نقدم إعداد تسجيل السلوك والبروتوكول الذي يتيح التحليل الآلي من الديدان الخيطية، تفضيل كاينورهابديتيس ايليجانس "للمركبات القابلة للذوبان في مقايسة سكانية. توضح هذه المقالة بناء غرفة السلوك، بروتوكول الفحص السلوكي، واستخدام برامج تحليل الفيديو.
النيماتودا، كاينورهابديتيس ايليجانس 'الجهاز العصبي المضغوط من 302 الخلايا العصبية فقط يكمن ذخيرة متنوعة من السلوكيات. لتسهيل تشريح الدوائر العصبية الكامنة وراء هذه السلوكيات، وتطوير المقايسات السلوكية قوية وقابلة للتكرار ضروري. السابق C. وقد استخدمت الدراسات السلوكية ايليجانس الاختلافات من "اختبار السقوط"، "فحص الكيميائي"، و "فحص الاحتفاظ" للتحقيق في استجابة C. ايليجانس إلى المركبات القابلة للذوبان. الطريقة الموصوفة في هذه المقالة تسعى إلى الجمع بين نقاط القوة التكميلية من المقايسات الثلاثة المذكورة أعلاه. لفترة وجيزة، وتنقسم دائرة صغيرة في منتصف كل لوحة فحص إلى أربعة أرباع مع السيطرة والحلول التجريبية وضعت بالتناوب. بعد إضافة الديدان، يتم تحميل لوحات الفحص في غرفة السلوك حيث كاميرات المجهر تسجيل لقاءات الديدان مع المناطق المعالجة. ثم يتم إجراء تحليل الفيديو الآليويتم إنشاء قيمة مؤشر التفضيل (بي) لكل مقطع فيديو. اقتناء الفيديو وميزات التحليل الآلي لهذه الطريقة يقلل من مشاركة المجرب وأي أخطاء المرتبطة بها. وعلاوة على ذلك، يتم استخدام كميات دقيقة من المجمع التجريبي لكل مقايسة ويزيد الإعداد كاميرا متعددة غرفة السلوك الإنتاجية التجريبية. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لإجراء الشاشات السلوكية من المسوخ الوراثية والمركبات الكيميائية الجديدة. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة ليست مناسبة لدراسة التحفيز التدرج الملاحة نظرا لقربها من مناطق السيطرة والتحكم التجريبية. وينبغي أيضا أن لا تستخدم إلا عندما يكون عدد قليل من السكان من الديدان المتاحة. في حين أن مناسبة لفحص الردود فقط على المركبات القابلة للذوبان في شكله الحالي، ويمكن تعديل هذه الطريقة بسهولة لاستيعاب التفاعل الحسي المتعدد الوسائط والدراسات أوبتوجينيتيك. ويمكن أيضا أن تتكيف هذه الطريقة لفحص الردود الكيميائية الحسية من الأنواع الأخرى من الديدان الخيطية. </P>
يجب على الحيوانات العلفية دمج المدخلات من طرائق الحسية متعددة وتحديد الاستراتيجيات السلوكية المناسبة من أجل التنقل بنجاح بيئتهم. فهم كيفية تلقي المدخلات الحسية الخارجية وترانزدوسد إلى المعلومات العصبية لتوجيه اختيار العمل هو هدف مركزي في مجال علم الأعصاب. إن الديدان الخيطية القابلة للجراثيا، C. إليغانز ، هي كائن نموذج جذاب يجسد فيه الآليات العصبية الكامنة وراء البيولوجيا الحسية والتكامل المتعدد الوسائط. على الرغم من أن C. ايليجانس لديها فقط 302 الخلايا العصبية، فإنه يمكن الكشف والتمييز بين مجموعة واسعة من المحفزات البيئية بما في ذلك المركبات القابلة للذوبان، الرائحة الطيارة، ودرجة الحرارة المحيطة 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 ، 7 . الالنيماتودا C. تعتمد ايليجانس بشكل كبير على جهازها الكيميائي الحسي لتوطين مصادر الغذاء وتنبيه نفسها إلى التهديدات المحتملة. وبالتالي، المقايسات السلوكية المصممة لفحص ردود من النوع البري وC. ايليجانس متحولة للمؤثرات الكيميائية تلعب دورا حاسما في تشريح الآليات الوراثية الخلوية، والعصبية الكامنة وراء القدرات الحسية ملحوظة C. ايليجانس.
