Observe a separação da ponta entre A, o par de eletrodos para oSTN e B, o par de eletrodos para o SNr na direção dorsoventral de aprox. 200 μm e direção anterioposterior de aprox. 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: atividade de unidade múltipla característica de uma trajetória de eletrodo Dorsoventral visando a STN. ( A ) Gravações de unidades múltiplas do núcleo talalar ventricular pós-medial (VPM), a zona incerta (ZI), o núcleo subtalâmico (STN) e a substância nigra pars reticularis (SNr). O VPM exibe espigas de alta amplitude espaçadas escassas e irregulares. Esse padrão de pontos cessa quando se aproxima do ZI. Quando o eletrodo entra no STN, um padrão típico de disparo de alta frequência com rajadas curtas com amplitude médiaUde pode ser observado. O SNr pode ser identificado por sua alta amplitude e padrão de disparo regular. ( B) Trajectórias STN sobrepostas a imagens de um atlas estereotáxico de rato 21 . Parte superior: plano coronal. Parte inferior: plano sagital. Observe a passagem da ponta do eletrodo através de VPM e ZI. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Estados de sincronização cortical em gravações de LFP do cortex de motor primário durante a anestesia de uretano. ( A ) Gravação LFP de 600 s representativa do córtex motor primário. Períodos de tempo com alta freqüência, atividade de baixa amplitude correspondente ao Estado Ativado (i) e períodos de tempo com um ritmo mais lento e alto A amplitude de amplitude correspondente ao estado da atividade da onda lenta (ii) pode ser diferenciada. ( B ) Correspondência do gráfico de tempo-frequência em um intervalo de 600 s ilustrando a potência relativa de 0-20 Hz dos LFPs apresentados em (A). Os colorantes mais quentes indicam maior potência relativa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Seleção de Unidades Únicas da STN Multi-Unit Activity. ( A ) Visualização tridimensional de clusters de unidades no espaço de recurso após análise de componente principal. Cada cluster representa uma única unidade putativa. ( B ) Formas de onda Spike e médias de forma de onda de espiga correspondentes aos aglomerados em (A).0fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Coordenadas de Bregma | STN | SNr | M1 | Referência 1 | Referência 2 |
| anterior posterior | -3.6 | -4,8 | +3.0 | -10,0 | -10,0 |
| Medial lateral | +2,5 | +2,5 | +3.0 | +3.0 | -3,0 |
| Dorsal-ventral | -8,0 | n / D | n / D | n / D | n / D |
Tabela 1: Coordenadas estereotáxicas para a gravação do Hyperdirect CoRican-basal Ganglia Pathway. Todos os pontos são medidos a partir do ponto de referência bregma no crânio em mm; Nao aplicável.
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Discussion
No presente estudo, o método é demonstrado como gravar sinais eletrofisiológicos extracelulares simultaneamente a partir de múltiplos locais de uma determinada rede utilizando o exemplo da via de ganglios cortico-basal hiperdirectos que conecta o M1 com STN e SNr em roedores.
Um passo crítico na gravação de pequenas estruturas subcorticais, como a STN, é a inserção guiada com precisão dos eletrodos de gravação no alvo. No método apresentado, cuidar de duas etapas cruciais assegura uma alta precisão da segmentação. Ao preparar o animal no aparelho estereotáxico antes de os eletrodos serem introduzidos no cérebro, é absolutamente obrigatório garantir que o crânio seja trazido para a posição "crânio plano" 22 . Para atingir a posição plana do crânio, a posição da barra incisiva do quadro estereotáxico é alterada até as alturas dos pontos de referência bregma e lambda oNo crânio estão no mesmo plano dorsoventral 21 . Apenas assegurando esta posição, as coordenadas encontradas em atlas estereotáxicos podem ser aplicadas com alto nível de precisão ao animal de laboratório individual, uma vez que os atlas são baseados na posição plana do crânio 21 . Além disso, evidências experimentais comprovam que a precisão de segmentação usando uma posição de crânio plano individualizado é superior a um ajuste fixo da barra incisiva 23 . A posição dos eletrodos de gravação no plano dorsoventral deve ser ajustada de acordo com o registro constante da atividade de várias unidades. Os diferentes núcleos e estruturas de matéria branca ao longo da trajetória do eletrodo mostram padrões de fogo característicos ( Figura 2 ), que podem ser usados para reajustar a posição do eletrodo 9 , 20 .
Outro passo importante no método apresentado é a colocação do rEletrodo de eleição. No protocolo apresentado, foi escolhida uma posição acima do córtex cerebelar, porque nesse ponto o eletrodo de referência não detecta a atividade dos ganglios cortico-basal que foi o ponto central do estudo. Em estudos com interesse em métodos de análise que são suscetíveis à condução do volume, uma referência mais local deve ser favorecida 5 .
