Automated Analysis of a Nematode Population-Based Chemosensory Preference Assay

Summary

Vi presenterar en uppspelningsuppställning och ett protokoll som möjliggör automatisk analys av nematoden, Caenorhabditis elegans 'preferens för lösliga föreningar i en populationbaserad analys. I denna artikel beskrivs konstruktionen av en beteendeskammare, beteendeanalysprotokollet och användningen av videoanalysprogram.

Abstract

Den nematod, Caenorhabditis elegans 'kompakta nervsystemet av endast 302 neuroner ligger till grund för en mångsidig repertoar av beteenden. För att underlätta dissektionen av neurala kretsar som ligger bakom dessa beteenden är utvecklingen av robusta och reproducerbara beteendeanalyser nödvändigt. Tidigare C. elegans beteendestudier har använt variationer av ett "dropptest", en "kemotaxisanalys" och en "retentionsanalys" för att undersöka responsen av C. elegans till lösliga föreningar. Metoden som beskrivs i denna artikel syftar till att kombinera de komplementära styrkorna hos de tre ovannämnda analyserna. I korthet är en liten cirkel i mitten av varje analysplatta uppdelad i fyra kvadranter med kontrollen och experimentella lösningar placeras växelvis. Efter tillsatsen av maskarna laddas analysplattorna i en beteendekammare där mikroskopkameror registrerar maskarnas möten med de behandlade områdena. Automatiserad videoanalys utförs sedan aNd ett preferensindex (PI) -värde för varje video genereras. Videoinsamlingen och automatiserade analysfunktioner i denna metod minimerar experimentets engagemang och eventuella associerade fel. Vidare används små mängder av experimentföreningen per analys och beteendekammarens multikamera-inställning ökar experimentell genomströmning. Denna metod är särskilt användbar för att utföra beteendesskärmar av genetiska mutanter och nya kemiska föreningar. Denna metod är emellertid inte lämplig för studier av stimulusgradientnavigering på grund av närhet av kontroll- och experimentella lösningsområdena. Det ska inte användas när endast en liten population av maskar är tillgänglig. Medan det är lämpligt att analysera svar endast på lösliga föreningar i sin nuvarande form, kan denna metod lätt modifieras för att rymma multimodal sensorisk interaktion och optogenetiska studier. Denna metod kan också anpassas för att analysera de kemosensoriska svaren hos andra nematodarter.

Introduction

Foderdjur måste integrera ingångar från flera sensoriska modaliteter och välja lämpliga beteendestrategier för att lyckas navigera i sin miljö. Förstå hur externa sensoriska ingångar tas emot och omvandlas till neural information för att styra åtgärdsval är ett centralt mål inom neurobiologi. Den genetiskt skurbara nematoden, C. elegans , är en attraktiv modellorganisme för att studera neurala mekanismer som ligger bakom sensorisk biologi och multimodal integration. Även om C. elegans har endast 302 neuroner kan den upptäcka och diskriminera mellan en mängd olika miljöstimuler inklusive lösliga föreningar, flyktiga luktmedel och omgivande temperatur ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7} . DeNematode C. elegans är starkt beroende av sin kemosensoriska apparat för att lokalisera livsmedelskällor och att varna sig för potentiella hot. Sålunda spelar beteendeanalyser som utformats för att skärma svaren av vildtyp och mutant C. elegans till kemiska stimuli en avgörande roll för att dissekera de genetiska, cellulära och neurala mekanismerna som ligger till grund för C. elegans anmärkningsvärda sensoriska förmåga.

För att analysera svaret på lösliga föreningar har tre typer av analyser beskrivits - dropptestet, kemotaxisanalysen och retentionsanalysen. I dropptestet placeras en liten droppe av föreningen i svansen på en rörlig mask och maskens beslut att vända eller flytta framåt när vätskan når den främre sensoriska apparaten är poäng ⁴ . Dropptestet kräver liten experimentell beredning och är användbar när maskstorlekens provstorlek är liten, som i fallet med laserstyrda maskar. Men som en enda maskKan analyseras i taget och experimenten måste vara närvarande under hela analysens varaktighet, kan dropptestet vara tidskrävande. Dropptestet är också sårbart för variationer i droppleverans mellan varje mask i ett prov, vilket kan påverka det totala resultatet av analysen. En annan begränsning av dropptestet är att den endast kan användas för att analysera maskens svar på aversiva föreningar, eftersom det inte är möjligt att diskriminera mellan en attraktiv eller neutral effekt av föreningen från maskens framåtriktade rörelse.

Kemotaxisanalysen för lösliga föreningar innefattar allmänt att en agarplatta delas in i fyra kvadranter, varvid den experimentella lösningen blandas i agar av två motstående kvadranter och kontrolllösningen blandas i de andra två kvadranterna ^{8 , 9} . Vid analysens början placeras en droppe buffert innehållande maskar i mitten av plattan och antalet maskar i Varje kvadrant görs på olika tidspunkter. Chemotaxis-analysen ger större statistisk effekt jämfört med dropptestet, eftersom ett stort antal maskar testas vid varje analys. En begränsning av denna metod är emellertid att beredning av kemotaxisanalysplattorna kräver stora mängder av experimentföreningen. Detta kommer att göra det svårt att genomföra storskaliga beteendesskärmar om en komplicerad reningsprocess med begränsade utbyten erfordras för erhållande av föreningen av intresse, som i fallet med askarosidsignalmolekylerna ¹⁰ . Dessutom är manuell räkning av maskar genom analysen mottaglig för fel och störningen av plattorna under räkningsprocessen kan påverka resultatet.

