Summary
I den här studien presenteras metodiken för hur man utför elektrofysiologiska inspelningar i vivo från hyperdirektvägen under uretananestesi.
Abstract
Konvergerande bevis visar att många neuropsykiatriska sjukdomar bör förstås som störningar i storskaliga neuronala nätverk. För att bättre förstå den patofysiologiska grunden för dessa sjukdomar är det nödvändigt att exakt karakterisera på vilket sätt förhanteringen av information störs mellan kretsens olika neurondelar. Med hjälp av extracellulära in vivo elektrofysiologiska inspelningar är det möjligt att noggrant avgränsa neuronal aktivitet inom ett neuronalt nätverk. Tillämpningen av denna metod har flera fördelar gentemot alternativa tekniker, t.ex. funktionell magnetisk resonansbildning och kalciumavbildning, eftersom det möjliggör en unik tidsmässig och rumslig upplösning och inte litar på genetiskt manipulerade organismer. Användningen av extracellulära in vivo- inspelningar är dock begränsad eftersom det är en invasiv teknik som inte kan tillämpas universellt. I denna artikel presenteras en enkel och enkel att använda metod wMed vilken det är möjligt att samtidigt registrera extracellulära potentialer, såsom lokala fältpotentialer och flerfunktionsaktivitet vid flera nät i ett nätverk. Det är detaljerat hur en exakt inriktning av subkortiska kärnor kan uppnås med hjälp av en kombination av stereotaktisk kirurgi och onlineanalys av multi-unit-inspelningar. Det visas sålunda hur ett komplett nätverk, såsom den hyperdirektiga kortikobasala ganglia-slingan, kan studeras i narkoserade djur in vivo .
Introduction
Nya kumulativa bevis på olika neuropsykiatriska störningar som Parkinsons sjukdom (PD) och schizofreni föreslår starkt att deras patofysiologi är baserad på en kritisk dysfunktion av utvidgade neuronala kretsar som ofta involverar kortikala och subkortiska strukturer 1 , 2 , 3 . Enligt denna teori uppstår de kliniska manifestationerna av sjukdomarna som en följd av en försämrad informationsbehandlingsförmåga hos ett nätverk av celler i stället för enskilda celler eller specifika neuronelement 1 , 2 , 3 . För att förstärka förståelsen för denna komplexa grupp av neuropsykiatriska sjukdomar och hitta nya behandlingsalternativ är det obligatoriskt att i detalj beskriva neuronal dynamik hos dessa oordnade nätverk i mänskliga patienter och djurmodeller. En utmärktEnt metod för att studera storskaliga nätverk i levande ämnen är multi-site elektrofysiologiska inspelningar av extracellulära potentialer 4 . Med hjälp av denna metod är det möjligt att samtidigt utvärdera lokala fältpotentialer (LFP), som huvudsakligen representerar den tidsmässiga summeringen av excitatoriska och hämmande postsynaptiska strömmar och multi-unit activity (MUA), som genereras av presynaptiska potentialer 5 . Inspelningen av extracellulära potentialer har flera fördelar jämfört med alternativa metoder för att studera nätverk, t.ex. funktionell magnetisk resonansbildning och kalciumavbildning, eftersom det ger en högre tidsmässig och rumslig upplösning och eftersom den inte är beroende av genetiskt manipulerade organismer 5 . Användningen av extracellulära in vivo- inspelningar är dock begränsad eftersom det är en invasiv teknik som inte kan tillämpas universellt.
In vivo elektrofysiologisk recOrdningar kan utföras i vakna såväl som i bedövade djur 6 . Båda metoderna åtföljs av specifika fördelar och nackdelar. Studier i vakna djur möjliggör inspelning av hjärnsignaler under utförandet av definierade beteendeuppgifter, men är benägna för rörelserelaterade och andra artefakter 7 , 8 . Inspelningar i bedövade djur å andra sidan ger möjlighet att bedöma LFP och MUA med ett minimum av artefakter vid mycket definierade kortikala synkroniseringslägen, men resultaten skiljer sig i viss utsträckning från vad som finns i vakna ämnen 9 , 10 , 11 .
Under senare år har det visat sig att provtagningen av LFP är särskilt användbar för att avgränsa patologiska förändringar av nätverksaktivitet. Ett framträdande exempel på detta är forskning om patofysiologin hos PD hos den mänskliga patientenS och djurmodeller av sjukdomen, där det kunde visas att förbättrade beta-oscillationer i den kortikobasala ganglia-slingan är kopplade till parkinsonsmotoriska symptom 12 , 13 . Som en följd av denna forskningslinje undersöks det för närvarande om beta-oscillationer kan användas som en biomarker för online-återkoppling för djup hjärnstimulering 14 , 15 med sluten slinga.
