Automatisert analyse av en nematode-populasjonsbasert kjemosensorisk preferanseanalyse

Summary

Vi presenterer en opptaksoppsett og protokoll som muliggjør automatisk analyse av nematoden, Caenorhabditis elegans 'preferanse for oppløselige forbindelser i en populasjonsbasert analyse. Denne artikkelen beskriver konstruksjonen av et oppførselskammer, adferdsanalyseprotokollen og bruk av videoanalyseprogrammer.

Abstract

Den nematode, Caenorhabditis elegans 'kompakte nervesystemet av bare 302 nevroner, ligger under et mangfoldig repertoar av oppførsel. For å lette disseksjonen av nevrale kretser som ligger til grund for disse atferdene, er utviklingen av robuste og reproducerbare atferdsanalyser nødvendig. Tidligere C. elegans atferdsstudier har brukt variasjoner av en "drop test", en "chemotaxis assay" og en "retensjonsanalyse" for å undersøke responsen fra C. elegans til oppløselige forbindelser. Fremgangsmåten beskrevet i denne artikkelen søker å kombinere de komplementære styrker av de tre ovennevnte analysene. Kort fortalt er en liten sirkel i midten av hver analyseplass oppdelt i fire kvadranter med kontrollen og eksperimentelle løsninger skiftevis plassert. Etter tilsetningen av ormene blir analyseplaten lastet inn i et oppførselskammer hvor mikroskopkameraer registrerer ormene i de behandlede områdene. Automatisert videoanalyse utføres deretter aNd en preferanseindeks (PI) -verdi for hver video genereres. Videooppkjøpet og automatiserte analysegenskaper av denne metoden minimerer eksperimentørens involvering og eventuelle tilknyttede feil. Videre brukes små mengder av eksperimentell forbindelse per analyse og adferdskammerets multikameraoppsett øker eksperimentell gjennomstrømning. Denne metoden er spesielt nyttig for å utføre adferdsskjermbilder av genetiske mutanter og nye kjemiske forbindelser. Denne metoden er imidlertid ikke egnet for å studere stimulusgradientnavigasjon på grunn av nærhet av kontroll- og eksperimentelle løsningsområder. Det bør heller ikke brukes når bare en liten populasjon ormer er tilgjengelig. Selv om det er egnet for å analysere responser bare på løselige forbindelser i sin nåværende form, kan denne metoden lettmodifiseres for å imøtekomme multimodal sensorisk interaksjon og optogenetiske studier. Denne metoden kan også tilpasses for å analysere de kjemosensoriske responsene til andre nematodearter.

Introduction

Foraging dyr må integrere innganger fra flere sensoriske modaliteter og velge passende atferdsstrategier for å kunne navigere i deres miljø. Forståelse av hvordan eksterne sensoriske innganger mottas og omdirigert til nevral informasjon for å styre handlingsvalg, er et sentralt mål innen neurobiologi. Den genetisk trekkbare nematoden, C. elegans , er en attraktiv modellorganisme for å studere de nevrale mekanismene som ligger til grunn for sensorisk biologi og multimodal integrasjon. Selv om C. elegans har bare 302 nevroner, kan den oppdage og diskriminere mellom et bredt spekter av miljøstimuli, inkludert oppløselige forbindelser, flyktige luktstoffer og omgivelsestemperatur ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7} . DeNematode C. elegans er avhengig av sin kjemosensoriske apparat for å lokalisere matkilder og å varsle seg for potensielle trusler. Dermed utfører adferdsanalyser for å skjerme responsene til villtype og mutant C. elegans til kjemiske stimuli en avgjørende rolle i å dissekere de genetiske, cellulære og nevrale mekanismene som ligger til grund for C. elegans bemerkelsesverdige sensoriske evner.

For å analysere responsen på oppløselige forbindelser har tre typer analyser blitt beskrevet - drop-testen, chemotaxis-analysen og retensjonsanalysen. I droppprøven plasseres en liten dråpe av forbindelsen på halen av en bevegelig orm, og ormen har til hensikt å reversere eller bevege seg fremover når væsken når det fremre sensoriske apparatet, scoret ⁴ . Dråpetesten krever lite eksperimentelt preparat og er nyttig når maskestørrelsen er liten, som i tilfelle laseropererte ormer. Men som bare en ormKan analyseres ad gangen og eksperimentet må være til stede i løpet av analysens varighet, kan droppprøven være tidkrevende. Drop-testen er også sårbar for variasjoner i drop-levering mellom hver orm i en prøve, noe som kan påvirke de samlede resultatene av analysen. En annen begrensning av drop testen er at den bare kan brukes til å analysere ormenes respons på aversive forbindelser, da det ikke er mulig å diskriminere mellom en attraktiv eller nøytral effekt av forbindelsen fra ormens fremadrettede bevegelse.

Chemotaxis-analysen for oppløselige forbindelser innebærer generelt å dele en agarplate i fire kvadranter, idet eksperimentell oppløsning blandes i agar av to motstående kvadranter og kontrolloppløsningen blandes inn i de andre to kvadranter ^{8 , 9} . Ved starten av analysen plasseres en dråpe buffer som inneholder ormer i midten av platen og antall ormer i Hver kvadrant blir scoret på forskjellige tidspunkter. Chemotaxis-analysen gir større statistisk effekt sammenlignet med dropptesten, da et stort antall ormer blir testet i hver analyse. En begrensning av denne metoden er imidlertid at fremstilling av kjemotaksisanalyseplater krever store mengder av forsøksforbindelsen. Dette vil gjøre det vanskelig å utføre storskala adferdsskjerm hvis en komplisert renseprosess med begrensede utbytter er nødvendig for å oppnå forbindelsen av interesse, som i tilfelle av askarosid-signalmolekylene ¹⁰ . I tillegg er manuell telling av ormer gjennom analysen utsatt for feil, og forstyrrelsen av platene under telleprosessen kan påvirke resultatene.