Till skillnad från de två ovannämnda metoderna utnyttjar retentionsanalysen maskinsyn som minimerar fel under scoringprocessen och reducerar experimentens interferens under analysen > 11. Datoriserad analys av videoinspelningar av maskbeteende kan också potentiellt avslöja subtilt beteendynamik som missas när scoring endast utförs på några diskreta tidspunkter. I retentionsanalysen läggs två lösningsfläckar på motsatta sidor av en liten cirkulär bakteriell matplåster följt av placeringen av ett litet antal maskar i mitten av matplåstret. Ormarnas beteende registreras sedan videoinspelat, analyseras och ett preferensindexvärde beräknas baserat på det totala antalet maskpixlar i varje lösningsområde. Fastän närvaron av en attraktiv matplåster möjliggör mindre populationer av maskar att användas i varje analys har mat tidigare visat sig sensibilisera undvikande beteenden till lösliga repellanter ¹² . Vidare uppvisar maskar ett fotofobiskt svar på kortvåglängdsljus och användningen av mikroskopljuskällor som avger vitt ljus i uppspelningsregistreringsuppställningen kan påverka beteendetS = "xref"> 13.

Syftet med metoden som diskuteras i denna artikel är att registrera och analysera C. elegans preferens för lösliga föreningar med användning av en populationbaserad analys. För detta ändamål integreras och förbättras den nuvarande metoden på aspekter från samtliga tre av de tidigare diskuterade metoderna. Det gör att stora populationer av maskar kan testas och kräver endast små mängder av den experimentella lösningen som ska användas i varje analys. Dessutom utförs analysen inom en specialbyggd sluten beteendekammare med infraröd LED-bakgrundsbelysning för att minimera effekterna av kortvåglängdsljus på beteende. Varje kammare kan också vara utrustad med flera mikroskopkameror, vilket ökar experimentell genomströmning utan att kompromissa med bänkutrymmet. Slutligen matar videoanalysprogrammen preferensindexvärdet för varje video samt en åtföljande maskbeläggningsplan för att visualisera befolkningsbeteendynamiken över tiden. Kammarinstallationen och aSsay-protokollet kan modifieras ytterligare för att studera multimodala beteendesvar, såsom effekten av luktmedel eller temperatur på kemosensoriska beteenden.

Denna artikel beskriver konstruktionen av beteendekammaren och analysprotokollet. Det visar också nyttan av denna metod vid analys av svaret av vildtypsmaskar och kemosensoriska defekta mutanter till den kända lösliga repellanten, kopparjoner ⁴ . Slutligen är videoanalysprocessen som använder den medföljande mjukvaran detaljerad.

Protocol

1. Uppförande av församlingskammaren

ANMÄRKNING: Uppförandekammaren består av en ungefär kubformad ram gjord av strängsprutade aluminiumstänger, täckta med ogenomskinliga tygluckor, med en klar akrylbotten och kamerastöd. Samband mellan de strängsprutade aluminiumstängerna som bildar beteendekammaren är alla vinkelräta och är fastsatta med "L" -formade hörnfästen (1 tum breda med 1 tum ben) som fäster ett hörnbeslagsben till varje stång med skruvar och inskjutning T-muttrar. Varje fog är fäst med antingen en eller två hörnfästen som beskrivs nedan. Tygluckorna över kammaren är fästa på aluminiumramstängerna med samma skruvar och inskjutna T-muttrar men genom grommets i tygens hörn. Skruvarna sitter ordentligt i den nedtonade sidan av glid-in-muttrarna, inte i sidan med den utskjutande läppen. När du monterar en skruv / T-mutter fästelement till en aluminiumstång, skjut du T-muttern i kanalenPå lämpligt ansikte av stången med skruvhuvudet som sticker ut ur slitsen.

