선충 집단에 기반한 화학 감응도 선호 분석의 자동화 된 분석

Summary

우리는 인구 기반 분석에서 가용성 화합물에 대한 선충류 인 Caenorhabditis elegans 의 선호도를 자동 분석 할 수있는 행동 기록 설정 및 프로토콜을 제시합니다. 이 기사에서는 비헤이비어 챔버의 구성, 동작 분석 프로토콜 및 비디오 분석 소프트웨어 사용에 대해 설명합니다.

Abstract

선충류 인 Caenorhabditis elegans 의 단지 302 개의 뉴런으로 이루어진 소형 신경계는 다양한 행동 레퍼토리의 기초가됩니다. 이러한 행동의 근간을 이루는 신경 회로의 해부를 촉진하기 위해 강건하고 재현 가능한 행동 분석법의 개발이 필요합니다. 이전의 C. 엘레 간스 행동 연구는 가용성 화합물에 대한 C. 엘레 간스 의 반응을 조사하기 위해 "낙하 시험", "화학 주성 분석"및 "보유 분석"의 변형을 사용했습니다. 이 글에서 설명한 방법은 앞서 언급 한 세 가지 분석법의 보완적인 장점을 결합하고자합니다. 간단히 말해, 각 검정 플레이트의 중간에있는 작은 원은 컨트롤과 실험 솔루션이 번갈아 배치 된 4 개의 사분면으로 나뉩니다. 웜이 추가 된 후, 분석 플레이트는 동작 챔버로로드되어 현미경 카메라가 처리 된 영역과 웜의 만남을 기록합니다. 그런 다음 자동화 된 비디오 분석이 수행됩니다.각 비디오에 대한 선호 지수 (PI) 값이 생성된다. 이 방법의 비디오 수집 및 자동 분석 기능은 실험자의 개입 및 관련 오류를 최소화합니다. 또한, 실험 화합물의 소량은 분석 당 사용되며 행동 챔버의 멀티 카메라 설정은 실험 처리량을 증가시킵니다. 이 방법은 유전 적 돌연변이와 새로운 화합물의 행동 스크린을 수행하는 데 특히 유용합니다. 그러나,이 방법은 대조구와 실험 용액 영역의 근접성으로 인해 자극 구배 탐색을 연구하기에 적합하지 않습니다. 소규모의 웜 집단 만 사용할 수있는 경우에도 사용해서는 안됩니다. 현재 형태의 가용성 화합물에 대해서만 반응을 분석하는 데는 적합하지만,이 방법은 multimodal 감각 상호 작용 및 optogenetic 연구에 적합하도록 쉽게 수정할 수 있습니다. 이 방법은 또한 다른 선충류의 화학 감응 반응을 분석하기 위해 적용될 수있다.

Introduction

먹이를 찾는 동물은 여러 감각 양식의 입력을 통합하고 환경을 성공적으로 탐색하기 위해 적절한 행동 전략을 선택해야합니다. 외부 감각 입력이 어떻게 받아 들여지고 행동 선택을 유도하기 위해 신경 정보로 변환되는지를 이해하는 것은 신경 생물학 분야의 핵심 목표입니다. 유 전적으로 다루기 쉬운 선충류 인 C. elegans 는 감각 생물학 및 다중 모달 통합에 바탕을 둔 신경 메커니즘을 연구하는 매력적인 모델 유기체입니다. C. 엘레 간 스는 302 개의 뉴런 만 가지고 있지만 용해성 화합물, 휘발성 냄새 물질 및 주위 온도 ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7을} 비롯한 다양한 환경 적 자극을 감지하고 구별 할 수 있습니다. 그만큼선충 류 C. elegans는 식량 원천을 현지화하고 잠재적 인 위협에 스스로를 경고하기 위해 화학 감각기구에 크게 의존합니다. 따라서 C. elegans 의 놀라운 감각 기능을 뒷받침하는 유전 적, 세포 적 및 신경 학적 메커니즘을 분석하는 데 야생형 및 돌연변이 C. elegans의 화학 자극에 대한 반응을 스크리닝하도록 설계된 행동 분석이 중요한 역할을합니다.

가용성 화합물에 대한 반응을 분석하기 위해 세 가지 유형의 분석법, 즉 낙하 시험, 화학 주성 분석 및 보유 분석이 설명되었습니다. 낙하 시험에서 화합물의 작은 방울이 움직이는 벌레의 꼬리에 놓이고 액체가 전방 감각기구에 도달하면 앞뒤로 움직이거나 앞으로 움직이려는 웜의 결정은 ^{4 점} 입니다. 낙하 테스트는 실험 준비가 거의 필요하지 않으며 레이저로 작동되는 웜의 경우처럼 웜의 샘플 크기가 작은 경우 유용합니다. 그러나 하나의 웜으로 만한 번에 분석 할 수 있으며 실험자가 분석 기간 동안 존재해야하며, 낙하 시험은 시간이 오래 걸릴 수 있습니다. 드롭 테스트는 샘플 내의 각 웜 간의 드롭 전달의 변화에 ​​취약하기 때문에 분석의 전체 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 낙하 테스트의 또 다른 한계는 벌레의 전방 운동으로부터의 화합물의 매력적 또는 중립적 인 효과를 구분할 수 없으므로 혐오 성 화합물에 대한 웜의 반응을 분석하는 데에만 사용될 수 있다는 것입니다.

수용성 화합물의 화성 분석은 일반적으로 두 개의 대향하는 사분면 한천 및 다른 두 사분면 ^8,9 혼입 대조액 혼입 실험 용액을 네 개의 사분면으로 한천 플레이트를 분할하는 것을 포함한다. 분석의 시작에서 웜을 포함하는 방울의 방울을 플레이트의 중앙에 놓고 웜의 수를 각 사분면은 다른 시점에서 채점됩니다. chemotaxis assay는 각 분석에서 많은 수의 웜이 테스트되기 때문에 낙하 테스트에 비해 더 큰 통계력을 제공합니다. 그러나,이 방법의 하나의 한계는 주 화성 검정 플레이트의 제조가 다량의 실험 화합물을 필요로한다는 것이다. 이것은 ascaroside signaling molecule ¹⁰ 의 경우와 같이, 제한된 수율로 복잡한 정제 과정이 필요한 화합물을 얻기 위해 대규모 행동 스크린을 수행하는 것을 어렵게 만듭니다. 또한 분석을 통한 웜의 수동 계산은 오류의 영향을 받기 쉽고 계산 과정에서 판의 섭동이 결과에 영향을 줄 수 있습니다.