I den föreliggande studien tillhandahålls en detaljerad beskrivning av akuta in vitro-elektrofysiologiska inspelningar av LFP och MUA i råttor som bedövats med uretan. Det demonstreras hur ett komplett nätverk, såsom den hyperdirektiga kortikobasala gangliavägen, kan karakteriseras elektrofysiologiskt med hjälp av standard och anpassade elektroder och hur dessa elektroder kan byggas. Det framhålls särskilt hur en exakt målinriktning av basala ganglierkärnor kan uppnås genom coMbining stereotaktisk operation tillsammans med online registrering av MUAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimentella förfaranden genomfördes i enlighet med den tyska djurskyddslagen (senast reviderad 2014) och europeiska bestämmelser (2010/63 / EU). Experiment godkändes av den lokala djurskyddsmyndigheten (LaGeSo, Berlin) och överensstämde med lokala avdelningar och internationella riktlinjer.
OBS! I den presenterade metoden används två modeller av elektroder för att spela in från den hyperdirektiska cortico-basala ganglia-vägen som förbinder den primära motorcortexen (M1) med subthalamuskärnan (STN) och substantia nigra pars reticulate (SNr). För epidural elektrokorticogram (ECoG) används inspelningar från M1 specialtillverkade lågimpedans Ag / AgCl elektroder. Inspelningarna från STN och SNr utförs med kommersiellt tillgängliga högimpedans volframelektroder.
1. Konstruktion av Epidural Ag / AgCl Epidural Electrodes
- Ta ca. 5 cm lång remsa av 99,99% ren silver tråd med diameternR av 200 μm och avlägsna eventuell beläggning om det behövs.
- Håll trådspetsen med spetsen nedåt i en flamm av en tändare eller ett ljus tills spetsen börjar smälta. Vänta tills spetsen är bollformad och har en diameter på ca 1 mm. Skär av den förformade elektroden till en total längd på 15 mm från början av den kulformade spetsen till trådänden.
- Löd en precisionsanslutning till trådänden, som passar det använda elektrofysiologiska inspelningssystemet. Täck lödpunkten från trådänden till kontakten med ledande silverfärg. Detta hjälper ledningsförmågan och resulterar i en bättre signalkvalitet.
- Efter det att den ledande lacken har torkat täcker du lödpunkten med ett 3 mm till 1 mm värmekrympningsrör. Använd försiktigt en urmakarehammare för att platta den bollformade spetsen till hälften av tjockleken.
- Sätt på undersökningshandskar och ta en luddfri rengöringsduk med 100% etanol för att avlägsna smuts och fett.
- Sätt in elektrodernaEtt 15 ml centrifugrör eller cellodlingsrör och fyll det med hushållsklorblekmedel (VARNING, innehållande 2,8 g natriumhypoklorid per 100 g lösningsmedel) tills det kulformade spetsen är helt täckt.
VARNING: Klorblekmedel är frätande; Följ alltid tillverkarens säkerhetsanvisningar. - Ta bort elektroderna efter 23 minuter och spola dem generöst med destillerat vatten. Den framgångsrika appliceringen av ett silverkloridskikt framträder som en homogen lila färgförändring.
- Torka i luften. Efter helt torkad, ta elektroderna med fina pincetter. Med en fin pensel appliceras flytande elektrisk isolering. Starta på tråden direkt bakom elektrodspetsen och täck allt upp till värmekrympröret. Låt isoleringen torka i minst 2 timmar.
- För kvalitetskontroll, utför en kontroll av elektrisk ledningsförmåga med en multimeter. Om det är tillgängligt, utför impedansprovning vid 1 kHz med en lämplig impedansmätare, medan elektroden och testetSonden sammanfogas i en 0,9% NaCl innehållande H2O-lösning utan att röra varandra. Impedansvärdena vid 1 kHz bör vara ca 8 kΩ.
2. Anslut elektroderna till en stereotaxisk hållare
OBS! För att spela in MUA och LFP samtidigt ska du använda volframmikrofilelektroder med en impedans på 1,5 MΩ. Om inspelningens fokus är på högkvalitativa inspelningar av enstaka enheter, välj mikrovågselektroder med högre impedans (> 5 MΩ). Om syftet med studien är enbart riktad mot LFP, kan elektroder med lägre impedanser vara acceptabla. För små strukturer, för vilka dorsoventrala stereotaxa justeringar ofta är nödvändiga, använd par av elektroder med lämplig dorsoventral spetsseparation (i detta fall 250 μm). Dessutom ger detta fördelen med en mer lokal referenselektrod om så behövs. De stereotaxiska koordinaterna mäts alltid från den nedersta elektroden och aRe beräknad med hänvisning till bregma.
- Ta en vanlig stereotaxisk elektrodhållare med ett akrylblock och klämma och lägg det säkert på en plan yta i synnerhet av ett kirurgiskt mikroskop.