I motsetning til de to nevnte metodene benytter retensjonsanalysen maskinsyn, som minimerer feil under scoringprosessen og reduserer eksperimenters interferens under analysen > 11. Datastyrt analyse av videoopptak av ormadferd kan også potensielt avsløre subtilt atferdsdynamikk som vil bli savnet når scoring bare utføres på enkelte diskrete tidspunkter. I retensjonsanalysen legges to løsninger flekker på motsatte sider av en liten sirkulær bakteriell matrett, fulgt av plassering av et lite antall ormer i midten av matlapet. Ormenes oppførsel blir deretter innspilt, analysert og en preferanseindeksverdi beregnes basert på totalt antall ormpiksler i hver løsningsområde. Selv om tilstedeværelsen av et attraktivt matopplegg muliggjør bruk av mindre populasjoner av ormer i hver analyse, har det tidligere vist seg at mat har blitt sensitivisert for å unngå oppførselstiltak til oppløselige repellanter ¹² . Videre utviser ormer en fotofob respons på kortbølgelengde lys og bruken av mikroskop lyskilder som avgir hvitt lys i opptaksoppsettoppsettet kan påvirke atferdS = "xref"> 13.

Formålet med metoden som diskuteres i denne artikkelen er å registrere og analysere C. elegans ' preferanse for oppløselige forbindelser ved bruk av en populasjonsbasert analyse. For dette formål integrerer og forbedrer den nåværende metoden på aspekter fra alle tre av de tidligere diskuterte metodene. Det gjør at store populasjoner av ormer kan testes og krever bare små mengder av den eksperimentelle løsningen som skal brukes i hver analyse. I tillegg utføres analysen i et spesialbygd lukket adferdskammer med infrarød LED-bakgrunnsbelysning for å minimere effektene av kortbølgelengde lys på oppførsel. Hvert kammer kan også utstyres med flere mikroskopkameraer, noe som øker eksperimentell gjennomstrømning uten å kompromittere benkplass. Til slutt produserer videoanalyseprogrammet preferanseindeksverdien for hver video, samt en tilhørende ormenes okkupasjonsplott for å visualisere populasjonsadferd dynamikken over tid. Kammeroppsettet og aSsay-protokollen kan endres ytterligere for å studere multimodale adferdsresponser, for eksempel effekten av luktemidler eller temperatur på kjemosensorisk oppførsel.

Denne artikkelen beskriver konstruksjonen av oppførselskammeret og analyseprotokollen. Det demonstrerer også nytten av denne metoden ved å analysere responsen av villtype-ormer og kjemosensoriske defekte mutanter til den kjente oppløselige repellanten, kobberioner ⁴ . Endelig er videoanalyseprosessen ved hjelp av den medfølgende programvaren detaljert.

Protocol

1. Behavior Chamber Assembly

MERK: Oppførselskammeret består av en omtrent kubeformet ramme laget av ekstruderte aluminiumstenger, dekket med ugjennomsiktige stoffdeksler, med klar akrylbunn og kameraunderlag. Samlinger mellom de ekstruderte aluminiumstengene som danner oppførselskammeret er alle vinkelrette og er festet med "L" -formede hjørnebeslag (1 tommers bred med 1-tommers bein) som fester et hjørnebrakettben til hver stolpe med skruer og innløp T-muttere. Hver ledd er festet med en eller to hjørnebeslag som beskrevet nedenfor. Tekstildekslene over kammeret er festet til aluminiumsrammer med samme skruer og glide inn T-muttere, men gjennom grommets i hjørnene av stoffet. Skruene er ordentlig satt inn i den neddykkede siden av T-mutterne, ikke i siden med den utstående leppen. Når du monterer en skrue / T-mutterfesteanordning til en aluminiumstang, skyv T-mutteren inn i kanalenPå riktig side av stangen med skruens hode stikker ut av sporet.