앞에서 언급 한 두 가지 방법과 달리 보관 분석은 점수 계산 과정에서 오류를 최소화하고 분석 중에 실험자의 간섭을 줄이는 머신 비전을 사용합니다 > 11. 웜 동작의 비디오 레코딩에 대한 전산화 된 분석은 득점이 몇 개의 개별 시간 지점에서만 수행 될 때 놓칠 수있는 미묘한 행동 동학을 잠재적으로 나타낼 수 있습니다. 보유 분석에서 두 개의 용액 반점이 작은 원형 세균성 식품 패치의 반대편에 추가되고 그 다음에 식품 패치 중간에 적은 수의 웜이 배치됩니다. 웜의 행동은 비디오 녹화, 분석 및 선호 지수 값은 각 솔루션 영역의 총 웜 픽셀 수를 기반으로 계산됩니다. 매력적인 식품 패치의 존재가 각 분석에서 웜의 작은 개체군을 사용할 수는 있지만, 음식은 이전에 용해 방지제 ^{12에 대한} 회피 거동을 민감하게하는 것으로 나타났습니다. 또한, 웜은 단파장 빛에 대한 광 반응성 반응을 나타내며 동작 기록 설정에서 백색광을 방출하는 현미경 광원의 사용은 동작에 영향을 줄 수 있습니다s = "xref"> 13.

이 논문에서 논의 된 방법의 목적은 population-based assay를 사용하여 C. elegans의 가용성 화합물 선호도를 기록하고 분석하는 것이다. 이를 위해 현재의 방법은 이전에 논의 된 세 가지 방법 모두를 통합하고 개선합니다. 그것은 웜의 큰 개체군을 검사 할 수있게하며 각 분석에서 사용되는 실험 용액의 양은 단지 소량입니다. 또한이 분석은 적외선 LED 백라이트가있는 맞춤형 밀폐 된 동작 챔버 내에서 수행되어 짧은 파장의 빛이 동작에 미치는 영향을 최소화합니다. 각 챔버에는 벤치 공간을 손상시키지 않으면 서 실험 처리량을 증가시키는 여러 대의 현미경 카메라가 장착 될 수 있습니다. 마지막으로, 비디오 분석 소프트웨어는 각 비디오에 대한 선호 지수 값뿐만 아니라 시간 경과에 따른 인구 행동 역학을 시각화하기위한 웜 점유도 플롯을 출력합니다. 챔버 설정과ssay 프로토콜은 악취 물질 또는 온도가 화학 감각적 인 행동에 미치는 영향과 같은 다중 모달 행동 반응을 연구하도록 추가로 수정할 수 있습니다.

이 문서에서는 행동 챔버 및 분석 프로토콜의 구성에 대해 설명합니다. 또한 알려진 수용성 방수제 야생 형 웜 및 화학 감각 결함이있는 돌연변이, 구리 이온 ^4의 반응을 분석하는이 방법의 유용성을 보여줍니다. 마지막으로 제공된 소프트웨어를 사용한 비디오 분석 프로세스가 자세히 설명됩니다.

Protocol

1. 행동 회의소 회의

참고 : 비헤이비어 챔버는 투명 알루미늄 바닥과 카메라 지지대가있는 불투명 한 패브릭 커버로 덮인 압출 알루미늄 막대로 만든 대략 큐브 모양의 프레임으로 구성됩니다. 행동 챔버를 형성하는 압출 된 알루미늄 막대 사이의 접합부는 모두 수직이며 나사를 사용하여 각 막대에 하나의 모서리 브래킷 다리를 고정하고 슬라이드 인 ( "1"다리가있는 1 인치 너비) "L"모양의 모서리 브래킷을 사용하여 고정됩니다 T - 너트. 각 조인트는 아래 설명 된대로 하나 또는 두 개의 코너 브래킷으로 고정됩니다. 챔버 위의 패브릭 커버는 동일한 스크류와 슬라이드 인 T 너트로 알루미늄 프레임 바에 부착되지만 천의 구석에있는 그로밋을 통해 부착됩니다. 나사는 튀어 나온 립이있는면이 아닌 슬라이드 - 인 T - 너트의 접시쪽에 제대로 삽입됩니다. 나사 / T 너트 패스너 어셈블리를 알루미늄 바에 부착 할 때, T 너트를 채널 안으로 밀어 넣으십시오바의 적절한면에있는 나사의 머리 부분이 슬롯에서 튀어 나오게하십시오.