1. Förbered tygluckor.
   1. Använd sax för att skära fem stycken av det ogenomskinliga polyestertyget för att täcka kammarens övre och fyra sidor.
      1. Klipp en kvadrat 14 x 14 tum ² ark av tyg för kammarens överdel. Klipp fyra rektangulära 11 x 14 tum ² ark tyg till sidorna av kammaren.
   2. Installera grommets i hörnen av tyget.
      1. Markera en referenslinje 0,5 tum från varje kant av alla fem polyestertygplattor med hjälp av en penna och rak.
      2. För de fyra rektangulära plåtarna, använd gummitång för att sätta in grommets centrerade där penna linjer skärs i varje hörn (det vill säga 4 grommets per ark).
      3. För kvadratplåten sätter du in två grommar längs varje kant med varje grommet centrerat på pennlinjen och placerat 1,5 tum från slutet av var och en avDe fyra penna linjerna (det vill säga 8 grommets totalt, två nära varje hörn).
   3. Sätt i en skruv i varje hålhål och löst fäst en T-mutter på vardera.
2. Tillverka kamerafäste.
   1. Använd en bandsåg eller motsvarande för att klippa en 2-tums lång bit av aluminiumsträngsprutningsstång för varje kamera, så att den sneda änden av stången är vinkelrätt mot stånglängden för att underlätta senare montering.
   2. Använd en borrpress med en borrbit med en diameter på 0,25 tum för att borra ett hål genom centrumbanorna på varje kamerafäste, 0,75 tum från den ena änden, så att hålet är vinkelrätt mot topp- och bottenytorna och passerar genom barens mittlinje . Eventuellt borra hålet med en handhållen elektrisk borr med en 0,25 tum borr, men se till att hålet är vinkelrätt mot barens övre och nedre yta.
3. Förbered alla hörnfästen.
   1. Sätt i en skruv genom hålet iVarje hörnbeslag, lägg in skruven från insidan av vinkelsidan. Torka löst en T-mutter på varje skruv.
4. Förbered kamerafästeheten ( Figur 1B , lager 2).
   OBS! Kamerafästeheten är en "H" -formad montering som stöder de tre kamerahölsterna.
   1. Montera kamerans monteringsstänger i mittfältet på kamerabeslaget.
      1. Placera de tre kamerafäste som tillverkats i steg 1.2 med de borrade hålen orienterade vertikalt. Skjut två hörnfästen på sidorna av varje monteringsstång vid slutet längst bort från det borrade hålet.
      2. Placera hörnfästet med fästbenen i spetsen med barens ände och dra åt skruvarna för att fästa på plats. Detta bildar en "T" form med det borrade hålet längst ner på "T".
      3. Lägg en 1-fots aluminium extrusion på arbetsytan. Skjut in T-muttrarna i en kamerafästareMbly (från föregående steg) på ena sidan av 1 fotstången. Centrera monteringsfältet längs 1 fotstångens längd och dra åt skruvarna för att fästa dem på plats. Skjut de andra två monteringsstängerna på motsatt sida av 1 fotstången.
      4. Placera de två staplarna jämntstående från mitten av 1 fotstången, med sina inre hörnfästen ca 2,5 tum från varandra. Skjut in hörnkonsolerna på sidorna av 1 fotstången, två i varje ände av stapeln. Placera hörnkonsolerna med fästbenen i spetsen med ändarna på stången och dra åt skruvarna för att fästa på plats.
   2. Fäst ändstängerna till mittfältet.
      1. Slip två 1-fots aluminiumprofiler på T-muttrarna vid vardera änden av aggregatet från föregående steg som bildar en "H" -form. Centrera varje ändstång på mittstången och säkra genom att dra åt de fyra skruvarna.
      2. Skjut fyra hörnfästen på toppen av de två ändfält som läggs till i föregående steg, en i varje ändeAv varje stapel. Placera hörnhakarna med fästbenen i spolarna med ändarna av staplarna och dra åt skruvarna för att fästa dem på plats.
   3. Fäst kamerahållare och hölster på kamerabesluten.
      1. För var och en av de tre mikroskopkamerahållarna, ta bort kamerans hölster genom att lossa tumskruven och glida av stativet.
      2. Placera en tvättmaskin på en rundskruv för varje kamerafästbalk (fäst i centrumhålet på "H"), skruva skruven upp genom det borrade hålet i kamerafästet och placera en annan bricka ner över skruven . Dra i det kappade hålet på kamerans stång ner på skruven och dra åt det säkert mot kamerans monteringsfält.
      3. Upprepa steg 14.3.2 för de andra två kamerafäste.
      4. Skjut en kamerahölster på varje kamerahållarstång med den bredare öppningen orienterad mot kamerans monteringsstång och skruv. Håll hölsteret tillfälligt i kamerans räkning rOd med hölsterens tumskruv.
         OBS: Det slutliga driftsläget ställs in i avsnitt 2.
5. Montera uppförandekammarramen ( Figur 1A ).
   OBS! För att underlätta konstruktionen, montera ramen upp och ner, börja med "överst" av kammarens ram på arbetsytan ( Figur 1B , lager 1) och arbeta uppåt mot "fötterna" på ramen ( Figur 1B , lager 3).
   1. För att montera det övre skiktet på beteendet, montera fyra fyrfotade strängsprutade aluminiumstänger på plåsterpolyesterplattan ( Figur 1B , skikt 1).
      1. Skjut en stapel på de två T-muttrarna längs varje kant av tygplattan, centrerar stången längs tygets bredd. Dra åt fästena för att fästa tygbladet på varje stapel.
      2. Sprid den plana polyesterplattan på arbetsytan wiDe fyra bifogade aluminiumstavarna ovanpå. Skjut åt åtta hörnfästen på de fyra aluminiumstängernas övre ytor, en i varje ände av varje stång. Placera hörnkonsolerna på staplarna med fästenes vertikala ben i spolarna med ändarna av staplarna. Skruva fast skruvarna i T-muttrarna.
   2. I tur och ordning på varje hörn står en extra 1-fots aluminiumsträngsprutning upprätt, glidande strängsprutningen över T-muttrarna på de två hörnbeslagens ben.
   3. Skruva upp den upprättstående stången till de horisontella stängerna genom att dra åt fästorganen, så att de förenas med de två intilliggande horisontella stängerna.
      OBS! När de är färdiga kommer de åtta strängarna (fyra horisontella och fyra vertikala) att bilda en fyrkantig ring på bordet med fyra inlägg som sticker uppåt ( figur 1B , lager 1).
   4. Skjut de lösa T-muttrarna i den "H" -formade kamerafästeheten från avsnitt 1.4 ner i stativets stolpar från föregående steg. Låt "H & #34; Glid hela vägen ner för att vila ovanpå hörnfästet vid varje hörn av ramen. Säkra kamerans monteringsenhet på plats genom att dra åt de fyra hörnskruvarna.
   5. Montera kammarens bottenskikt med hjälp av de sista fyra 1 fot extruderade aluminiumstavarna ( Figur IB , skikt 3).
      1. Skjut in en hörnkonsol på varje ände av varje 1-fots-stång, placera hörnkonsolerna med fästbenen i spetsen med ändarna på stången och dra åt skruvarna för att fästa på plats.
      2. Lossa staplarna ner mellan ramen uppåt med de lösa T-muttrarna i upprättarnas kanaler. Placera staplarna så att de övre kanterna på hörnfästet är 1 tum under den öppna änden av stolarna och säkra på plats genom att dra åt skruvarna på hörnfästet.
6. Skjut T-muttrarna i de fyra rektangulära polyesterplåten ner i kanalerna på de upprättstående strängsprutbalkarna för att täcka sidorna av kammenR och dra åt fästena för att fästa på plats.
7. Välj en sida för att vara en dörr för att komma in i kammarens inre och ta bort de två skruvarna och T-muttrarna i kammarens bottenskikt.
   OBSERVERA: När rammen är upprätt, hänger botten på det här höljet lös längst ner och kan lyftas för att komma åt kammarens inredning.
8. Placera ett plastlock på den övre änden av varje hörnelement för att fungera som fötter för den färdiga ramen. Vrid rammen åt höger uppåt. Sätt i två panelhållare per sida inuti ramens baslager och vrid för att fästa dem på plats ( Figur 1B , lager 3). Placera en 12 x 12 tum ² stycken klar akryl ovanpå panelhållarna för att ge ett steg för analysplattor ( Figur 1B , skikt 3).