1. Klargjør stoffdeksler.
   1. Bruk saks til å kutte fem stykker av det ugjennomsiktige polyester stoffet for å dekke de øverste og fire sider av kammeret.
      1. Klipp ett kvadrat 14 x 14 tommers ² ark med stoff i toppen av kammeret. Klipp fire rektangulære 11 x 14 tommer ² ark stoff til sidene av kammeret.
   2. Monter grommets i hjørner av stoffarkene.
      1. Merk en referanselinje 0,5 tommer fra hver kant av alle fem polyesterdukarkene ved hjelp av blyant og ratt.
      2. For de fire rektangulære arkene, bruk takklemmer for å sette inn grommets sentrert hvor blyantlinjene skjærer hvert hjørne (det vil si 4 grommets per ark).
      3. For firkantet ark, sett inn to grommets langs hver kant med hver grommet sentrert på blyantlinjen og plassert 1,5-tommers fra slutten av hver avDe fire blyantlinjene (det vil si 8 grommets totalt, to i hvert hjørne).
   3. Sett inn en skrue i hvert hull i hullet og fest hverandre en T-mutter.
2. Fremstil kamerafestebjelker.
   1. Bruk en båndsag eller tilsvarende å kutte en 2 tommers lang stykke aluminiums ekstruderingsbøyle for hvert kamera, slik at den kappede enden av stangen er vinkelrett på stanglengden for å lette senere montering.
   2. Bruk et boretrykk med en 0,25 tommers diameter borekrone for å bore et hull gjennom senterbanene til hver kamerafeste, 0,75 tommer fra den ene enden slik at hullet er vinkelrett på topp- og bunnflatene og passerer gjennom senterlinjen på stangen . Eventuelt, bor hullet ved hjelp av en håndholdt elektrisk drill med en 0,25 tommers borekrone, men sørg for at hullet er vinkelrett på topp- og bunnflaten på stangen.
3. Forbered alle hjørnebeslagene.
   1. Sett inn en skrue gjennom hullet iHvert hjørnebrakettben, sett inn skruen fra innsiden av vinkelsiden. Trekk en T-mutter løst på hver skrue.
4. Klargjør kameramonteringsenheten ( figur 1B , lag 2).
   MERK: Kameramonteringsenheten er en "H" -formet enhet som støtter de tre kamerahylsterene.
   1. Fest kameraets festestenger til midtlinjen på kameraholderen.
      1. Legg ut de tre kameramonteringsstavene som ble produsert i trinn 1.2 med de borede hullene orientert vertikalt. Skyv to hjørnebeslag på sidene av hver monteringsbjelke på enden lengst fra boret hull.
      2. Plasser hjørnekonsollene med brakets bein flush med enden av stangen og stram skruene for å festes på plass. Dette danner en "T" form med det borede hullet på bunnen av "T".
      3. Legg en 1 fots aluminium ekstrudering på arbeidsflaten. Slip T-mutterne på en kamerafestebjelkeMbly (fra forrige trinn) på den ene siden av 1 fotstangen. Sikt monteringsbjelken langs lengden på 1 fotbjelken og stram skruene for å festes på plass. Sett de andre to festestengene på motsatt side av 1 fotstangen.
      4. Plasser de to stolpene like langt fra midten av 1 fotstangen, med de indre hjørnebeslagene på ca 2,5 tommer fra hverandre. Sett hjørnekonsollene på sidene av 1 fotstangen, to i hver ende av stangen. Plasser hjørnebrakettene med brakets bein flush med endene av stangen og stram skruene for å feste seg på plass.
   2. Fest endefeltene til midtlinjen.
      1. Slip to 1-fots aluminiumprofiler på T-mutrene i hver ende av aggregatet fra det forrige trinn som danner en "H" -form. Senter hver endefelt på midtlinjen og fest den ved å trekke de fire skruene.
      2. Sett fire hjørnebeslag på toppen av de to endefeltene som ble lagt til i forrige trinn, en i hver endeAv hver bar. Plasser hjørnebrakettene med brakets bein flush med endene av stolpene og stram skruene for å festes på plass.
   3. Fest kameraholder og hylster til kameramonteringsenheten.
      1. For hvert av de tre mikroskopkameraholderene fjerner du kamerahylsteret ved å løsne tommelskruen og skyve av stativet.
      2. For hver kamerafestebøyle (nå festet til midtlinjen på "H"), plasser en vaskemaskin på en rundhodeskrue, fest skruen opp gjennom det borede hullet i kameraholderen og sett en annen vaskemaskin nedover skruen . Trekk det tappede hullet på kameraholderstangen ned på skruen, fest godt mot kameraholderen.
      3. Gjenta trinn 14.3.2 for de andre to kamerafeltene.
      4. Skyv et kamerahylster på hver kamerestativ med bredere åpning rettet mot kameraholderen og skruen. Sikre holsteret midlertidig til kameraholderen rOd med hylsterens tommelskrue.
         MERK: Den endelige driftsposisjonen settes i avsnitt 2.
5. Monter oppførselskammerrammen ( figur 1A ).
   MERK: For å lette konstruksjonen, monter rammen opp og ned, begynner med "topp" av kammerets ramme på arbeidsflaten ( figur 1B , lag 1) og arbeider oppover mot "fotene" på rammen ( figur 1B , lag 3).
   1. For å montere det øverste laget av adferdskammeret, fest fire firefotede ekstruderte aluminiumstenger til den firkantede polyesterplaten ( figur 1B , lag 1).
      1. Skyv en stolpe på de to T-mutrene langs hver kant av stoffarket, og senter baren langs stoffbredden. Trekk til festene for å feste stoffarket til hver stolpe.
      2. Spred den firkantede polyesterplaten på arbeidsflaten wiDe fire festede aluminiumskinnene på toppen. Slip åtte hjørnebeslag på de øverste flatene på de fire aluminiumstengene, en i hver ende av hver stolpe. Plasser hjørnekonsollene på stolpene med brakets vertikale bein flush med endene av stolpene. Sikre ved å stramme skruene inn i T-mutterne.
   2. Til gjengjeld på hvert hjørne står en ytterligere 1-fots aluminium ekstrudering oppreist, og glir ekstruderingen over T-mutrene på de to hjørnebrakettbenene.
   3. Fest den stående stangen til de horisontale stengene ved å stramme festene, slik at de trekker sammen de to tilstøtende horisontale stengene.
      MERK: Når de er ferdig, vil de åtte ekstruderingene (fire horisontale og fire vertikale) danne en firkantet ring på bordet med fire innlegg som stikker oppover ( figur 1B , lag 1).
   4. Sett de løse T-mutrene på den "H" -formede kamerabesamlingsenheten fra kapittel 1.4 ned i stativets stolper fra forrige trinn. La "H & #34; Skyv helt ned for å hvile på toppen av hjørnekonsollene på hvert hjørne av rammen. Fest kameramonteringsenheten på plass ved å trekke de fire hjørnebrakettskruene fast.
   5. Monter kammerets bunnlag ved å bruke de endelige fire 1 fot ekstruderte aluminiumstenger ( figur 1B , lag 3).
      1. Skyv en hjørne brakett på hver ende av hver 1-fots bar, plasser hjørnebrakettene med brakets bena flush med endene på stangen og trekk skruene for å feste på plass.
      2. Skyv stengene ned mellom rammen oppreist med de løse T-mutrene i stående kanalene. Plasser stolpene slik at toppkanten på hjørnebrakettene er 1 tommer under den åpne enden av stolpene og fest på plass ved å stramme skruene på hjørnebraketten.
6. Skyv T-mutrene til de fire rektangulære polyesterarkene ned i kanalene på de stående ekstruderingsstengene for å dekke sidene av kammenR og stram festerne for å feste dem på plass.
7. Velg en side for å være en dør for å få tilgang til det indre av kammeret, og fjern de to skruene og T-mutrene i kammerets nedre lag.
   MERK: Når rammen vender opp, vil bunnen av dette dekselet løsne seg på bunnen og kan løftes for å få tilgang til kammerets interiør.
8. Legg en plasthette på toppen av hvert hjørneelement for å fungere som føtter for den ferdige rammen. Vri rammen rett opp. Sett inn to panelholdere per side inne i rammens grunnlag og vri for å feste dem på plass ( figur 1B , lag 3). Plasser en 12 x 12 tommer ² stykke klar akryl på toppen av panelholderne for å gi et trinn for analyseplater ( figur 1B , lag 3).