1. 직물 덮개를 준비하십시오.
   1. 가위를 사용하여 불투명 한 폴리 에스터 원단 5 개를 절단하여 챔버의 상단과 측면을 덮습니다.
      1. 챔버 상단에 14 x 14 inch ² 장의 원단을 자릅니다. 챔버의 측면에 대해 4 개의 직사각형 11 x 14 인치 ² 장을 잘라냅니다.
   2. 직물 시트의 모서리에 그로밋을 설치하십시오.
      1. 연필과 직선자를 사용하여 5 개의 모든 폴리 에스테르 직물 시트의 각 모서리에서 0.5 인치의 참조 선을 표시하십시오.
      2. 네 개의 직사각형 시트의 경우 그로밋 펜치를 사용하여 각 모서리에서 연필 선이 교차하는 중심에 그로밋을 삽입합니다 (즉, 시트 당 4 개의 그로밋).
      3. 정사각형 시트의 경우 각 가장자리를 따라 2 개의 그로밋을 삽입하고 각 그로밋은 연필 줄 중앙에 위치시키고 각 끝은 1.5 인치네 개의 연필 줄 (즉, 총 8 개의 그로밋, 각 모서리 근처에 2 개).
   3. 각 그로밋 구멍에 나사를 삽입하고 느슨하게 각각에 T 너트를 부착하십시오.
2. 카메라 마운트 바 제작.
   1. 밴드 톱 또는 동등 물을 사용하여 각각의 카메라에 대해 2 인치 길이의 알루미늄 압출 막대 한 개를 자르고 막대의 절단 끝이 막대 조립품과 수직이되도록하여 나중에 조립할 수 있습니다.
   2. 0.25 인치 직경의 드릴 비트가있는 드릴 프레스를 사용하여 각 카메라 장착 바의 가운데 웹을 통해 구멍을 뚫습니다.이 구멍의 한 쪽 끝은 0.75 인치로, 구멍은 상단 및 하단면에 수직이되고 막대의 중심선을 통과합니다 . 필요에 따라 0.25 인치 드릴 비트가있는 핸드 헬드 전기 드릴을 사용하여 구멍을 드릴링하지만 구멍이 바의 상단 및 하단면에 수직이되도록하십시오.
3. 모든 모서리 괄호를 준비하십시오.
   1. 구멍을 통해 나사를 삽입하십시오.각 코너 브래킷 다리, 안쪽 각도 측면에서 나사를 삽입. 각 나사에 T 너트를 느슨하게 끼 웁니다.
4. 카메라 마운트 어셈블리를 준비합니다 ( 그림 1B , 레이어 2).
   참고 : 카메라 마운트 어셈블리는 세 개의 카메라 홀스터를 지원하는 "H"모양의 어셈블리입니다.
   1. 카메라 마운트 막대의 중앙 막대에 카메라 마운트 막대를 부착하십시오.
      1. 1.2 단계에서 제작 한 세 개의 카메라 마운트 막대를 수직으로 구멍이 뚫린 구멍으로 배치합니다. 천공 된 구멍에서 가장 먼 끝에있는 각 마운트 막대의 측면에 두 모서리 브래킷을 밀어 넣습니다.
      2. 브래킷의 다리를 바 끝과 같은 높이로 모서리 브래킷을 놓고 나사를 조여 제자리에 고정시킵니다. 이것은 "T"의 바닥에 구멍을 뚫은 "T"자 형태입니다.
      3. 작업대 표면에 1 피트 알루미늄 압출재를 놓습니다. 하나의 카메라 마운트 바에있는 T- 너트를 밀어 넣습니다.mbly (이전 단계에서)를 1 피트 막대의 한쪽면으로 이동합니다. 마운트 바를 1 피트 바의 중심에 맞추고 나사를 조여 제자리에 고정시킵니다. 다른 두 개의 마운트 막대를 1 피트 막대의 반대쪽으로 밀어 넣으십시오.
      4. 내부 모서리 브래킷을 약 2.5 인치 간격으로 두 개의 막대를 1 피트 막대의 중간에서 등 간격으로 배치하십시오. 1 피트 바의 양쪽에 모서리 브래킷을 끼 웁니다. 바 양쪽 끝에 각각 2 개씩 있습니다. 브래킷의 다리가 바 끝과 같은 높이가되도록 모서리 브래킷을 배치하고 나사를 조여 제자리에 고정하십시오.
   2. 엔드 바를 중앙 바에 부착하십시오.
      1. 이전 단계에서 어셈블리의 각 끝에있는 T 너트에 2 피트의 알루미늄 돌출부를 "H"자 모양으로 밀어 넣습니다. 중앙 막대의 각 끝 막대를 가운데에 놓고 네 개의 나사를 조여 고정하십시오.
      2. 이전 단계에서 추가 한 두 개의 끝 막대 상단에 네 모퉁이 브래킷을 각 끝 부분에 하나씩 밀어 넣습니다.각 막대의 브래킷의 다리를 막대 끝에 맞추고 모서리 브래킷을 배치하고 나사를 조여 제자리에 고정시킵니다.
   3. 카메라 스탠드와 홀스터를 카메라 장착 어셈블리에 부착하십시오.
      1. 3 개의 현미경 카메라 스탠드 각각에 대해 손잡이 나사를 느슨하게하고 스탠드 막대에서 밀어서 카메라 홀스터를 제거합니다.
      2. 각 카메라 장착 막대 (이제 "H"의 중앙 막대에 고정)에 대해 둥근 머리 나사에 와셔 한 개를 놓고 나사를 카메라 장착 막대의 드릴 구멍으로 밀어 넣고 나사 위에 다른 와셔를 내려 놓으십시오 . 카메라 스탠드 막대의 나사 구멍을 나사에 끼 우고 카메라 장착 바에 단단히 조입니다.
      3. 다른 두 개의 카메라 마운트 막대에 대해서도 14.3.2 단계를 반복하십시오.
      4. 카메라 장착 막대와 나사를 향한 넓은 구멍이있는 각 카메라 스탠드로드에 카메라 홀스터를 밀어 넣습니다. 홀스터를 카메라 받침대에 임시 고정홀스터의 나비 나사로 조이십시오.
         참고 : 최종 작동 위치는 2 절에서 설정됩니다.
5. 행동 챔버 프레임을 조립하십시오 ( 그림 1A ).
   참고 : 쉽게 제작할 수 있도록 작업 표면 ( 그림 1B , 레이어 1)에서 챔버 프레임의 "상단"부터 프레임을 뒤집어 조립하고 프레임의 "발"쪽으로 위쪽으로 작업하십시오 ( 그림 1B , 레이어 삼).
   1. 비헤이비어 챔버의 상단 레이어를 조립하려면 사각 폴리 에스테르 시트 ( 그림 1B , 레이어 1)에 4 개의 1 피트 돌출 알루미늄 막대를 부착하십시오.
      1. 한 바를 천의 각 모서리를 따라 두 개의 T 너트에 밀어 넣고 바를 천의 중심에 맞 춥니 다. 패스너를 조여 패브릭 시트를 각 막대에 고정하십시오.
      2. 사각 폴리 에스테르 시트를 작업면에 펼치십시오.상단에 4 개의 부착 된 알루미늄 바. 8 개의 모서리 브래킷을 4 개의 알루미늄 막대의 상단 표면으로 밀어 넣습니다 (각 막대의 각 끝에 하나씩). 브래킷의 수직 다리가 막대의 끝과 같은 높이가되도록 막대에 모서리 브래킷을 배치하십시오. 나사를 T 너트에 조여 고정하십시오.
   2. 각 구석에서 1 피트 알루미늄 압출재를 똑바로 세워 2 개의 코너 브래킷 다리에있는 T 너트 위에 밀어 넣습니다.
   3. 패스너를 조여 수평 막대에 수직 막대를 고정하여 인접한 수평 막대 두 개를 결합하십시오.
      참고 : 완료되면 8 개의 돌출부 (4 개의 수평 및 4 개의 수직)가 4 개의 기둥이 위쪽으로 삐져 나오도록 테이블에 사각형 링을 형성합니다 ( 그림 1B , 계층 1).
   4. "H"형 카메라 마운트 어셈블리의 느슨한 T 너트를 섹션 1.4에서 이전 단계의 프레임 직립 물로 미십시오. "H & #34; 프레임의 각 모서리에있는 모서리 브래킷 위에 놓 이도록 아래쪽으로 끝까지 밀어 넣습니다. 네 모서리 브래킷 나사를 조여 카메라 장착 대를 제자리에 고정하십시오.
   5. 마지막 4 개의 1 피트 압출 알루미늄 바 ( 그림 1B , 레이어 3)를 사용하여 챔버의 하단 레이어를 조립하십시오.
      1. 하나의 모서리 브래킷을 각 1 피트 바의 양쪽 끝으로 밀어 넣고 브래킷의 다리를 바 끝과 같은 높이로 모서리 브래킷을 놓은 다음 나사를 조여 제자리에 고정시킵니다.
      2. 직립 '채널에있는 느슨한 T 너트가있는 프레임 직립 사이에 막대를 아래로 밀어 넣습니다. 모서리 브래킷의 상단 모서리가 직립 모서리의 1 인치 아래에 있도록 막대를 배치하고 모서리 브래킷 나사를 조여 제 위치에 고정하십시오.
6. 4 개의 직사각형 폴리 에스테르 시트의 T 너트를 수직 돌출 막대의 채널로 밀어 넣고 쳄버의 측면을 덮습니다r 고정 시키려면 패스너를 조입니다.
7. 한쪽을 선택하여 챔버 내부에 접근 할 수있는 문을 열고 챔버의 맨 아래에있는 두 개의 나사와 T 너트를 제거합니다.
   참고 : 프레임을 똑바로 세우면이 덮개의 아래쪽이 바닥에 느슨하게 매달 리고 들어 올려 져 실내의 내부에 닿을 수 있습니다.
8. 완성 된 프레임의 발 역할을하기 위해 각 모서리 부재의 상단에 플라스틱 캡을 놓습니다. 프레임을 오른쪽으로 위로 향하게 돌리십시오. 한 면당 두 개의 패널 홀더를 프레임의 기본 레이어에 삽입하고 꼬아 서 제자리에 고정하십시오 ( 그림 1B , 레이어 3). 검정 플레이트 ( 그림 1B , 레이어 3)에 대한 단계를 제공하기 위해 패널 홀더의 상단에 12 x 12 인치 ² 조각의 투명 아크릴을 놓습니다.