- Lossa det första elektrodparet löst i akrylblocket på hållaren med bitar av tejp (3 mm x 8 mm) med fina pincetter. Elektroderna ska utsticka akrylblocket ca. 12 mm.
- Förbered försiktigt den andra bipolära elektroden bredvid den första elektroden. För att rikta in strukturen hos hyperdirektvägen bör avståndet vara 2 mm ( Figur 1 ). För de flesta vanliga stereotaxiska elektrodehållare är detta det intilliggande urtaget. Använd en mätmätare för att verifiera. Olika nätverk kan nås på samma sätt. För detta kan akrylblocket vridas i viss utsträckning.
- Justera det andra elektrodparet genom att glida det försiktigt till en position, där den mest ventrala spetsen är ungefär 200Μm försänkt jämfört med den första elektroden ( Figur 1 ). Gör detta under mikroskopisk syn. För detta, använd en 30 G kanyl (ytterdiameter 300 μm) för att bättre uppskatta avståndet.
- Tryck på tejpen och säkra sedan med hållarens metallklämma.
3. Kirurgi
- För elektrofysiologiska inspelningar, använd uretan (FÖRSIKTIGHET) för anestesi.
Varning: Uretan är giftigt och cancerframkallande. Följ alltid säkerhetsföreskrifterna och databladet från ämnets tillverkare. - Förbered en lösning av 200 mg / ml uretan i 0,9% NaCl medicinsk saltlösning.
- Administrera totalt 1,3 g / kg kroppsvikt uretan intraperitonealt (IP). Beroende på råttstammen kan det vara rimligt att dela upp dosen i två doser med ett 15 min intervall mellan injektionerna för att förbättra narkosens säkerhet.
- Kontrollera bedövningsdjupet med hjälp av pEdal-withdrawal reflex och andra lämpliga reflexer. Om anestesen inte är tillräckligt djup för att utföra operation, injicera 0,15 g / kg kroppsvikt uretan-IP och vänta ytterligare 15 minuter.
- Applicera ögonsalva för att förhindra kornehydrering.
- Ständigt övervaka andningsfrekvensen vid respirationsfrekvensen och pedalen vid narkos. Använd ett litet djur värmepanna med temperaturkontroll för att säkerställa att en fysiologisk kroppstemperatur upprätthålls under hela operationen. Före början av elektrofysiologiska inspelningar, byt till ett icke-elektriskt alternativ ( t.ex. natriumacetathuvuden).
- Rak upp pälsen vid sidan av huvudets dorsala sida för att uppnå ett rent kirurgiskt fält. Desinficera runt snittet med lämpligt kirurgiskt desinfektionsmedel. Fix djuret i den stereotaktiska ramen.
- Gör en 2 cm lång snitt i hårbotten i sagittal riktning med en skalpell. Använd en skalpell för att skrapa av skalleaponeurosen och desinficera skallen. Använd coTton knoppar blöt i 3% H2O2 för att avlägsna eventuell återstående vävnad.
- Använd en elektrocauter eller termocauter för att kontrollera blödning, om det behövs. Stoppa blödningar från skallebenet och hypoderm, om blödningen inte slutar spontant efter 1-2 minuter och hindrar syn på skallen.
- Justera inskärningsstången tills huvudet är placerat i platt skalleposition, vilket betyder att bregma och lambda som stereotaxiska referenspunkter ligger i samma plan. Detta är viktigast för att uppnå hög kirurgisk precision. Använd ett standard stereotaxiskt rotationsjusteringsverktyg, kalibrera det utpekade spetsen till bregma under mikroskopisk syn och justera inskärningsfältet tills de angivna punkterna för bregma och lambda på verktyget berör skaftet samtidigt.
OBS! En vy från ena sidan med fokuserat ljus från det andra kan bidra till att bestämma detta tillstånd. Alternativt, ta en stereotaxisk hållare med en fin kanyl och mät de dorsoventala koordinaterna för Bregma aNd lambda under mikroskopisk syn. Justera inskärningsfältet tills bregma och lambdas dorsoventala koordinater är desamma. - Använd en stereotaxisk hållare med kanyl, kalibrera till bregma och beräkna sedan alla borrhåls position på skallen. Använd stereotaxisk hållare, markera positionerna på de hål som ska borras, antingen genom att försiktigt skrapa på skalle eller genom att använda en kirurgisk färgmarkör. Koordinaterna för detta beror på målen, koordinater med hänvisning till bregmen ges för hyperdirektvägen i tabell 1 , inklusive de föreslagna koordinaterna för cerebellarreferenselektroder.
- Använd en microdrill noggrant, borra alla hål. För STN och SNr borra ett vanligt hål (ca 2 mm x 3 mm i storlek). Alla andra borrhål ska ha en diameter på ca 1 mm.