2. Kamera- og scenemallposisjonering

1. Last ned og installer mikroskopkamera videoinnsamlingsprogramvaren på datamaskinenFra produsentens nettsted.
2. Sett et mikroskopkamera inn i hver av de tre kamerahullerne med kameraoptikken peket ned mot akrylstadiet og bakgrunnslyset. Koble kameraene til datamaskinens USB-porter. Plasser infrarød LED-bakgrunnsbelysningspanelet under rammen, sentrering under scenen. Plugg inn bakgrunnslyspanelet for å skru på.
3. Skriv ut de angitte løsningene for plassering og platejustering på transparensark (se tilleggsfil ).
   MERK: Platen perimeter sirkel er på 3 cm i diameter, og den indre interesseområdet er 0,9 cm i diameter.
4. Klipp langs rutenettet for å skaffe rektangulære gjennomsiktighetsstykker som omgir de sirkulære malene.
5. Start videoinnsamlingsprogramvaren og klikk på nummererte miniatyrer øverst i vinduet for å vise kameraets feeder.
6. Juster miksekamerajustering og forstørrelse.
7. Plasser en platejusteringsmal under et mikroskopkameraobjektiv ( Figur 2B ).
8. Endre arbeidsavstanden ved å skyve kamerahylsteret vertikalt langs kamerestativet og juster kameraets forstørrelse ved å rotere kameraets forstørrelsesratus til malens nummermerke er tydelig synlig på kantene til kameraets synsfelt.
9. Tape platejusteringsmalen til akrylstadiet.
10. Plasser en prøveplate med ormer på platejusteringsmalen under mikroskopkameraet, og forbedre forstørrelses- og arbeidsavstanden til et skarpt bilde av ormene oppnås mens du fortsatt opprettholder tallmarkørene innenfor synsfeltet.
11. Gjenta trinn 2.6.1-2.6.4 for de andre to mikroskopkameraene.

3. Nematode Vekst og Synkronisering

1. Fire dager før forsøkene, frø fireogtyve 60 mmNematod Growth Media (NGM) agarplater med 50 μl OP50 Escherichia coli i Luria-Bertani (LB) buljong (se avsnitt 5 for oppskrift).
   MERK: Hver 60 mm plate vil gi nok ormer til en analyseplade. Det er anbefalt å få seks replikater per behandling eller genotype.
2. La de podede platene tørke oppreist med lokk på, over natten ved romtemperatur.
3. Neste dag, overfør femten godt matede, gravide hermafroditter på hver såpnet tallerken og la ormer legge egg i seks timer. Dette vil gi> 360 egg per tallerken.
4. Etter 6 timer fjerner ormer fra frøplater og lar avkom vokse i tre dager til voksne ved 20 ° C.