2. 카메라 및 스테이지 템플릿 포지셔닝

1. 현미경 카메라 비디오 수집 소프트웨어를 다운로드하여 컴퓨터에 설치하십시오.제조업체의 웹 사이트에서 확인하십시오.
2. 현미경 카메라를 세 개의 카메라 홀스터 각각에 넣고 카메라 광학 장치를 아크릴 스테이지와 백라이트쪽으로 향하게 놓습니다. 카메라를 컴퓨터의 USB 포트에 연결하십시오. 적외선 LED 백라이트 패널을 스테이지 아래에있는 프레임 아래에 놓습니다. 백라이트 패널을 연결하여 켜십시오.
3. 제공된 솔루션 - 배치 및 플레이트 정렬 템플릿을 투명 용지에 인쇄하십시오 ( 보충 파일 참조).
   참고 : 솔루션 배치 템플릿에서 플레이트 주변 원은 직경 3.8 cm이고 관심 영역의 내부 영역은 직경이 0.9 cm입니다.
4. 눈금 선을 따라 잘라 원형 템플릿을 둘러싸는 직사각형 투명도 조각을 얻습니다.
5. 비디오 수집 소프트웨어를 시작하고 창의 상단에있는 번호 매겨진 축소판을 클릭하여 카메라의 피드를 봅니다.
6. 현미경 카메라 정렬 및 배율을 조정합니다.
7. 현미경 카메라 렌즈 ( 그림 2B ) 아래에 플레이트 정렬 템플릿을 놓습니다.
8. 카메라 스탠드 막대를 따라 카메라 홀스터를 수직으로 밀어서 작동 거리를 변경하고 카메라의 배율을 조정하여 카메라의 시야 가장자리에 템플릿의 번호 표시가 분명하게 표시 될 때까지 확대합니다.
9. 플레이트 정렬 템플릿을 아크릴 스테이지에 붙입니다.
10. 현미경 카메라 아래 플레이트 정렬 템플릿에 벌레의 샘플 플레이트를 놓고 시야 내에 번호 표시를 유지하면서 벌레의 선명한 이미지가 나타날 때까지 배율과 작동 거리를 더 세분화합니다.
11. 다른 두 개의 현미경 카메라에 대해서도 2.6.1-2.6.4 단계를 반복하십시오.