- Ta två fina kanyler (minst 27 G) och böja sina spetsar för att bilda en krokad form med en hård yta eller pincett. Använd dessa för att ta bort eventuella debriS från borrhålen och skar försiktigt ut och ta bort dura materen i det gemensamma STN / SNr hålet.
- Spola borrhålen med fysiologisk saltlösning. Applicera en droppe fysiologisk saltlösning var 15: e minut till borrhålen för att förhindra att hjärnan och dura torkar ut.
- Ta en mikrodrill och matchande rostfri mikroskruv ( t.ex. en M 1,2 mm x 2 mm skruv), borra ett hål och skruva in en mikroskruv mellan borrhålen i referens-epiduralelektroderna ovanför cerebellum, gör samma för M1 epiduralelektroder.
- Skjut de självbyggda Ag / AgCl epiduralelektroderna i borrhålen för referenselektroderna och M1-elektroderna. Styr elektrodspetsen med fina pincetter och skjut den direkt under skallebenet i borrhålet.
- Fixera alla epiduralelektroder med tvåkomponentdental akryl. Se till att du inte täcker bregma-punkten eller påverkar det gemensamma STN / SNr-hålet.
- Sätt i den förberedda hållaren med volframmikrofilelektrodenEs in i den stereotaxiska ramen.
- Kalibrera den mest ventrala elektroden, som är avsedd att rikta in STN, till bregma. Justera till beräknat läge ovanför det vanliga STN / SNr hålet och sänk ner elektroderna ner i hjärnan under mikroskopisk syn. Se till att volframmikrofilelektroderna går smidigt in i hjärnan.
4. Elektrofysiologisk kartläggning och inspelningar
OBS! För detta steg krävs en Faraday bur och ett flerkanaligt elektrofysiologiskt inspelningssystem med inspelningsprogramvara som kan filtrera online och spik sortera på nätet. Använd helst ett system som arbetar med en förförstärkare placerad nära djurets huvud för att hålla elektrisk ljud och artefakter till ett absolut minimum. Förutom tungstenmikrofilelektroderna är åtminstone en epidural och en referenselektrod nödvändig för att utföra inspelningar av hyperdirektvägen. Det rekommenderas att införa epidural och referencE elektroder parvis utan att de rör varandra, det hjälper till vid funktionsfel och möjliggör olika typer av referenser vid dataanalys.
- Sätt en mobil Faraday bur över stereotaxisk ram. Om endast en stationär Faraday-bur finns tillgänglig, rör försiktigt den stereotaxiska ramen in i Faraday-buret samtidigt som djuphjärnelektroderna inte sänks ner i hjärnan tills den stereotaxiska ramen är i sin slutliga position.
- Anslut elektroderna till huvudet i den elektrofysiologiska inställningen. Se till att referenselektroderna är anslutna till lämpliga referenskanaler.
- Ställ in inspelningsprogrammet: Bandpass-filter (0,05-8,000 Hz) och förstärka (få 1.500-2.000x) den råa datasignalen. Använd ett online LFP- och spikfilter med lämpliga inställningar (bandpassfilter 0,05-250 Hz för LFP, bandpassfilter 300-8000 Hz för MUA). För alla filter, använd ett butterworth-typ filter.
- Ställ in en spets tröskel, om tillämpligt, för onlinE spik sortering. De flesta inspelningssoftware möjliggör uppställning av en spetsgräns, vilket är ett amplitudvärde över vilket en signal markeras som en spik av mjukvaran. Detta tröskelvärde kan antingen bestämmas matematiskt som en faktor eller standardavvikelse för den genomsnittliga amplituden hos den filtrerade spiktsignalen eller kan företrädesvis bestämas genom visuell inspektion av datasegmenten <500 ms och inställas som en linje ovanför signalbruset i en grafisk användargränssnitt.
OBS! Avsikten med att ställa in en spikttröskel är att räkna på spikar och sortera enheter för att ge information om hur många neuroner som för närvarande registreras och hur deras spikar är formade. - Långsamt sänka volframmikrofilelektroderna till 1 mm dorsalt av målet, vilket är STN för hyperdirektvägen. Vänta på att signalen stabiliserar om det behövs.
- För elektrofysiologisk kartläggning, förflytta elektroderna ventralt i steg om 100 μm. Vid varje steg, utvärdera skjutmönstret, skjuta rÅt och form av spikar. Jämför dem med de typiska exemplen som ges i figur 2 . Vanligen uppvisar täta kärnor snabb och kontinuerlig spikning över flera dorsoventriska steg, medan fiberrika strukturer uppvisar låga bränningshastigheter och mindre homogen spikaktivitet i efterföljande ventrala steg.
- För hyperdirektvägen, se till att den mest ventrala elektroden är inne i STN.