4. Kjemosensorisk preferanseanalyse

1. Dagen før forsøket, lag 35 mm NGM agaranalyseplater.
   1. Tilbered 250 ml NGM agar (se avsnitt 5 for oppskrift).
   2. Ordne tjueåtte tomme 35 mm plater i stabler på fem eller mindre på en flat surface. Fyll hver analyseplate med 5 ml NGM-agar. La prøveplater tørke oppreist med lokk på, over natten ved romtemperatur.
      MERK: Som en tommelfingerregel, utarbeide en ekstra analyseplade for hver behandling eller genotype som skal analyseres i tilfelle av uforutsetninger.
2. På eksperimentets dag slår du på bakgrunnslyset, starter datamaskinen og starter mikrofonkamera videoopptaksprogramvaren.
3. Koble et mikroskopkamera til datamaskinen og juster innstillingene for videoopptak.
   1. Klikk på det nummererte kameraets miniatyrbilde øverst i programvarevinduet for å vise kameraets live-feed.
   2. Trekk menyen 'Videoformat' øverst i venstre hjørne av kamerainngangen og velg 'MJPG 1280 x 1024'. Trekk ned mappen "Meny" ved siden av menyen "Videoformat" og velg en mappe der du skal lagre videofilene.
   3. Klikk på ikonet 'Auto eksponering' øverst til høyre påKameraet mates og slår av automatisk eksponering. Klikk på ikonet 'LED' umiddelbart til høyre for ikonet 'Auto eksponering' for å slå av de innebygde mikroskopkamera-LEDene. Klikk på det tilstøtende Innstillinger-ikonet: Velg 'Svart-hvitt', maksimere 'Kontrast', og juster 'Lysstyrke' til ormer vises forskjellig fra bakgrunnen.
4. Skaff kalibreringsvideoer.
   1. Juster en løsning-plasseringsmal på toppen av en scenemålejusteringsmal ( figur 2A ). Klikk på ikonet "Time-Lapsed Video" på venstre side av kamerafeltet, og skriv inn '5' s for varighet og '1' s for intervall for å ta opp en 5 s-video ved 1 bilde / s. Klikk på 'Start' for å starte videoopptak.
5. Gjenta trinnene i 4.3 og 4.4 for de andre to mikroskopkameraene.
6. Fjern løsningen-plasseringsmal fra kammeret.
8. Bruk en 5 ml glasspipette for å legge 1,2 ml NGM-buffer til en plate med synkroniserte ormer og rør forsiktig platen for å forflytte ormene inn i bufferen. Pipetter opp bufferen fra platen og dispensere ormer i buffer i et rent mikrocentrifugerør.
   MERK: Ormer er følsomme for avvik fra deres dyrkningsagar-konsentrasjon ¹⁴ . For å minimere endringer i agarsaltkonsentrasjon etter ormplassering anbefales det å bruke NGM-buffer til vaskeprosessen (se avsnitt 5 for oppskrift). Ikke bruk plastpipetter for å fjerne ormer fra plater, da ormer vil holde seg til sidene. Forbered et tilsvarende antall rør som antall assayplater som skal kjøres samtidig.
9. La de tre rørene stå i 1-2 minutter for å la ormene komme seg til bunnen. Bruk en pipettespiss for å fjerne så mye vaskebuffer fra rørene som mulig uten å forstyrre aggregatets pelletEd ormer på bunnen av rørene. Påfyll rørene med 1 ml ren NGM buffer hver.
10. Gjenta trinn 4.7.2 en gang.

Tilsett 10 mM _CuCl2 og M13 bufferløsninger til analyseplater (se seksjon 5 for oppskrifter).

1. Tape en løsning-plasseringsmal over toppen av disseksjonsmikroskopet.
2. Legg en stripe med dobbeltsidig tape på hver side av en platejusteringsmal. Forsikre deg om at båndet overlapper platen perimeter-sirkelen, men hindrer ikke innspillingsområdet i midten av malen.
3. Juster omkretsen på analyseplaten med sirkelen på platejusteringsmalen og trykk ned til malen holder seg til bunnen av platen. Juster analysepanelmall nummer markører med løsningen-plassering mal markører på disseksjon mikroskop.
4. Bruk en P2 pipette og plastspiss for å plassere 1 μL av M13-bufferen hver i kvadrant 1 og 4 ( 2 oppløsning hver i kvadranter 2 og 3 ( Figur 2A ).
5. Gjenta trinn 4.8.2-4.8.4 for de andre to analyseplatene.

Når løsningen faller, er fullstendig absorbert i agar, bruk en Pasteur pipette for å overføre vasket masker fra hvert mikrocentrifugerør til den tilsvarende analyseplaten.

Plasser en dråpe ormer hver på området over og under det sirkulære behandlede området. Fold et vev fire ganger og bruk den stumpe kanten til å absorbere overflødig vaskebuffer på alle analyseplater.

Ordne de tre analyseplatene umiddelbart under mikroskopkameraene i oppførselskammeret ved å justere tallene i malhjørnene. Vent i 2-3 minutter for å la ormene akklimere til analyseplaten.
MERK: Forsikre deg om at inngangskammerets dørflik lukkes før du starter videoopptak i neste trinn.

Gjenta trinn 4.7-4.12 for neste runde assayplater. Oppnå minst seks replikater eller to runder med innspilling for hver behandling eller genotype.

5. Reagenspreparasjon

1. Forbered NGM agar og buffer.
   1. I en 1 L glassflaske tilsettes 1,5 g natriumklorid, 8,5 g agar og 1,25 g pepton. Tilsett 500 ml destillert vann og en rørstang til flasken. Autoklaverflaske med innhold.
   2. Plasser flasken på en røreplate og slå på rørefunksjonen.
   3. Legg til i orden ved bruk av steril teknikk: 0,5 ml 5 mg / ml kolesterol, 0,5 ml 1 M kalsiumKlorid, 0,5 ml 1 M magnesiumsulfat og 12,5 ml 1 M kaliumfosfat.
   4. Gjenta trinn 5.1.1 til 5.1.2 for å lage NGM-buffer, men utelat agar og pepton i trinn 5.1.1.
2. Forbered LB buljong.
   1. I en 1 L glassflaske tilsettes 5 g trypton, 2,5 g gjærekstrakt, 2,5 g natriumklorid, 500 ml destillert vann og 0,5 ml 1 N natriumhydroksyd. Autoklaverflaske med innhold.
3. Forbered M13 buffer.
   1. I en 1 L glassflaske tilsettes 1,817 g Tris, 2,922 g natriumklorid, 0,373 g kaliumklorid og 500 ml destillert vann. Autoklaver flasken med innhold.
4. Klargjør kobberklorid (CuCl ₂ ) -oppløsning.
   1. Veie 0,134 g CuCl ₂ . Tilsett løst til 10 ml M13 buffer i et 15 ml plastrør for å lage 100 mM CuCl ₂ stamløsning. Inverter plastrøret til alt løsemiddelet har dissolved.
   2. Bruk en sprøyte og 0,2 μm membranfilter for å filtrere rens 100 mM CuCl ₂ oppløsningen i et rent 15 ml plastrør.
   3. For å gjøre 10 mM _CuCl2 løsning, tilsett 900 ul av M13-buffer og 100 pl 100 mM _CuCl2 lageroppløsning til et mikrosentrifugerør. Inverter mikrocentrifugerøret for å blande godt.