3. 선충류의 성장과 동기화

1. 실험 4 일 전에, 24 개의 시드 60 mmLuria-Bertani (LB) 배지에서 50 μL의 OP50 대장균 (Escherichia coli) 을 갖는 NGM (Nematode Growth Media) 한천 플레이트 (처방에 대해서는 섹션 5 참조).
   참고 : 각 60mm 플레이트는 하나의 검정 플레이트에 충분한 웜을 제공합니다. 치료 또는 유전자형 당 6 복제물을 얻는 것이 좋습니다.
2. 씨를 뿌린 판을 뚜껑이 덮인 상태에서 상온에서 밤새도록 건조하게 두십시오.
3. 다음 날, 15 개의 잘 먹은 육식성 자웅 동성 양성자를 각 씨앗이있는 판에 옮기고 벌레가 6 시간 동안 알을 낳도록하십시오. 이렇게하면 한 접시 당 360 개 이상의 알이 나옵니다.
4. 6 시간 후 씨앗이있는 판에서 벌레를 제거하고 자손을 20 ℃에서 3 일 동안 성인으로 자라게하십시오.

4. 화학 감지 선호 분석

1. 실험 전날에 35mm NGM 한천 배지를 준비하십시오.
   1. 250mL의 NGM 한천을 준비하십시오 (제 5 장 참조).
   2. 평평한 스물 위에 5 개 이하의 스택에 28 개의 빈 35mm 플레이트를 배치하십시오얼굴. 각 분석 플레이트에 5mL의 NGM 한천을 채 웁니다. 상온에서 하룻밤 동안 뚜껑과 직립 건조 분석 플레이트를 남겨주세요.
      참고 : 경험적으로 우발적 인 경우 분석 할 각 치료 또는 유전자형에 대해 하나의 추가 분석 플레이트를 준비하십시오.
2. 실험 당일에 백라이트를 켜고 컴퓨터를 부팅 한 다음 현미경 카메라 비디오 캡처 소프트웨어를 실행하십시오.
3. 현미경 카메라를 컴퓨터에 연결하고 비디오 녹화 설정을 조정하십시오.
   1. 소프트웨어 창의 상단에있는 번호가 매겨진 카메라 섬네일을 클릭하면 카메라의 라이브 피드를 볼 수 있습니다.
   2. 카메라 피드의 왼쪽 상단 모서리에있는 '비디오 형식'메뉴를 당겨 'MJPG 1280 x 1024'를 선택하십시오. '비디오 포맷'메뉴 옆의 '폴더'메뉴를 당겨 비디오 파일을 저장할 폴더를 선택하십시오.
   3. 오른쪽 상단의 '자동 노출'아이콘을 클릭하십시오.카메라가 급지되고 자동 노출이 꺼집니다. 내장 된 현미경 카메라 LED를 끄려면 '자동 노출'아이콘 바로 오른쪽에있는 'LED'아이콘을 클릭하십시오. 인접한 '설정'아이콘을 클릭하십시오 : 웜이 배경과 구별 될 때까지 '흑백'을 선택하고 '대비'를 최대화하고 '밝기'를 조정하십시오.
4. 보정 비디오를 획득하십시오.
   1. 스테이지 플레이트 정렬 템플릿 상단에 솔루션 배치 템플릿을 정렬하십시오 ( 그림 2A ). 카메라 피드의 왼쪽에있는 'Time-Lapsed Video'녹화 아이콘을 클릭하고 지속 시간으로 '5'를 입력하고 1 프레임 / 초에 5 초 비디오를 녹화하기위한 간격으로 '1'을 입력하십시오. 비디오 녹화를 시작하려면 '시작'을 클릭하십시오.
5. 다른 두 개의 현미경 카메라에 대해 4.3 및 4.4 단계를 반복하십시오.
6. 챔버에서 솔루션 배치 템플릿을 제거합니다.
8. 5 ML 유리 피펫을 사용하여 동기화 된 벌레의 접시에 1.2 ML NGM 버퍼를 추가하고 부드럽게 버퍼에 벌레를 치환하기 위해 접시를 동요. 플레이트에서 버퍼를 피펫으로 씻고 완충액에 웜을 깨끗한 미세 원심 분리 튜브에 분배합니다.
   참고 : 웜은 자신의 배양 한천 소금 농도 ^(14)의 편차에 민감합니다. 웜 배치 후 한천 소금 농도의 변화를 최소화하기 위해 세척 공정에 NGM 완충액을 사용하는 것이 좋습니다 (제 5 장 참조). 벌레가 옆구리에 붙을 것이므로 플라스틱 피펫을 사용하여 웜을 판에서 제거하지 마십시오. 동시에 실행되는 분석 플레이트의 수와 동일한 수의 튜브를 준비하십시오.
9. 3 개의 튜브가 1-2 분 동안 서서 웜이 바닥에 닿도록하십시오. aggregat의 펠렛을 방해하지 않고 가능한 한 튜브에서 많은 세척 버퍼를 제거하는 플라스틱 피펫 팁을 사용하십시오관의 바닥에 벌레가있다. 튜브를 깨끗한 NGM 완충액 각각 1 mL로 채우십시오.
10. 한 번 4.7.2 단계를 반복하십시오.

10 mM CuCl ₂ 와 M13 완충액을 분석 용 플레이트에 첨가하십시오 (5 장 참조).

1. 해부 현미경의 무대 상단에 솔루션 - 배치 템플릿을 테이프.
2. 플레이트 정렬 템플릿의 양면에 양면 테이프를 붙입니다. 테이프가 플레이트 둘레 원과 겹치지 만 템플릿의 중앙에 관심있는 기록 영역을 가리지 않도록하십시오.
3. 분석 플레이트의 둘레를 플레이트 정렬 템플릿의 원과 정렬하고 템플릿이 플레이트의 하단에 달라 붙을 때까지 아래로 누릅니다. 해부 현미경에있는 솔루션 - 배치 템플릿 마커와 분석 플레이트 템플릿 번호 마커를 맞 춥니 다.
4. P2 피펫과 플라스틱 팁을 사용하여 1 사분기의 M13 버퍼를 사분면 1과 4에 각각 배치하십시오 ( 2 용액 1 μL를 넣으십시오 ( 그림 2A ).
5. 다른 두 분석 플레이트에 대해 4.8.2-4.8.4 단계를 반복하십시오.