OBS: STN nås när en avsevärd ökning av MUA detekteras ventral av Zona incerta. Ventral till STN, spiking stoppar nästan helt eftersom elektroden har nått den inre kapseln. När den mest ventrala elektroden är i STN, säkerställer konfigurationen av volframmikroelektroderna den bakre, andra elektroden är i SNr. Dorsoventral finjustering i små steg kan behövas för att registrera typiska MUA i STN och SNr samtidigt. Observera att frekvensen av MUA beror på antalet neuroner som faktiskt spelats in och på nivån på hjärnanaktivering. - När elektroderna befinner sig i de önskade strukturerna, ställ in onlinefiltrering och spikssortering (se Figur 4 ) och starta sedan inspelningen av data. Typiska exempel på de olika kortikala synkroniseringsstegen som kan identifieras i LFP-inspelningarna visas i Figur 3 .
5. Slut på experimentet
- När inspelningar är färdiga höjs elektroderna långsamt ur hjärnan och spola dem med fysiologisk saltlösning omedelbart. Elektroderna kan återanvändas efter grundlig spolning och visuell inspektion. Utmatningsböjelektroder.
- Euthanize djuren genom en IP-injektion av en överdos av uretan (2,5 g / kg kroppsvikt).
OBS: Uretan bör endast användas för slutförfaranden. - Om histologisk kontroll av elektrodpositionen eller andra histologiska färgprocedurer krävs, ta bort hjärnan från skallen och bearbetaVävnad lämpligt.
OBS: Beroende på avsedda färgningsmetoder kan transkardiell perfusion vara nödvändig. För post mortem verifiering av elektrodpositionen är en standard Nissl-färgning tillräcklig i de flesta fall för att visualisera elektrodbanan i t.ex. koronala hjärnavsnitt. Ytterligare tillvägagångssätt för att underlätta histologisk målverifiering inkluderar användningen av elektriskt inducerade lesioner i hjärnvävnaden genom applicering av elektrisk ström via inspelningselektroderna eller applicering av biokompatibelt färgämne före elektrodinsättning 16 , 17 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med de här använda inspelningselektroderna är det möjligt att prova LFP från primära motorcortexen, subthalamuskärnan och substantia nigra pars reticulata och MUA från STN och SNr. Initialt spelas LFP och multi-unit aktivitet tillsammans i en bredbandssignal. Därefter separeras LFP och MUA med bandpassfilter (0,05-250 Hz för LFP och 300-4000 Hz för MUA).
För korrekt riktning av subkortiska kärnor, särskilt små strukturer som STN, är det fördelaktigt att anpassa de planerade stereotaxiska koordinaterna med online-inspelad MUA-signal. För att elektrodbanan kan riktas upp, kan det STN-karakteristiska MUA-mönstret registreras ( Figur 2 ) 9 , 20 .
För senare steg i analysen är detOfta obligatoriskt att definiera enskilda enheter från multi-enhet aktivitet genom principiell komponentanalys ( Figur 4 ).
I LFP-inspelningarna från M1 kan två spontantväxlande kortikala synkroniseringslägen identifieras: Aktiverat tillstånd (AS) och status för långsam vågaktivitet (SWA) ( Figur 3 ) 18 , 19 . Medan SWA-tillståndet domineras av långsamma oscillationer med hög amplitud på omkring 1 Hz kännetecknas AS av snabbare oscillationer med en lägre amplitud ( Figur 3 ).