O uretano é um anestésico amplamente utilizado para a gravação de potenciais extracelulares neuronais na pesquisa com animais 11 , 18 , 24 , 25 , 2 6 . A razão para isso é que uma única dose de uretano pode produzir uma narcose estável e de longa duração por 8 a 12 h com apenas uma depressão limitada da atividade do sistema nervoso central em comparação com outros anestesicos 27 . No entanto, anestesia de uretanoA também ativa o sistema nervoso simpático, o que pode resultar em efeitos colaterais indesejáveis, como, por exemplo, hiperglicemia 27 . Devido à sua ação duradoura e à falta de uma droga potente para antagonizar seu efeito anestésico, o uretano não deve ser usado para experiências repetidas que são separadas por horas ou dias. Se for planejado fazer várias sessões de gravação no mesmo animal ou se houver uma razão técnica para não usar uretano, a anestesia com gás com isoflurano e injeções de drogas como a cetamina e a xilazina podem ser alternativas razoáveis para experiências eletrofisiológicas in vivo 28 , 29 . A desvantagem desses regimes de narcose é que eles exigem monitoramento e ajustes mais freqüentes do que o uso de uretano, devido à baixa meia vida e ao acúmulo de drogas ao longo do tempo. Além disso, há evidências de que uretano pode interferir menos com b fisiológico Atividade da chuva do que outros anestésicos 30 .
Todas as condições de gravação detalhadas aqui determinam de forma crítica como os dados obtidos podem ser posteriormente processados e analisados de forma offline, portanto, é obrigatório ajustar todas as configurações aos requisitos das etapas de análise planejadas. Uma vez que existem muitas opções para a análise de gravações extracelulares multicanais, o uso de caixas de ferramentas open-source disponíveis pode ser vantajoso 31 .
A gravação de potenciais extracelulares in vivo é um método que oferece uma resolução temporal e espacial única de sinais cerebrais que é superior a métodos alternativos, como ressonância magnética funcional e imagem de cálcio 5 . O método apresentado não só pode ser aplicado à gravação da via hiperdiretada, mas pode ser facilmente ajustado a uma variedade de outros modelos experimentais e questões de pesquisaF "> 24 , 32 , 33. No entanto, uma vez que envolve a cirurgia estereotáxica, existem muitas configurações de pesquisa onde não pode ser aplicada e onde um método não-invasivo deve ser selecionado.
No futuro, uma combinação da técnica extracelular de gravação multi-local apresentada com ferramentas optogenéticas deve ser realizada para aprimorar ainda mais nossa compreensão da disfunção da rede subjacente a diferentes doenças neuropsiquiátricas, a fim de encontrar novos tratamentos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), KFO 247, por financiar nosso estudo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ag/AgCl custom epidural electrodes | Goodfellow GmbH D-61213 Bad Nauheim, Germany info@goodfellow.com |
Product-ID AG005127 for 99.99% silver wire | Ag/AgCl electrodes will allow for better signal quality, but may only be used in acute experiments. Possible replacement: Stainless steel electrodes |
| Stereotaxic holder with acrylic block | David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA |
Product ID Model 1770 Standard Electrode Holder | Make sure the acrylic block has recesses which suit the electrode setup for the desired target. Acrylic blocks can easily be modified with a file to obtain the desired configuration. Possible replacement: Self-constructed electrode holders |
| Tungsten microwire electrodes 1.5 MΩ impedance | Microprobes.com 18247-D Flower Hill Way Gaithersburg, Maryland, 20879 USA |
Product-ID WE3ST31.5A5-250um | The 1.5 MΩ is necessary to record MUA and LFP at the same time. Possible replacement: Microelectrodes of different materials can be used. The electrodes have to be straight, robust and as thin as possible. |
| Rat alignment tool | David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA |
Product ID Model 944 Rat Alignment Tool | Allows the exact orientation of the brain to match stereotaxic atlases. Possible replacement: Stereotaxic holder with a cannula |
| Two-component dental acrylic | Associated Dental Products Ltd. Kemdent Works, Purton, Swindon Wiltshire, SN5 4HT, United Kingdom |
Simplex Rapid Powder Clear 225g, Product code: ACR803; Simplex Rapid Liquid 150ml, Product code: ACR920 | Depending in the electrodes used, superglue might be an easy alternative, if the electrodes are small and lightweight. Possible replacement: Superglue (Cyanacrylate-based) |
| Faraday cage | Self-construction | A proper Faraday cage will be the best protection from electromagnetic artifacts, but everything which can be formed into a box shape or applied to a frame and is made of conductive material may help. Possible replacement: Aluminum foil or copper mesh | |
| Electrophysiological setup with recording software and online spike-sorting capabilities | OmniPlex® Neural Data Acquisition System Plexon Inc 6500 Greenville Avenue, Suite 700 Dallas, Texas 75206 USA |
Offline sorting software is a potential alternative, multiple scripts and softwares can be found for free in the open source community. |
References
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