용액 한 방울이 한천에 완전히 흡수되면 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 세척 된 웜을 각 미세 원심 분리 튜브에서 해당 분석 플레이트로 옮깁니다.

원형 치료 부위 위와 아래 영역에 각각 한 방울의 벌레를 놓습니다. 조직을 네 번 접고 무딘 가장자리를 사용하여 모든 분석 플레이트에서 과량의 세척 완충액을 흡수합니다.

템플릿 코너에서 번호를 정렬하여 행동 챔버에 현미경 카메라 아래에 즉시 세 assay 플레이트을 정렬. 웜이 분석 플레이트에 순응하도록 2-3 분간 기다리십시오.
참고 : 다음 단계에서 비디오 녹화를 시작하기 전에 비헤이비어 챔버 도어 플랩이 닫혀 있는지 확인하십시오.

다음 번 분석 플레이트에 대해 4.7-4.12 단계를 반복하십시오. 각 치료법 또는 유전자형에 대해 최소 6 회 반복 또는 2 회 녹음합니다.

5. 시약 준비

1. NGM 한천과 완충액을 준비하십시오.
   1. 1L 유리 병에 염화나트륨 1.5g, 한천 8.5g 및 펩톤 1.25g을 넣는다. 500mL의 증류수와 교반 막대를 병에 넣으십시오. 내용물이 들어있는 오토 클레이브 병.
   2. 병을 교반 플레이트에 놓고 교반 기능을 켜십시오.
   3. 멸균 기술을 사용하여 순서대로 첨가하십시오 : 0.5 mL의 5 mg / mL 콜레스테롤, 0.5 mL의 1 M 칼슘1 M 황산 마그네슘 0.5 mL 및 1 M 인산 칼륨 12.5 mL를 넣었다.
   4. 5.1.1에서 5.1.2 단계를 반복하여 NGM 완충액을 만들되 5.1.1 절에서 한천과 펩톤은 제외하십시오.
2. LB 배지를 준비하십시오.
   1. 1L 유리 병에 트립 톤 5g, 효모 추출물 2.5g, 염화나트륨 2.5g, 증류수 500mL 및 1N 수산화 나트륨 0.5mL를 넣는다. 내용물이 들어있는 오토 클레이브 병.
3. M13 버퍼를 준비하십시오.
   1. 1L 유리 병에 1.817g의 Tris, 2.922g의 염화나트륨, 0.373g의 염화칼륨 및 500mL의 증류수를 첨가한다. 내용물을 넣고 병을 고압 멸균하십시오.
4. 염화 구리 (CuCl ₂ ) 용액을 준비한다.
   1. CuCl을 ₂ 0.134 g을 단다. 100 MM CuCl _{2 저장} 용액을 만들기 위해 15 mL 플라스틱 튜브에 10 mL의 M13 버퍼에 용질을 첨가한다. 모든 용질이 disso가 될 때까지 플라스틱 관을 뒤집습니다.lved.
   2. 깨끗한 15 ML 플라스틱 튜브에 100 MM CuCl ₂ 솔루션을 정화 필터링 주사기와 0.2 μm의 멤브레인 필터를 사용하십시오.
   3. 10 mM CuCl ₂ 용액을 만들려면 M13 완충액 900 μL와 100 mM CuCl _{2 저장} 용액 100 μL를 미세 원심 분리 튜브에 넣으십시오. 미세 원심 분리 튜브를 뒤집어 잘 섞는다.

6. 비디오 분석

1. Python 3 (https://www.python.org/downloads/) 및 OpenCV 소프트웨어 라이브러리 (http://opencv.org/downloads.html)를 다운로드하십시오.
2. 분석을 위해 세 개의 Python 스크립트 (https://github.com/WormLabCaltech/ResidentWorm)를 다운로드하십시오.
   참고 : 계속하기 전에 사용하려는 모든 비디오 파일이 mp4 형식인지 확인하십시오.
3. 함수 및 매개 변수 설명을 보려면 콘솔에 'help (function name 입력)'을 입력하고 Enter 키를 누릅니다. 예를 들어 'help (calibration)'를 입력하고 Enter 키를 누릅니다.
4. 보정 기능 실행입력 매개 변수를 사용하여 관심 영역 (ROI)을 정의합니다.
   1. 변수 'mp4filename'에 대해 섹션 4에서 얻은 보정 비디오의 파일 이름을 입력하십시오. 파일 이름을 입력 할 때 따옴표를 포함하십시오.
   2. 'Q * x'및 'Q * y'변수에 대해 600 및 360 값부터 시작하십시오. * 사분면 번호 1 ~ 4를 입력하십시오. 'rad'변수의 값 310부터 시작하십시오. ROI 마스크가 템플릿의 사분면 윤곽선과 정렬 될 때까지 변수 값을 조정합니다.
   3. 이 기능을 실행할 때 콘솔에 인쇄 될 각 ROI의 총 픽셀 수를 기록하십시오. preference_index 함수의 'ROI_size'매개 변수에이 값을 입력하십시오.
5. 적절한 임계 값 상수를 결정하려면 threshold_constant 함수를 실행하십시오. 웜 (흰색)이 선명하게 보일 수있을 때까지 '상수'값을 조정하고 배경에 소금과 후추가 적은 소음이 발생합니다 (검은).
6. preference_index 함수를 실행하여 csv 데이터 시트, 비디오의 기본 설정 인덱스 및 수반되는 웜 점유도를 생성합니다.
   1. preference_index 함수의 입력 매개 변수로 6.4 및 6.5 단계에서 결정된 'Q * x', 'Q * y', 'rad', 'ROI_size'및 'constant'값을 사용하십시오.
      참고 : 각 비디오 프레임에 대해 preference_index 함수는 각 ROI의 웜 픽셀 수를 계산하고 총 ROI 픽셀 수 중에서 웜 픽셀의 백분율을 계산합니다. 이 함수는 다음 수식을 사용하여 각 비디오 프레임에 대한 기본 설정 인덱스 값을 생성합니다.
      