Figur 1: Uppställning av djupbroms mikrovågs elektroder i en standard stereotaxisk hållare. Notera spetsen separering mellan A, elektrodparet förSTN och B, elektrodparet för SNr i dorsoventral riktning på ca. 200 μm och anterioposterior riktning ca. 2 mm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Karaktäristisk Multi-enhet Aktivitet från en Dorsoventral Elektrode Trajectory Targeting STN. ( A ) Multi-enhet inspelningar av den ventrala posteromediala thalaminkärnan (VPM), zona incerta (ZI), subthalamuskärnan (STN) och substantia nigra pars reticularis (SNr). VPM uppvisar glesa och oregelbundna åtskilda höga amplitudspikar. Detta mönster av spikes upphör när man närmar sig ZI. När elektroden går in i STN ett typiskt högfrekvent skjutmönster med korta sprängor med mediumförstärkningUde kan observeras. SNr kan identifieras med dess höga amplitud och regelbundna skjutmönster. ( B) STN-banor överlagd på bilder från en rått stereotaktisk atlas 21 . Övre delen: Koronplanet. Nedre delen: sagittalplanet. Observera att elektrodspetsen passerar genom VPM och ZI. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3. Kortikala synkroniseringsstater i LFP-inspelningar från primär motorcortex under uretananestesi. ( A ) Representativ 600 s LFP-inspelning av primärmotorcortexen. Tidsperioder med högfrekvens, låg amplitudaktivitet motsvarande den aktiverade staten (i) och tidsperioder med en långsammare rytm och hög En amplitud som motsvarar det långsamma vågaktivitetstillståndet (ii) kan differentieras. ( B ) Motsvarande tidfrekvensdiagram över ett intervall på 600 s som illustrerar 0-20 Hz relativ effekt hos de LFP som presenteras i (A). Varmare färgämnen indikerar högre relativ effekt. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Sortering av enskilda enheter från STN Multi-Unit Activity. ( A ) Tredimensionell vy av enhetsklyftor i funktionsutrymme efter huvudkomponentanalys. Varje kluster representerar en förmodad enstaka enhet. ( B ) Spikvågformer och spikvågformmedelvärden motsvarande kluster i (A).0fig4large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
| Koordinater från Bregma | STN | SNr | M1 | Referens 1 | Referens 2 |
| främre-bakre | -3,6 | -4,8 | 3,0 | -10,0 | -10,0 |
| medial-laterala | 2,5 | 2,5 | 3,0 | 3,0 | -3,0 |
| dorsal-ventrala | -8,0 | na | na | na | na |
Tabell 1: Stereotaxiska koordinater för inspelning av Hyperdirect CoRtico-basal ganglia vägen. Alla punkter mäts från bregma-referenspunkten på skallen i mm; Na- ej tillämplig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den aktuella studien demonstreras metoden hur man registrerar extracellulära elektrofysiologiska signaler samtidigt från flera ställen i ett visst nätverk med hjälp av exemplet på hyperdirect cortico-basal ganglia-vägen som förbinder M1 med STN och SNr hos gnagare.
Ett kritiskt steg i inspelningen av små subkortiska strukturer såsom STN är den exakt styrda införandet av inspelningselektroderna in i målet. I den presenterade metoden säkerställs att två viktiga steg säkerställer en hög noggrannhet i riktningen. När djuret förbereds i den stereotaktiska apparaten innan elektroderna införs i hjärnan är det absolut obligatoriskt att se till att skallen bringas in i läget "platt skalle" 22 . För att uppnå den platta skallepositionen ändras positionen hos den stereotaktiska ramens framkallningsstång tills höjden av bregma- och lambda-referenspunkternaN skallen ligger vid samma dorsoventralplan 21 . Endast genom att säkerställa denna position kan koordinater som finns i stereotaktiska atlaser appliceras med hög precisionsnivå till det individuella laboratoriedjuret, eftersom atlaserna är baserade på den platta skallepositionen 21 . Experimentella bevis visar också att målningsnoggrannheten med användning av en individualiserad platt skalleposition är överlägsen en fast justering av skärstången 23 . Placeringen av inspelningselektroderna i dorsoventralplanet bör finjusteras genom ständigt registrering av flera enheter. De olika kärnor och vita materialstrukturerna längs elektrodbanan visar karakteristiska brandmönster ( Figur 2 ), som kan användas för att justera elektrodens 9 , 20 position.
Ett annat viktigt steg i den presenterade metoden är placeringen av rEferenselektrod. I det presenterade protokollet valdes en position ovanför den cerebellära cortexen, eftersom referenselektroden vid denna tidpunkt inte detekterar den kortikobasala gangliaaktiviteten som var den centrala punkten för studien. I studier med intresse för analysmetoder som är mottagliga för volymledning får en mer lokal referens gynnas 5 .
Uretan är en allmänt använd narkos för registrering av neuronala extracellulära potentialer i djurforskning 11 , 18 , 24 , 25 , 26 . Anledningen till detta är att en enstaka dos av uretan kan ge en stabil och långvarig narkos under 8-12 h med endast en begränsad depression av centrala nervsystemet aktiviteten jämfört med andra bedövningsmedel 27 . Men uretanesthesiA aktiverar också det sympatiska nervsystemet, vilket kan leda till oönskade biverkningar som t ex hyperglykemi 27 . På grund av sin långvariga verkan och avsaknaden av ett starkt läkemedel för att motverka dess anestetiska effekt, bör uretan inte användas för upprepade försök som separeras av timmar eller dagar. Om det är planerat att göra flera inspelningar på samma djur eller om det finns en teknisk anledning att inte använda uretan, kan gasbedövning med isofluran och injektioner av läkemedel, såsom ketamin och xylazin, vara rimliga alternativ för elektrofysiologiska in vivo- experiment 28 , 29 . Nackdelen med dessa narkosregler är att de kräver mer frekvent övervakning och justeringar än användningen av uretan på grund av deras korta halveringstid och ackumuleringen av drogerna över tiden. Vidare finns det bevis för att uretan kan störa mindre med fysiologiska b Regnaktivitet än andra bedövningsmedel 30 .