2. Kamera- och scenmallpositionering

1. Ladda ner och installera programvaran för mikroskopkamera-videoinsamling på datornFrån tillverkarens hemsida.
2. Skjut in en mikroskopkamera i var och en av de tre kamerahölsterna med kamerans optik pekade ner mot akrylsteget och bakgrundsbelysningen. Anslut kamerorna till datorns USB-portar. Placera den infraröda LED-bakgrundsbelysningspanelen under ramen, centrerar under scenen. Anslut bakgrundsbelysningspanelen för att sätta på.
3. Skriv ut de medföljande lösningarna för placering och plåtjustering på transparensark (se kompletterande fil ).
   OBS! På lösningsplaceringsmallen är plattans perimetercirkel 3,8 cm i diameter och den inre regionen av räntecirkeln är 0,9 cm i diameter.
4. Klipp längs gridlinjerna för att få rektangulära transparensdelar som omger de cirkulära mallarna.
5. Starta programvaran för videoinsamling och klicka på numrerade miniatyrer längst upp i fönstret för att visa kamerans flöden.
6. Justera mikroskopkamerajustering och förstoring.
7. Placera en plattajusteringsmall under en mikroskopkameraobjektiv ( Figur 2B ).
8. Ändra arbetsavståndet genom vertikalt glidning av kamerans hölster längs kamerans hållarstång och justera kamerans förstoring genom att rotera kamerans förstoringsratt tills mallens nummermarkeringar syns tydligt vid kanterna av kamerans synvinkel.
9. Tape plattformsjusteringsmallen till akrylsteget.
10. Placera en provplatta med maskar på plattformsjusteringsmallen under mikroskopkameraet och förfinera förstärknings- och arbetsavståndet tills en skarp bild av maskarna uppnås, samtidigt som nummermarkörerna hålls kvar inom synvinkeln.
11. Upprepa steg 2.6.1-2.6.4 för de andra två mikroskopkamerorna.

3. Nematodtillväxt och synkronisering

1. Fyra dagar före experimenten, utsäde tjugofyra 60 mmAgarplattor med Nematod Growth Media (NGM) med 50 μl OP50 Escherichia coli i Luria-Bertani (LB) buljong (se avsnitt 5 för recept).
   OBS! Varje 60-mm-tallrik ger tillräckligt med maskar för en analysplatta. Att erhålla sex replikat per behandling eller genotyp rekommenderas.
2. Låt de pläterade plattorna torka upprätt med lock på natten över natten vid rumstemperatur.
3. Nästa dag, överför femton välmälda, gravida hermafroditer på varje utsäde och tillåta maskar att lägga ägg i sex timmar. Detta kommer att ge> 360 ägg per platta.
4. Efter 6 timmar avlägsnas maskar från fröplattor och låt avkomma växa i tre dagar till vuxna vid 20 ° C.