      참고 : 프로그램에서 비디오의 모든 프레임을 분석하면 평균 선호 인덱스 값이 비디오에 생성됩니다. 웜 점유도 플롯은 비디오의 선호 지수를 상단에 인쇄하고 csv 데이터 시트에는웜 픽셀, 백분율 웜 점유 값 및 각 비디오 프레임의 기본 설정 인덱스는 프로그램 실행이 완료되면 지정된 폴더에 저장됩니다.

Representative Results

그림 3A 는 서로 다른 유전자형 및 치료 pairings에 대한 선호 지수 값을 보여줍니다. 환경 설정 지수 값 1은 실험 투자 수익 (ROI)에있는 솔루션에 대한 강한 매력을 나타냅니다. 선호 지수 값 -1은 강한 반발력을 나타냅니다. M13 버퍼 용액을 대조 ROI와 실험 ROI에 둘 때 선호 지수 0.02를 얻었으므로 ROI 중 어느쪽으로도 공간 편향이 없음을 나타냅니다. N2 웜 강하게 구리 이온이 강한 방수제 (보충 영화 1) ^4- 있다는 이전의 결과를 확증 -0.67의 우선 지수에 기인하는 구리 이온을 피했다. 감각 섬모의 원위 세그먼트의 적절한 형성을 부족 OSM-3 변이체, A는 유의 구리 이온 (PI = -0.19) ^(15)의 회피 감소 하였다. ocr-2 돌연변이 체는 de 구리 회피를 비롯한 많은 ASH 매개 성 침해 수용체 반응에서의 fective는 구리 이온 (PI = 0.19) ( 보충 영화 2 ) ^{16에 대한} 유의미한 감소 회피 및 심지어 약간의 인력도 보입니다.

그림 3B 는 대표적인 웜 점유도를 보여주는데, 이는 각 비디오에서 시간에 따른 대조군의 웜 밀도와 실험적 ROI를 나타냅니다. 작도 영역의 색상이 어두울수록 ROI의 웜 픽셀 수는 커집니다. M13 완충액 대조군으로 처리 된 N2 웜에 대한 점유율 그래프는 두 ROI의 웜 수가 분석 전반에 걸쳐 유사 함을 보여줍니다. 그러나 구리 이온으로 처리 된 N2 웜의 점유 면적은 웜이 분석을 통해 실험 ROI를 강력하고 일관되게 피할 수 있음을 나타냅니다.

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그림 1 : Behavior Chamber Design의 사진 및 도식 표현. ( A ) 행동 챔버 설치의 정면도 (왼쪽)와 챔버 프레임의 상응하는 개략도 (오른쪽). 불투명 한 폴리 에스테르 시트는 바닥면을 제외한 모든면에 챔버를 둘러싸고있어 적외선 백라이트 패널을 통해 빛을 통과시킵니다. 숫자 1, 2 및 3은 (B)의 압출 레이어에 해당합니다. ( B ) 행동 챔버 프레임을 구성하는 압출 층의 평면도. 여기에는 상단 레이어 (1), 중간 카메라 마운트 어셈블리 레이어 (2) 및 하단 스테이지 레이어 (3)가 포함됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 : 솔루션 배치 및 플레이트 정렬 템플리트. ( A ) 솔루션 배치 템플릿에는 4 개의 사분면과 번호 정렬 표식이 있습니다. 대조 용액은 좌상 사상 및 우상 사분면에 놓고 실험 용액은 우상 및 좌하 사분면에 놓습니다. ( B ) 플레이트 정렬 템플릿은 비디오 레코딩 및 분석 동안 시야에서 웜의 폐색을 최소화하는 번호 정렬 마커 만 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3 :이 분석을 사용하여 수집 된 데이터의 예. ( A ) 야생형 N2 및 C. elegans에 대한 특이도 (PI) 값 M13 버퍼와 10mM의 CuCl 대 _(2)에 응답하여 m>. N2 웜은 M13 대조군 용액을 두 ROI에 모두 넣었을 때 대조군과 실험적 ROI 사이에 아무런 선호도를 나타내지 않았지만 구리 이온을 넣었을 때 실험적 ROI를 크게 피할 수있었습니다 (각각 PI = 0.02 및 -0.67). osm-3 (p802) 돌연변이와 ocr-2 (ak47) 돌연변이는 N2에 비해 구리 이온 회피가 유의하게 감소했다 (PI = -0.1 및 0.2). 각 유전자형 - 치료 쌍에 대해 N = 6 분석, 분석 당 360 벌레 이상, 오차 막대는 ± 1 SEM, *** p <0.001, 일원 분산 분석 후 사후 Tukey 정직한 유의 차 (HSD) 검정이 뒤 따른다. ( B ) 대조 ROI에 M13 버퍼가 있고 실험 ROI에 구리 이온 (아래)이있는 N2 웜과 ROI 모두에서 M13 버퍼가있는 N2 웜에 대한 대표적인 웜 점유율입니다. 각 점유도 아래의 색상 스케일은 웜 픽셀 수를 나타냅니다.pload / 55963 / 55963fig3large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 영화 1 : 10 mM 구리 염화물에 대한 N2 웜의 행동 반응. 웜은 M13 버퍼 (왼쪽 위와 오른쪽 아래)가있는 컨트롤 사분면에 끌 리지만 M13 버퍼에 용해 된 구리 이온을 포함하는 사분면 (오른쪽 위 및 왼쪽 아래)을 강하게 피합니다. 비디오는 초당 1 프레임으로 기록되었으며 속도는 15 배 빨라졌습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 영화 2 : 10 mM 구리 염화물에 대한 ocr-2 (ak47) 벌레 의 행동 반응 . 웜은 M13 버퍼 (왼쪽 위와 오른쪽 아래)와 사분면을 가진 컨트롤 사분면에서 대략 동일한 정도로 로밍합니다M13 버퍼에 녹아있는 구리 이온 (오른쪽 위와 왼쪽 아래)이 기록 기간 동안 지속된다. 돌연변이 체는 녹음 시작시 구리 이온을 함유 한 사분면에 대해 약간의 선호도를 나타낸다. 비디오는 초당 1 프레임으로 기록되었으며 속도는 15 배 빨라졌습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 : 솔루션 배치 및 플레이트 정렬 템플리트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