Alla de här detaljerade inspelningsvillkoren bestämmer kritiskt hur de erhållna data kan bearbetas vidare och analyseras offline, därför är det obligatoriskt att justera alla inställningar till kraven i de planerade analysstegen. Eftersom det finns många alternativ för analys av flerkanaliga extracellulära inspelningar, kan användningen av tillgängliga verktygslåda med öppen källkod vara fördelaktig 31 .
Registreringen av extracellulära potentialer in vivo är en metod som erbjuder en unik tidsmässig och rumslig upplösning av hjärnsignaler som överstiger alternativa metoder, såsom funktionell magnetisk resonansbildning och kalciumbildning 5 . Den presenterade metoden kan inte bara tillämpas på inspelningen av hyperdirektvägen utan kan enkelt anpassas till en rad andra experimentella modeller och forskningsfrågorF "> 24 , 32 , 33. Men eftersom det innefattar stereotaktisk kirurgi finns det många forskningsinställningar där det inte kan tillämpas och där en icke-invasiv metod bör väljas.
I framtiden bör en kombination av den presenterade extracellulära multi-site inspelningstekniken med optogenetiska verktyg förverkligas för att ytterligare förstärka vår förståelse för nätverksdysfunktionen som ligger till grund för olika neuropsykiatriska sjukdomar för att hitta nya behandlingar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), KFO 247, för att finansiera vår studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ag/AgCl custom epidural electrodes | Goodfellow GmbH D-61213 Bad Nauheim, Germany info@goodfellow.com |
Product-ID AG005127 for 99.99% silver wire | Ag/AgCl electrodes will allow for better signal quality, but may only be used in acute experiments. Possible replacement: Stainless steel electrodes |
| Stereotaxic holder with acrylic block | David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA |
Product ID Model 1770 Standard Electrode Holder | Make sure the acrylic block has recesses which suit the electrode setup for the desired target. Acrylic blocks can easily be modified with a file to obtain the desired configuration. Possible replacement: Self-constructed electrode holders |
| Tungsten microwire electrodes 1.5 MΩ impedance | Microprobes.com 18247-D Flower Hill Way Gaithersburg, Maryland, 20879 USA |
Product-ID WE3ST31.5A5-250um | The 1.5 MΩ is necessary to record MUA and LFP at the same time. Possible replacement: Microelectrodes of different materials can be used. The electrodes have to be straight, robust and as thin as possible. |
| Rat alignment tool | David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA |
Product ID Model 944 Rat Alignment Tool | Allows the exact orientation of the brain to match stereotaxic atlases. Possible replacement: Stereotaxic holder with a cannula |
| Two-component dental acrylic | Associated Dental Products Ltd. Kemdent Works, Purton, Swindon Wiltshire, SN5 4HT, United Kingdom |
Simplex Rapid Powder Clear 225g, Product code: ACR803; Simplex Rapid Liquid 150ml, Product code: ACR920 | Depending in the electrodes used, superglue might be an easy alternative, if the electrodes are small and lightweight. Possible replacement: Superglue (Cyanacrylate-based) |
| Faraday cage | Self-construction | A proper Faraday cage will be the best protection from electromagnetic artifacts, but everything which can be formed into a box shape or applied to a frame and is made of conductive material may help. Possible replacement: Aluminum foil or copper mesh | |
| Electrophysiological setup with recording software and online spike-sorting capabilities | OmniPlex® Neural Data Acquisition System Plexon Inc 6500 Greenville Avenue, Suite 700 Dallas, Texas 75206 USA |
Offline sorting software is a potential alternative, multiple scripts and softwares can be found for free in the open source community. |
References
- Lozano, A. M., Lipsman, N. Probing and regulating dysfunctional circuits using deep brain stimulation. Neuron. 77 (3), 406-424 (2013).
- Mathalon, D. H., Sohal, V. S. Neural Oscillations and Synchrony in Brain Dysfunction and Neuropsychiatric Disorders: It's About Time. JAMA Psychiatry. 72 (8), 840-844 (2015).
- Uhlhaas, P. J., Singer, W. Neuronal dynamics and neuropsychiatric disorders: toward a translational paradigm for dysfunctional large-scale networks. Neuron. 75 (6), 963-980 (2012).
- Buzsaki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).
- Buzsaki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
- Brazhnik, E., Novikov, N., McCoy, A. J., Cruz, A. V., Walters, J. R. Functional correlates of exaggerated oscillatory activity in basal ganglia output in hemiparkinsonian rats. Exp Neurol. 261, 563-577 (2014).
- Avila, I., et al. Beta frequency synchronization in basal ganglia output during rest and walk in a hemiparkinsonian rat. Exp Neurol. 221 (2), 307-319 (2010).