6. Video analyse

1. Last ned Python 3 (https://www.python.org/downloads/) og OpenCV-programvarebiblioteket (http://opencv.org/downloads.html).
2. Last ned de tre Python-skriptene for analyse (https://github.com/WormLabCaltech/ResidentWorm).
   MERK: Kontroller at alle videofiler som skal brukes, er i mp4-format før du fortsetter.
3. For å se funksjonen og parameterbeskrivelsene, skriv 'hjelp (skriv inn funksjonsnavn)' i konsollen og trykk enter. Skriv for eksempel «hjelp (kalibrering)» og trykk enter.
4. Utfør kalibreringsfunksjonenMed inngangsparametere for å definere videoområdene av interesse (ROI).
   1. Skriv inn filnavnet til kalibreringsvideoen tatt i avsnitt 4 for variabelen 'mp4filnavn'. Inkluder anførselstegn når du legger inn filnavnet.
   2. Begynn med verdiene 600 og 360 for 'Q * x' og 'Q * y' variablene. * Skriv inn kvadrantnumre 1 til 4. Start med verdien 310 for variabelen "rad". Juster variabelverdiene til ROI-maskene stemmer overens med kvadrantkonturene på malen.
   3. Ta opp det totale antallet piksler i hvert avkastning som skrives ut i konsollen ved utførelse av denne funksjonen. Skriv inn denne verdien for parameteren 'ROI_size' i preference_index-funksjonen.
5. Utfør terskelkonstantfunksjonen for å bestemme riktig terskelkonstant. Juster "konstant" verdien til ormene (hvite) kan ses tydelig, og det er minimal salt og pepper i bakgrunnen (svart).
6. Utfør preference_index-funksjonen for å generere et csv dataark, videoens preferanseindeks og den tilhørende ormenes okkupasjonsplott.
   1. Bruk 'Q * x', 'Q * y', 'rad', 'ROI_size' og 'constant' -verdiene bestemt fra trinn 6.4 og 6.5 som inndataparametere for preference_index-funksjonen.
      MERK: For hver videoramme teller preferanse_index-funksjonen antall ormpiksler i hvert avkastning og beregner prosentandelen ormpiksler ut av det totale antall ROI-piksler. Funksjonen genererer deretter en preferanseindeksverdi for hver videoramme ved hjelp av formelen:
      
      MERK: Når programmet har analysert alle rammene i videoen, genereres en gjennomsnittlig preferanseindeksverdi for videoen. En okkupasjonsplot med videoens preferanseindeks trykt på toppen, samt et csv dataark som inneholderOrmpiksel, prosentvise ormbelegningsverdier og preferanseindeksen for hver videoramme, vil bli lagret i den angitte mappen når programmet er ferdig.

Representative Results

Figur 3A viser preferanseindeksverdiene oppnådd for forskjellige genotype- og behandlingsparinger. En preferanseindeksverdi på 1 indikerer sterk tiltrekning til løsningen plassert i eksperimentell avkastning, mens en preferanseindeksverdi på -1 indikerer sterk avstøtning. En preferanseindeks på 0,02 ble oppnådd når M13-bufferoppløsningen ble plassert i både kontroll- og eksperimentelle ROI, hvilket viste at det ikke er romlig forspenning mot enten avkastning. N2 ormer forhindret sterkt kobberioner som resulterte i en preferanseindeks på -0,67, noe som bekrefter tidligere funn at kobberioner er en sterk repellant ( Supplementary Movie 1 ) ⁴ . Osm-3 mutanter, som mangler riktig dannelse av de distale segmentene av sensoriske cilia, viste en betydelig redusert unngåelse av kobberioner (PI = -0,19) ¹⁵ . Ocr-2 mutanter, som er de Fektive i mange ASH-medierte nociceptive responser, inkludert kobberundvikelse, viser også betydelig redusert unngåelse og til og med litt mild tiltrekning mot kobberioner (PI = 0,19) ( Supplementary Movie 2 ) ¹⁶ .

Figur 3B viser representative ormbelegninger, som angir tydeligheten av ormer i kontrollen mot de eksperimentelle avkastningene over tid i hver video. Jo mørkere fargen på plottingsområdet, jo større antall ormpiksler i avkastningen. Beboelsesplottet for N2-ormer behandlet med M13-bufferkontrollen viser at antall ormer i begge avkastningene forblir like i hele analysen. Imidlertid viser okkupasjonsplottet for N2-ormer behandlet med kobberioner at ormer sterkt og konsekvent unngår eksperimentell avkastning gjennom hele analysen.