4. Kemosensory Preference Assay

1. Dagen innan försöket bereder 35 mm NGM agaranalysplattor.
   1. Förbered 250 ml NGM-agar (se avsnitt 5 för recept).
   2. Ordna tjugoåtta tomma 35 mm plattor i staplar om fem eller mindre på en platt srface. Fyll varje analysplatta med 5 ml NGM-agar. Låt analysplattorna torka upprätt med lock på natten över natten vid rumstemperatur.
      OBS! Som en tumregel, förbered en ytterligare analysplatta för varje behandling eller genotyp som ska analyseras vid händelser.
2. På experimentdagen ska du slå på bakgrundsbelysningen, starta datorn och starta programvaran för mikroskopkamerainspelning.
3. Anslut en mikroskopkamera till datorn och justera inställningarna för videoinspelning.
   1. Klicka på den numeriska kamerat miniatyrbilden överst i programfönstret för att visa kamerans live-flöde.
   2. Dra ner menyn "Videoformat" längst upp till vänster på kameraflödet och välj "MJPG 1280 x 1024". Dra ner menyn "Mapp" bredvid menyn "Videoformat" och välj en mapp för att spara videofilerna.
   3. Klicka på ikonen "Auto exponering" längst upp till höger påKameran matar in och stänger av automatisk exponering. Klicka på ikonen "LED" direkt till höger om ikonen "Auto exponering" för att stänga av de inbyggda mikroskopkamera-lysdioderna. Klicka på den intilliggande ikonen Inställningar: Välj 'Monokrom', maximera 'Kontrast' och justera 'Ljusstyrka' tills maskar verkar skilja sig från bakgrunden.
4. Skaffa kalibreringsvideor.
   1. Rikta in en lösning-placeringsmall ovanpå en scenplattjusteringsmall ( Figur 2A ). Klicka på inspelningsikonet "Time-Lapsed Video" på vänster sida av kameraflödet och skriv 5 's för varaktighet och' 1 's för intervall för att spela in en 5 s-video vid 1 bildrutor / s. Klicka på "Start" för att starta videoinspelning.
5. Upprepa steg i 4.3 och 4.4 för de andra två mikroskopkamerorna.
6. Ta bort lösningsplaceringsmallen från kammaren.
8. Använd en 5 ml glaspipett för att tillsätta 1,2 ml NGM-buffert till en platta synkroniserade maskar och agitera försiktigt plattan för att förskjuta ormarna i bufferten. Pipettera upp bufferten från plattan och ge ut maskar i bufferten i ett rent mikrocentrifugrör.
   OBS: Maskor är känsliga för avvikelser från deras odlingsagar-koncentration ¹⁴ . För att minimera förändringar i agarsaltkoncentration efter maskplacering rekommenderas NGM-buffert för tvättprocessen (se avsnitt 5 för recept). Använd inte plastpipetter för att avlägsna maskar från plattor, eftersom maskar kommer att hålla fast vid sidorna. Förbered ett ekvivalent antal rör som antalet analysplattor som ska köras samtidigt.
9. Låt de tre rören stå i 1-2 minuter för att tillåta maskar att slå sig ner i botten. Använd en pipettspets för att avlägsna så mycket tvättbuffert från rören som möjligt utan att störa aggregatets pelletsEd maskar i botten av rören. Påfyll rören med 1 ml ren NGM buffert vardera.
10. Upprepa steg 4.7.2 en gång.

Lägga till 10 mM CuCl ₂ och M13-buffertlösningar för att analysera plattor (se avsnitt 5 för recept).

1. Tape en lösning-placeringsmall ovanpå scenen i dissekeringsmikroskopet.
2. Placera en remsa med dubbelsidigt tejp på vardera sidan av en plattajusteringsmall. Se till att tejpen överlappar plattans perimetercirkel men inte medför att inspelningsområdet är av intresse i mitten av mallen.
3. Rikta in mätplattans omkrets med cirkeln på plåtjusteringsmallen och tryck ner tills mallen klistrar fast på plattans botten. Rikta in markörerna för analysplattmallnummer med lösningsmedelsmallmarkörerna på dissekeringsmikroskopet.
4. Använd en P2-pipett och plastspets för att placera 1 μl av M13-bufferten vardera i kvadranter 1 och 4 ( CuCl2-lösning vardera i kvadranterna 2 och 3 (Figur 2A).
5. Upprepa steg 4.8.2-4.8.4 för de andra två analysplattorna.

När lösningen faller har absorberats fullständigt i agaren, använd en Pasteur-pipett för att överföra tvättade maskar från varje mikrocentrifugrör till motsvarande analysplatta.

Placera en droppe maskar vardera på området ovanför och under det cirkulärt behandlade området. Vik en vävnad fyra gånger och använd den luddiga kanten för att absorbera överflödig tvättbuffert på alla analysplattor.

Ordna omedelbart de tre analysplattorna under mikroskopkamerorna i beteendetrummet genom att anpassa numren i mallhjulen. Vänta i 2-3 minuter för att tillåta maskarna att acclimate till analysplattorna.
OBS! Se till att luckan för beteendekammarens lucka är stängd innan du börjar spela in i nästa steg.

Upprepa steg 4.7-4.12 för nästa runda analysplattor. Skaffa minst sex replikat eller två inspelningsrundor för varje behandling eller genotyp.

5. Reagensberedning

1. Förbered NGM agar och buffert.
   1. I en 1 L glasflaska sättes 1,5 g natriumklorid, 8,5 g agar och 1,25 g pepton. Tillsätt 500 ml destillerat vatten och en omrörningsstång till flaskan. Autoklavflaska med innehåll.
   2. Placera flaskan på en omröringsplatta och sätt på omrörningsfunktionen.
   3. Lägg i ordning med steril teknik: 0,5 ml 5 mg / ml kolesterol, 0,5 ml 1 M kalciumKlorid, 0,5 ml 1 M magnesiumsulfat och 12,5 ml 1 M kaliumfosfat.
   4. Upprepa steg 5.1.1 till 5.1.2 för att göra NGM-buffert men lämna agar och pepton i steg 5.1.1.
2. Förbered LB buljong.
   1. I en 1 L glasflaska sättes 5 g trypton, 2,5 g jästextrakt, 2,5 g natriumklorid, 500 ml destillerat vatten och 0,5 ml 1 N natriumhydroxid. Autoklavflaska med innehåll.
3. Förbered M13 buffert.
   1. I en 1 L glasflaska sättes 1,817 g Tris, 2,922 g natriumklorid, 0,373 g kaliumklorid och 500 ml destillerat vatten. Autoklavera flaskan med innehåll.
4. Förbered kopparklorid (CuCl ₂ ) lösning.
   1. Väg upp 0,134 g CuCl _2. Tillsätt löst till 10 ml M13-buffert i ett 15 ml plaströr för att göra 100 mM CuCl ₂ stamlösning. Vänd plaströret tills allt lösningsmedlet har dissolved.
   2. Använda en spruta och 0,2 | j, m membranfilter för att filtrera rena 100 mM _{CuCl2-lösning} i en ren 15 ml plaströr.
   3. För att göra 10 mM _{CuCl2-lösning,} tillsätt 900 | il av M13-buffert och 100 ul av 100 mM _CuCl2 stamlösning till ett mikrocentrifugrör. Invertera mikrocentrifugröret för att blanda väl.