프로토콜의 중요한 단계는 검정 플레이트가 서로 다른 실험 기간 동안 일관된 건조 수준을 유지하도록하는 것입니다. 건조 수준이 다르면 한천에 대한 용액의 확산 속도가 달라져 결과적으로 행동 결과가 달라집니다. 따라서, 분석 플레이트는 항상 실험 전에 오후에 신선하게 만들어야합니다. 분석 당 시험 된 웜의 수는 또한 치료법을 쉽게 비교할 수 있도록 규제되어야합니다. 참고로, 야생형 웜 4-10 알 / 얻었다 평균 H> 분석 당 360 개 웜 상기 웜 동기화 프로토콜 ^(17)을 따라 경우를 낳는다. 어떤 돌연변이 계통의 돌연변이가 알을 낳지 못하는 경우, 알을 낳기 위해 더 많은 육식성 어른 벌레를 골라 대상 자 수에 도달시킵니다. 프로토콜의 또 다른 중요한 단계는 세척 프로세스 및 웜 배치 중에 웜을 부드럽게 처리하는 것입니다. 웜은 기계적 자극에 민감합니다. 반전 및 산란 방지 ¹⁸ . 또한 ROI를 정확하게 정의하고 비디오 분석을 진행하기 전에 특정 조명 조건에 대한 최적의 임계 값 상수 값을 결정하는 데주의를 기울여야합니다. 또한 마지막 실험이 실행 된 후 오랜 시간이 경과 한 경우 보정 및 임계 과정을 반복하는 것이 좋습니다.

이 방법의 한계는 작은 벌레 개체군을 분석하는데 적합하지 않다는 것입니다. 그러나 음식의 존재가 감각 거동에 미치는 영향을 결정하는 적절한 제어가 수행되면, 보존 분석과 같이 웜의 공간 탐색 위치를 제한하기 위해 음식을 활용하는 것도이 설정으로 가능합니다. 또한,이 방법은 근접 및 소량의 대조군과 실험용 용액 방울을 사용하기 때문에 자극 구배 탐색을 연구하기위한 것이 아닙니다.

멀티 웜 추적 및 단일 웜의 특징 추출을 가능하게 향후 e_content ">, 프로그래밍 소프트웨어는이 시스템을 ^{19, 20에} 통합 할 수 있습니다. 이러한 반전 속도 및 제공 할 것입니다 신체 굴곡의 진폭 단일 웜 행동의 미묘한 행동의 매개 변수를 기록 인구 통계 학적 분석의 맥락에서 개별 웜의 chemosensory 행동에 대한보다 자세한 그림입니다. 또한 게이지 크기가 적절한 주사기 바늘을 사용하여 투자 수익 (ROI)을 통해 구멍을 뚫고 습지에 한천을 주입하여 습관을 연구 할 수 있습니다 실험 화합물 또는 대조군 완충액과 함께 사용하면 습관성 연구 중에 필요한 시간보다 긴 기록 시간에 걸쳐 화합물의 표면 농도를보다 일관되게 유지할 수 있습니다.이 방법의 또 다른 잠재적 응용은 다른 선충류 종에 대해 비교 행동 연구를 수행하는 것입니다. 또한, 행동 챔버multimodal 자극에 행동 반응을 연구하기 위해 여러 가지 방법으로 수정할 수 있습니다. optogenetic 애플 리케이션을 위해, 높은 강도의 LED 배열은 분석 중에 관심 뉴런을 선택적으로 활성화하기 위해 카메라 마운트 옆에 부착 할 수 있습니다. 가열 요소, 냉각 시스템 및 온도 센서를 설치하여 감각 작용에 대한 온도 영향을 연구 할 수도 있습니다. 또한 냄새 전달 시스템을 냄새 감지 및 화학 감각 양상 간의 상호 작용을 조사하기 위해 챔버 내부에 설치할 수 있습니다.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

일부 계통은 NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440)의 지원을받는 Caenorhabditis Genetics Center (CGC)에 의해 제공되었습니다. 이 연구는 하워드 휴즈 의학 연구소 (Howard Hughes Medical Institute)에 의해 지원되며 PWS는 수사관입니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum T-slotted framing extrusions	McMaster-Carr	47065T101	Single profile, 1" size, solid
Brackets	McMaster-Carr	47065T236	1" long for 1" high single profile extrusions
Compact end-feed fasteners	McMaster-Carr	47065T139	1" (single), pack of 4
Twist-in solid panel holders	McMaster-Carr	47065T251	For 1" high extrusion
Plastic end caps	McMaster-Carr	47065T91	For 1" high extrusion
Optically clear cast acrylic sheet	McMaster-Carr	8560K211	3/16" thick, 12" x 12"
Vinyl-coated polyester fabric	McMaster-Carr	88505K57	0.027" thick, 61" width, black
Brass grommets	McMaster-Carr	9604K22	Trade size 0, 0.545" outer diameter
Steel washers	McMaster-Carr	90107A029	1/4" screw size
Rounded head screws	McMaster-Carr	90272A546	1/4" - 20 thread size, 1 - 1/2" long
Standard operating backlight	Smart Vision Lights	See local vendor	8" x 8", infrared 850 nm
IVP-C1 Variable Control Pot	Smart Vision Lights	See local vendor
T1 Power Supply	Smart Vision Lights	See local vendor
Dino lite Pro AM4113T	Dino-Lite Digital Microscope	See local vendor
MS09B microscope stand	Dino-Lite Digital Microscope	See local vendor

References

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