Gimg "src =" / files / ftp_upload / 55963 / 55963fig1.jpg "/>
Figur 1: Foto og skjematisk representasjon av oppførselskammerdesign. ( A ) Forhåndsvisning av oppførselskammeroppsett (venstre) og tilhørende skjematisk fremstilling av kammerramme (høyre). Ugjennomsiktige polyesterplater legger kammeret på alle ansikter bortsett fra bunnflaten, som gir lys gjennom det infrarøde baklyspanelet. Tallene 1, 2 og 3 tilsvarer ekstruderingslagene i (B). ( B ) Skjematisk oversikt over ekstruderingslag som omfatter oppførselskammerrammen. Dette inkluderer topplaget (1), det midterste kameramonteringslaget (2) og det nederste trinnlaget (3). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Løsning-plassering og Plate-alignment maler. ( A ) Løsningsplasseringsmalen har fire kvadranter og nummerjusteringsmarkører. Kontrollløsningen er plassert i øverste venstre og høyre høyre kvadrant mens den eksperimentelle løsningen plasseres i høyre og venstre venstre kvadrant. ( B ) Platejusteringsmalen har bare nummerjusteringsmarkører for å minimere okklusjon av ormene i synsfeltet under videoopptak og analyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Eksempeldata samlet inn ved hjelp av denne analysen. ( A ) Preference Index (PI) verdier for villtype N2 og mutant C. elegans m> i respons til M13 buffer og 10 mM _CuCl2. N2 ormer viste ingen preferanse mellom kontroll og eksperimentelle ROI når M13 kontrolloppløsning ble plassert i begge ROI, men sterkt unngått eksperimentell avkastning når kobberioner ble plassert i den (PI = 0,02 og -0,67, henholdsvis). Osm-3 (p802) mutanter og ocr-2 (ak47) mutanter viste signifikant redusert unngåelse av kobberioner sammenlignet med N2 (PI = -0,1 og 0,2). N = 6 analyser for hver genotypebehandlingsparing,> 360 ormer per assay, feilfelter angir ± 1 SEM, *** p <0.001, enveis ANOVA etterfulgt av post-hoc Tukey Honestly Significant Difference (HSD) test. ( B ) Representative ormbelegninger for N2-ormer med M13-buffer i både ROIs (topp) og N2-ormer med M13-buffer i kontroll ROI og kobberioner i eksperimentell avkastning (bunn). Fargeskalaen under hver belegningsplot representerer antall ormpiksler.Pload / 55963 / 55963fig3large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende film 1: Behavioral respons av N2 ormer til 10 mM kobberklorid. Ormer tiltrekkes kontrollkvadrantene med M13 buffer (øverst til venstre og nederst til høyre), men sterkt unngå kvadranter som inneholder kobberioner oppløst i M13 buffer (øverst til høyre og nederst til venstre). Videoen ble tatt opp med 1 bilde per sekund og sped opp 15x. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende film 2: Behavioral respons av ocr-2 (ak47) ormer til 10 mM kobberklorid. Worms streife seg i omtrent like stor grad i begge kontrollkvadrantene med M13 buffer (øverst til venstre og nederst til høyre) og kvadrantenS inneholdende kobberioner oppløst i M13 buffer (øverst til høyre og nederst til venstre) gjennom hele opptaksvarigheten. Mutantene har en liten preferanse for kvadranter som inneholder kobberioner ved opptakets start. Videoen ble tatt opp med 1 bilde per sekund og sped opp 15x. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende fil: Løsning-plassering og Plate-alignment maler. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Et kritisk trinn i protokollen er å sikre at analyseplatene har et konsistent tørhetsnivå over ulike eksperimentelle dager. Forskjellige tørhetsnivåer vil resultere i forskjellige diffusjonshastigheter av løsningen i agar og følgelig variasjoner i atferdsmessig utfall. Dermed skal analyseplater alltid gjøres friske på ettermiddagen før eksperimenter. Antall ormer som testes per test bør også reguleres for å lette sammenligningen mellom behandlinger. Til referanse ligger en vildtypeorm på 4-10 egg / h i gjennomsnitt som gir> 360 ormer per test hvis ormsynkroniseringsprotokollen ovenfor følges ¹⁷ . Hvis visse mutantstammer egglegger mangelfull, velger du mer gravid voksenorm for egglegging for å nå måletallet av avkom. Et annet viktig skritt i protokollen er å håndtere ormer forsiktig under vaskeprosessen og ormenes plassering. Ormer er følsomme for mekaniske stimuli, noe som fremkaller stressresponser slik S reverseringer og eggleggingsinhibering ¹⁸ . Videre bør det tas hensyn til å definere avkastningen nøyaktig og for å bestemme den optimale terskelkonstantverdien for bestemte lysforhold før du fortsetter med videoanalysen. Det anbefales også at kalibrerings- og terskelprosessene gjentas hvis det har gått lang tid siden det siste eksperimentet ble kjørt.

En begrensning av denne metoden er at den ikke er egnet for å analysere små ormpopulasjoner. Imidlertid, hvis det er utført passende kontroller for å bestemme innflytelsen av nærværet av mat på sensorisk oppførsel, utnytter man mat for å begrense ormens romlige undersøkelsessted som i retensjonsanalysen med dette oppsettet. I tillegg er denne metoden ikke ment for å studere stimulusgradientnavigasjon på grunn av nærhet og små mengder av kontroll- og eksperimentelle løsningsdråper som brukes.