6. Videoanalys

1. Ladda ner Python 3 (https://www.python.org/downloads/) och OpenCVs programbibliotek (http://opencv.org/downloads.html).
2. Ladda ner de tre Python-skripten för analys (https://github.com/WormLabCaltech/ResidentWorm).
   OBS! Se till att alla videofiler som ska användas är i mp4-format innan du fortsätter.
3. För att se funktionen och parameterbeskrivningarna, skriv "help (enter function name)" i konsolen och tryck på enter. Skriv till exempel "hjälp (kalibrering)" och tryck på Enter.
4. Kör kalibreringsfunktionenMed ingångsparametrar för att definiera de intressanta videoområdena (ROI).
   1. Ange filnamnet för kalibreringsvideoen som tas i avsnitt 4 för variabeln 'mp4filnamn'. Inkludera citattecken när du anger filnamnet.
   2. Börja med värdena 600 och 360 för variablerna "Q * x" och "Q * y". * Ange kvadrantnummer 1 till 4. Börja med värdet 310 för variabeln "rad". Justera variabelvärdena tills ROI-maskerna ligger i linje med kvadrantkonturerna på mallen.
   3. Spela in det totala antalet pixlar i varje avkastning som kommer att skrivas ut i konsolen vid utförandet av denna funktion. Ange detta värde för parametern "ROI_size" i preference_index-funktionen.
5. Utför tröskelkonstantfunktionen för att bestämma lämplig tröskelkonstant. Justera "konstant" -värdet tills maskarna (vita) syns tydligt och det finns minimal salt och peppar i bakgrunden (svart).
6. Utför preference_index-funktionen för att skapa ett csv-datablad, videoens preferensindex och den medföljande maskbeläggningsplanen.
   1. Använd "Q * x", "Q * y", "rad", "ROI_size" och "constant" värdena bestämda från steg 6.4 och 6.5 som inmatningsparametrar för preference_index-funktionen.
      OBS! För varje bildram brukar funktionen preference_index räkna antalet maskpixlar i varje avkastning och beräknar procentsatsen av maskpixlar av det totala antalet ROI-pixlar. Funktionen genererar sedan ett preferensindexvärde för varje videoram med hjälp av formeln:
      
      OBS! När programmet har analyserat alla ramar i videon genereras ett genomsnittligt preferensindexvärde för videon. En maskbeläggningsplot med videoens preferensindex tryckt högst upp och ett csv-datablad innehållandeMaskpixel, procentuella maskbeläggningsvärden och preferensindex för varje videoram kommer att sparas i den angivna mappen när programmet har slutförts.

Representative Results

Figur 3A visar preferensindexindexvärdena erhållna för olika genotyp- och behandlingsparningar. Ett preferensindexvärde på 1 indikerar stark attraktion för lösningen placerad i experimentell ROI medan ett preferensindexvärde på -1 indikerar stark avstängning. Ett preferensindex på 0,02 erhölls när M13-buffertlösningen placerades i både kontroll- och experimentella ROI, vilket demonstrerade att det inte finns någon rumlig bias mot antingen ROI. N2-maskar undviker starkt kopparjonerna, vilket resulterar i ett preferensindex på -0,67, vilket bekräftar tidigare upptäckter att kopparjoner är en stark repellant ( Supplementary Movie 1 ) ⁴ . Osm-3- mutanter, som saknar korrekt bildning av de distala segmenten av sensoriska ciliärer, visade en signifikant minskad undvikande av kopparjoner (PI = -0,19) ¹⁵ . Ocr-2 mutanter, vilka är de Fektiv i många ASH-medierade nociceptiva svar, inklusive kopparundvikande, uppvisar också signifikant minskad undvikande och till och med viss mild attraktion för kopparjoner (PI = 0,19) ( Supplementary Movie 2 ) ¹⁶ .

Figur 3B visar representativa maskbeläggningsplaner, vilka indikerar maskintätheten i kontrollen jämfört med de experimentella ROI-värdena över tiden i varje video. Ju mörkare färgen på diagramområdet, desto större antal maskpixlar i avkastningen. Beläggningsplanen för N2-maskar behandlade med M13-buffertkontrollen visar att antalet maskar i båda avkastningarna förblir likartade genom analysen. Emellertid visar beläggningsplanen för N2-maskar behandlade med kopparjoner att maskarna starkt och konsekvent undviker det experimentella ROI genom analysen.