- Javor-Duray, B. N., et al. Early-onset cortico-cortical synchronization in the hemiparkinsonian rat model. J Neurophysiol. 113 (3), 925-936 (2015).
- Beck, M. H., et al. Short- and long-term dopamine depletion causes enhanced beta oscillations in the cortico-basal ganglia loop of parkinsonian rats. Exp Neurol. 286, 124-136 (2016).
- Magill, P. J., Bolam, J. P., Bevan, M. D. Relationship of activity in the subthalamic nucleus-globus pallidus network to cortical electroencephalogram. J Neurosci. 20 (2), 820-833 (2000).
- Magill, P. J., et al. Changes in functional connectivity within the rat striatopallidal axis during global brain activation in vivo. J Neurosci. 26 (23), 6318-6329 (2006).
- Brown, P. Abnormal oscillatory synchronisation in the motor system leads to impaired movement. Curr Opin Neurobiol. 17 (6), 656-664 (2007).
- Stein, E., Bar-Gad, I. beta oscillations in the cortico-basal ganglia loop during parkinsonism. Exp Neurol. 245, 52-59 (2013).
- Little, S., Brown, P. What brain signals are suitable for feedback control of deep brain stimulation in Parkinson's disease? Ann N Y Acad Sci. 1265, 9-24 (2012).
- Priori, A., Foffani, G., Rossi, L., Marceglia, S. Adaptive deep brain stimulation (aDBS) controlled by local field potential oscillations. Exp Neurol. , 77-86 (2013).
- Brozoski, T. J., Caspary, D. M., Bauer, C. A. Marking multi-channel silicon-substrate electrode recording sites using radiofrequency lesions. J Neurosci Methods. 150 (2), 185-191 (2006).
- Schjetnan, A. G., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. (56), (2011).
- Mallet, N., et al. Disrupted dopamine transmission and the emergence of exaggerated beta oscillations in subthalamic nucleus and cerebral cortex. J Neurosci. 28 (18), 4795-4806 (2008).
- Steriade, M. Corticothalamic resonance, states of vigilance and mentation. Neuroscience. 101 (2), 243-276 (2000).
- Maesawa, S., et al. Long-term stimulation of the subthalamic nucleus in hemiparkinsonian rats: neuroprotection of dopaminergic neurons. J Neurosurg. 100 (4), 679-687 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1998).
- Oliveira, L. M. O., Dimitrov, D. Methods for Neural Ensemble Recordings Frontiers in Neuroscience. Nicolelis, M. A. L. , (2008).
- Torres, E. M., et al. Increased efficacy of the 6-hydroxydopamine lesion of the median forebrain bundle in small rats, by modification of the stereotaxic coordinates. J Neurosci Methods. 200 (1), 29-35 (2011).
- Hadar, R., et al. Rats overexpressing the dopamine transporter display behavioral and neurobiological abnormalities with relevance to repetitive disorders. Sci Rep. 6, 39145 (2016).
- Parr-Brownlie, L. C., Poloskey, S. L., Bergstrom, D. A., Walters, J. R. Parafascicular thalamic nucleus activity in a rat model of Parkinson's disease. Exp Neurol. 217 (2), 269-281 (2009).
- Steriade, M., Nunez, A., Amzica, F. A novel slow (< 1 Hz) oscillation of neocortical neurons in vivo: depolarizing and hyperpolarizing components. J Neurosci. 13 (8), 3252-3265 (1993).
- Maggi, C. A., Meli, A. Suitability of urethane anesthesia for physiopharmacological investigations in various systems. Part 1: General considerations. Experientia. 42 (2), 109-114 (1986).
- Goldberg, J. A., Kats, S. S., Jaeger, D. Globus pallidus discharge is coincident with striatal activity during global slow wave activity in the rat. J Neurosci. 23 (31), 10058-10063 (2003).
- Karain, B., Xu, D., Bellone, J. A., Hartman, R. E., Shi, W. X. Rat globus pallidus neurons: functional classification and effects of dopamine depletion. Synapse. 69 (1), 41-51 (2015).
- Paasonen, J., et al. Comparison of seven different anesthesia protocols for nicotine pharmacologic magnetic resonance imaging in rat. Eur Neuropsychopharmacol. 26 (3), 518-531 (2016).
- Mahmud, M., Vassanelli, S. Processing and Analysis of Multichannel Extracellular Neuronal Signals: State-of-the-Art and Challenges. Front Neurosci. 10, 248 (2016).
- Hadar, R., et al. Altered neural oscillations and elevated dopamine levels in the reward pathway during alcohol relapse. Behav Brain Res. 316, 131-135 (2017).
- Voget, M., et al. Altered local field potential activity and serotonergic neurotransmission are further characteristics of the Flinders sensitive line rat model of depression. Behav Brain Res. 291, 299-305 (2015).