E_content "> I fremtiden kan programmeringsprogramvaren som muliggjør flerwormsporing og singleworm-ekstraksjon, integreres i dette systemet ^{19 , 20.} Opptak av subtile oppførselsparametre for enkelormsoppførsel som reverseringshastigheter og amplitud av kroppsbuer vil gi Et mer detaljert bilde av en individuell ormos kjemosensoriske oppførsel i sammenheng med et populasjonsbasert assay. Analysen kan også modifiseres for å studere habituering ved å kjede hull gjennom ROI ved hjelp av sprøyteåler med passende måleformat og fylle hullene med agar infundert Med den eksperimentelle forbindelsen eller kontrollbufferen. Dette vil sikre en mer konsistent overflatekonsentrasjon av forbindelsen over en lengre periode av opptakstid som er nødvendig under vanningsstudier. En annen potensiell anvendelse av denne metoden er å gjennomføre sammenlignende oppførselsstudier på tvers av forskjellige nematodearter. I tillegg oppførselskammeretKan modifiseres på flere måter for å studere atferdsresponser til multimodale stimuli. For optogenetiske applikasjoner kan høyintensitets LED-arrays festes ved siden av kamerafesten for å selektivt aktivere nevroner av interesse under analysen. Varmeelementer, kjølesystemer og temperatursensorer kan også legges til oppsettet for å studere effekten av temperatur på sensorisk oppførsel. Videre kan luktleveringssystemer installeres inne i kammeret for å undersøke samspillet mellom luktsensoriske og kjemosensoriske modaliteter.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Noen stammer ble levert av Caenorhabditis Genetics Center (CGC), som er finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Dette arbeidet støttes av Howard Hughes Medical Institute, med hvilket PWS er ​​en etterforsker.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum T-slotted framing extrusions	McMaster-Carr	47065T101	Single profile, 1" size, solid
Brackets	McMaster-Carr	47065T236	1" long for 1" high single profile extrusions
Compact end-feed fasteners	McMaster-Carr	47065T139	1" (single), pack of 4
Twist-in solid panel holders	McMaster-Carr	47065T251	For 1" high extrusion
Plastic end caps	McMaster-Carr	47065T91	For 1" high extrusion
Optically clear cast acrylic sheet	McMaster-Carr	8560K211	3/16" thick, 12" x 12"
Vinyl-coated polyester fabric	McMaster-Carr	88505K57	0.027" thick, 61" width, black
Brass grommets	McMaster-Carr	9604K22	Trade size 0, 0.545" outer diameter
Steel washers	McMaster-Carr	90107A029	1/4" screw size
Rounded head screws	McMaster-Carr	90272A546	1/4" - 20 thread size, 1 - 1/2" long
Standard operating backlight	Smart Vision Lights	See local vendor	8" x 8", infrared 850 nm
IVP-C1 Variable Control Pot	Smart Vision Lights	See local vendor
T1 Power Supply	Smart Vision Lights	See local vendor
Dino lite Pro AM4113T	Dino-Lite Digital Microscope	See local vendor
MS09B microscope stand	Dino-Lite Digital Microscope	See local vendor

References

1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314, 1-340 (1986).
2. Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).
3. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
4. Hilliard, M. A., Bargmann, C. I., Bazzicalupo, P. C. elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail. Curr Biol. 12 (9), 730-734 (2002).
5. Hilliard, M. A., Bergamasco, C., Arbucci, S., Plasterk, R. H., Bazzicalupo, P. Worms taste bitter: ASH neurons, QUI-1, GPA-3 and ODR-3 mediate quinine avoidance in Caenorhabditis elegans. EMBO J. 23 (5), 1101-1111 (2004).
6. Zariwala, H. A., Miller, A. C., Faumont, S., Lockery, S. R. Step response analysis of thermotaxis in Caenorhabditis elegans. J Neurosci. 23 (10), 4369-4377 (2003).
7. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 70 (3), 817-821 (1973).
8. Wicks, S. R., de Vries, C. J., van Luenen, H. G., Plasterk, R. H. CHE-3, a cytosolic dynein heavy chain, is required for sensory cilia structure and function in Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 221 (2), 295-307 (2000).
9. Jansen, G., Weinkove, D., Plasterk, R. H. A. The G-protein subunit gpc-1 of the nematode C. elegans is involved in taste adaptation. EMBO J. 21 (5), 986-994 (2002).
10. Srinivasan, J., et al. A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans. Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).
11. Choe, A., et al. Ascaroside signaling is widely conserved among nematodes. Curr Biol. 22 (9), 772-780 (2012).
12. Ezcurra, M., Tanizawa, Y., Swoboda, P., Schafer, W. R. Food sensitizes C. elegans avoidance behaviours through acute dopamine signalling. EMBO J. 30 (6), 1110-1122 (2011).
13. Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nat Neurosci. 11 (8), 916-922 (2008).
14. Kunitomo, H., et al. Concentration memory-dependent synaptic plasticity of a taste circuit regulates salt concentration chemotaxis in Caenorhabditis elegans. Nat Commun. 4, 2210 (2013).
15. Snow, J. J., et al. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).
16. Tobin, D. M., et al. Combinatorial expression of TRPV channel proteins defines their sensory functions and subcellular localization in C. elegans neurons. Neuron. 35 (2), 307-318 (2002).
17. Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans. Neuron. 21 (1), 203-214 (1998).
18. Sawin, E. R. Genetic and cellular analysis of modulated behaviors in Caenorhabditis elegans. , M.I.T. Cambridge, MA. (1996).
19. Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. The parallel worm tracker: A platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes. PLoS One. 3 (5), e2208 (2008).
20. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nat Methods. 8 (7), 592-598 (2011).

Tags

Behavior Nematode, Automatisert atferdsanalyse populasjonsbasert analyse kjemosensorisk preferanse neurobiologi