Gimg "src =" / files / ftp_upload / 55963 / 55963fig1.jpg "/>
Figur 1: Bild och schematisk representation av beteendekammardesign. ( A ) Framifrån av uppställningskammarens inställning (vänster) och motsvarande schematisk representation av kammarramen (höger). Opaka polyesterplåtar täcker kammaren på alla ansikten, undre bottenytan, vilket möjliggör ljus genom den infraröda bakgrundsbelysningspanelen. Nummerna 1, 2 och 3 motsvarar strängsprutningsskikten i (B). ( B ) Schematisk överifrån av extruderingsskikten innefattande beteendekammarramen. Detta inkluderar toppskiktet (1), det mellersta kamerafästmonteringsskiktet (2) och bottenskiktskiktet (3). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Lösningar-placering och Plate-alignment Mallar. ( A ) Lösningsmedelsmallen har fyra kvadranter och nummerjusteringsmarkörer. Kontrolllösningen placeras i övre vänstra och nedre höger kvadranten medan experimentell lösning placeras i övre högra och nedre vänstra kvadranter. ( B ) Plattjusteringsmallen har endast nummerjusteringsmarkörer för att minimera ocklusion av maskarna i synfältet under videoinspelning och analys. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3: Exempel data samlad med hjälp av denna analys. ( A ) Preference Index (PI) värden för vildtyp N2 och mutant C. elegans m> som svar på M13-buffert och 10 mM _CuCl2. N2-maskar visade ingen preferens mellan kontroll och experimentella ROI när M13-kontrolllösningen placerades i båda ROI men undviker kraftigt experimentell ROI när kopparjoner placerades i den (PI = 0,02 respektive -0,67). Osm-3 (p802) -mutanter och ocr-2 (ak47) -mutanter visade signifikant minskad undvikande av kopparjoner jämfört med N2 (PI = -0,1 respektive 0,2). N = 6 analyser för varje genotypbehandlingsparning,> 360 maskar per analys, felstavlar indikerar ± 1 SEM, *** p <0,001, envägs ANOVA följt av post-hoc Tukey Honestly Significant Difference (HSD) test. ( B ) Representativa maskbesättningar för N2-maskar med M13-buffert i både ROI (topp) och N2-maskar med M13-buffert i kontroll ROI och kopparjoner i experimentell ROI (botten). Färgskalan under varje beläggningsplot representerar antalet maskpixlar.Pload / 55963 / 55963fig3large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande film 1: Behavioral respons av N2-maskar till 10 mM kopparklorid. Ormar lockas till kontrollkvadranterna med M13-bufferten (övre vänstra och nedre höger), men undviker starkt kvadranterna som innehåller kopparjoner upplösta i M13-bufferten (övre högra och nedre vänster). Videoen spelades in med 1 bild per sekund och sped upp 15x. Vänligen klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande film 2: Beteenderespons av ocr-2 (ak47) maskar till 10 mM kopparklorid. Ormar strömmar i ungefär lika stor utsträckning i båda kontrollkvadranterna med M13-bufferten (övre vänster och nedre höger) och kvadrantenS innehållande kopparjoner upplöst i M13-buffert (övre högra och nedre vänster) under hela inspelningsperioden. Mutanterna uppvisar en liten preferens för kvadranterna innehållande kopparjoner vid början av inspelningen. Videoen spelades in med 1 bild per sekund och sped upp 15x. Vänligen klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil: Lösning-placering och Plate-alignment Mallar. Vänligen klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Ett kritiskt steg i protokollet är att försäkra sig om att analysplattorna har en jämn torrhet över olika experimentella dagar. Olika torrnivåer resulterar i olika diffusionshastigheter för lösningen i agar och följaktligen variationer i beteendeutfall. Analysplattor bör därför alltid göras färsk på eftermiddagen före experiment. Antalet maskar som testas per analys bör också regleras för att underlätta jämförelsen mellan behandlingar. Som referens lägger en vildtypsmask 4-10 ägg / h i genomsnitt som ger 360 maskar per analys om ormsynkroniseringsprotokollet ovan följs ¹⁷ . Om vissa mutantstammar är äggläggande defekta, välj mer gravida vuxna maskar för äggläggning för att nå målantalet avkomma. Ett annat viktigt steg i protokollet är att hantera maskar försiktigt under tvättprocessen och maskplaceringen. Ormar är känsliga för mekaniska stimuli, vilket framkallar stressresponser en sådan S reverseringar och äggläggningsinhibering ¹⁸ . Vidare bör man se till att avkastningen definieras exakt och för att bestämma det optimala tröskelkonstantvärdet för specifika ljusförhållanden innan man går vidare med videoanalysen. Det rekommenderas också att kalibrerings- och tröskelprocesserna upprepas om en längre tidsperiod har gått sedan det senaste experimentet kördes.

En begränsning av denna metod är att den inte är lämplig för att analysera små maskpopulationer. Om lämpliga kontroller för att bestämma inflytandet av närvaro av mat på det sensoriska beteendet utförs, är det emellertid möjligt att utnyttja mat för att begränsa maskens rumsförforskande plats såsom i retentionsanalysen med denna inställning. Dessutom är denna metod inte avsedd att studera stimulansgradientnavigering på grund av närheten och små mängder av kontroll- och experimentella lösningsdroppar som används.

E_content "> I framtiden kan programmeringsprogramvaran som möjliggör spårning av flera maskar och extraktionsmoment med extraordinära funktioner integreras i detta system ^{19 , 20.} Inspelning av subtila beteendeparametrar för enkelmaskuppförande som omkastningshastigheter och amplitud av kroppsböjningar kommer att ge En mer detaljerad bild av en enskild masks kemosensoriskt beteende i samband med en populationbaserad analys. Analysen kan också modifieras för att studera omvårdnad genom att köra hål genom ROI med hjälp av sprutnålar med lämplig mätstorlek och fylla hålen med agarinfunderad Med försöksföreningen eller kontrollbufferten. Detta kommer att säkerställa en mer konsekvent ytkoncentration av föreningen under en längre tid av inspelningstiden, vilket är nödvändigt vid provningsstudier. En annan potentiell tillämpning av denna metod är att genomföra jämförande beteendestudier över olika nematodsarter. Dessutom uppförandekammarenKan modifieras på flera sätt för att studera beteendemässiga svar på multimodala stimuli. För optogenetiska applikationer kan högintensiva LED-arrays anslutas bredvid kamerafästet för att selektivt aktivera neuroner av intresse under analysen. Värmeelement, kylsystem och temperaturgivare kan också läggas till inställningen för att studera temperaturens effekter på sensoriska beteenden. Dessutom kan luktleveranssystem installeras inuti kammaren för att undersöka växelverkan mellan luktsensor och kemosensoriska modaliteter.

Disclosures

Författarna har ingenting att avslöja.

Acknowledgments

Några stammar tillhandahölls av Caenorhabditis Genetics Center (CGC), som finansieras av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Detta arbete stöds av Howard Hughes Medical Institute, med vilket PWS är en utredare.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum T-slotted framing extrusions	McMaster-Carr	47065T101	Single profile, 1" size, solid
Brackets	McMaster-Carr	47065T236	1" long for 1" high single profile extrusions
Compact end-feed fasteners	McMaster-Carr	47065T139	1" (single), pack of 4
Twist-in solid panel holders	McMaster-Carr	47065T251	For 1" high extrusion
Plastic end caps	McMaster-Carr	47065T91	For 1" high extrusion
Optically clear cast acrylic sheet	McMaster-Carr	8560K211	3/16" thick, 12" x 12"
Vinyl-coated polyester fabric	McMaster-Carr	88505K57	0.027" thick, 61" width, black
Brass grommets	McMaster-Carr	9604K22	Trade size 0, 0.545" outer diameter
Steel washers	McMaster-Carr	90107A029	1/4" screw size
Rounded head screws	McMaster-Carr	90272A546	1/4" - 20 thread size, 1 - 1/2" long
Standard operating backlight	Smart Vision Lights	See local vendor	8" x 8", infrared 850 nm
IVP-C1 Variable Control Pot	Smart Vision Lights	See local vendor
T1 Power Supply	Smart Vision Lights	See local vendor
Dino lite Pro AM4113T	Dino-Lite Digital Microscope	See local vendor
MS09B microscope stand	Dino-Lite Digital Microscope	See local vendor

References

1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314, 1-340 (1986).
2. Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).
3. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
4. Hilliard, M. A., Bargmann, C. I., Bazzicalupo, P. C. elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail. Curr Biol. 12 (9), 730-734 (2002).
5. Hilliard, M. A., Bergamasco, C., Arbucci, S., Plasterk, R. H., Bazzicalupo, P. Worms taste bitter: ASH neurons, QUI-1, GPA-3 and ODR-3 mediate quinine avoidance in Caenorhabditis elegans. EMBO J. 23 (5), 1101-1111 (2004).
6. Zariwala, H. A., Miller, A. C., Faumont, S., Lockery, S. R. Step response analysis of thermotaxis in Caenorhabditis elegans. J Neurosci. 23 (10), 4369-4377 (2003).
7. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 70 (3), 817-821 (1973).
8. Wicks, S. R., de Vries, C. J., van Luenen, H. G., Plasterk, R. H. CHE-3, a cytosolic dynein heavy chain, is required for sensory cilia structure and function in Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 221 (2), 295-307 (2000).
9. Jansen, G., Weinkove, D., Plasterk, R. H. A. The G-protein subunit gpc-1 of the nematode C. elegans is involved in taste adaptation. EMBO J. 21 (5), 986-994 (2002).
10. Srinivasan, J., et al. A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans. Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).
11. Choe, A., et al. Ascaroside signaling is widely conserved among nematodes. Curr Biol. 22 (9), 772-780 (2012).
12. Ezcurra, M., Tanizawa, Y., Swoboda, P., Schafer, W. R. Food sensitizes C. elegans avoidance behaviours through acute dopamine signalling. EMBO J. 30 (6), 1110-1122 (2011).
13. Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nat Neurosci. 11 (8), 916-922 (2008).
14. Kunitomo, H., et al. Concentration memory-dependent synaptic plasticity of a taste circuit regulates salt concentration chemotaxis in Caenorhabditis elegans. Nat Commun. 4, 2210 (2013).
15. Snow, J. J., et al. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).
16. Tobin, D. M., et al. Combinatorial expression of TRPV channel proteins defines their sensory functions and subcellular localization in C. elegans neurons. Neuron. 35 (2), 307-318 (2002).
17. Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans. Neuron. 21 (1), 203-214 (1998).
18. Sawin, E. R. Genetic and cellular analysis of modulated behaviors in Caenorhabditis elegans. , M.I.T. Cambridge, MA. (1996).
19. Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. The parallel worm tracker: A platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes. PLoS One. 3 (5), e2208 (2008).
20. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nat Methods. 8 (7), 592-598 (2011).

Tags

Beteende Utgåva 125 Nematod, Automatiserad beteendeanalys populationbaserad analys kemosensorisk preferens neurobiologi