لفحص الاستجابة للمركبات القابلة للذوبان، وقد وصفت ثلاثة أنواع من المقايسات – اختبار السقوط، فحص الكيميائي، وفحص الفحص. في اختبار السقوط، يتم وضع قطرة صغيرة من المركب في ذيل دودة متحركة وقرار دودة لعكس أو المضي قدما بمجرد وصول السائل يصل إلى الجهاز الحسي الأمامي 4 . اختبار السقوط يتطلب القليل من الإعداد التجريبي ومفيد عندما يكون حجم العينة من الديدان الصغيرة، كما هو الحال في الديدان التي تعمل بالليزر. ومع ذلك، كما دودة واحدة فقطيمكن أن يعاير في وقت واحد ويجب أن يكون المجرب حاضرا طوال مدة الفحص، واختبار قطرة يمكن أن تستغرق وقتا طويلا. اختبار السقوط هو أيضا عرضة للتغيرات في تسليم قطرة بين كل دودة داخل العينة، والتي قد تؤثر على النتائج الإجمالية للفحص. وهناك قيد آخر لاختبار السقوط هو أنه لا يمكن استخدامه إلا لفحص استجابة دودة للمركبات النادرة حيث أنه من غير الممكن التمييز بين تأثير جذاب أو محايد للمركب من حركة دودة إلى الأمام.
فحص الكيميائي للمركبات القابلة للذوبان ينطوي عادة تقسيم لوحة أجار إلى أربعة أرباع، مع الحل التجريبي مختلطة في أجار اثنين من الأرباع المتعارضة وحل التحكم مختلطة في اثنين من الأرباع الأخرى 8 ، 9 . في بداية الفحص، يتم وضع قطرة من العازلة التي تحتوي على الديدان في وسط لوحة وعدد من الديدان في وسجل كل رباعي في نقاط زمنية مختلفة. الفحص الكيميائي يوفر قوة إحصائية أكبر مقارنة مع اختبار قطرة كما يتم اختبار عدد كبير من الديدان في كل فحص. ومع ذلك، واحد الحد من هذه الطريقة هو أن إعداد لوحات الفحص الكيميائي يتطلب كميات كبيرة من المجمع التجريبي. وهذا سيجعل من الصعب إجراء شاشات السلوك على نطاق واسع إذا كان هناك حاجة لعملية تنقية معقدة مع غلة محدودة للحصول على المركب من الفائدة، كما هو الحال في جزيئات الإشارة أسكاروسيد 10 . بالإضافة إلى ذلك، العد اليدوي من الديدان في جميع أنحاء الفحص هو عرضة للأخطاء و اضطراب لوحات خلال عملية العد قد تؤثر على النتائج.
على عكس اثنين من الأساليب المذكورة أعلاه، واستبقاء الفحص يستخدم رؤية الجهاز، مما يقلل من الخطأ أثناء عملية التهديف ويقلل من تدخل المجرب خلال الفحص > 11. التحليل المحوسب لتسجيلات الفيديو من سلوك دودة يمكن أيضا أن تكشف عن ديناميات سلوكية أكثر صعوبة التي سيتم تفويتها عندما يتم تنفيذ التهديف فقط في بضع نقاط زمنية منفصلة. في الفحص الاحتفاظ، يتم إضافة اثنين من البقع الحلول على طرفي نقيض من صغيرة التعميم البقعة الغذائية البكتيرية تليها وضع عدد قليل من الديدان في منتصف التصحيح الغذائي. ثم يتم تسجيل سلوك الديدان، وتحليلها، ويتم احتساب قيمة مؤشر تفضيل استنادا إلى العدد الإجمالي للبكسل بكسل في كل منطقة الحل. على الرغم من أن وجود التصحيح الغذائي جذابة تمكن السكان الأصغر من الديدان لاستخدامها في كل فحص، وقد سبق أن أظهرت الغذاء لتوعية السلوكيات تجنب لذوبان الطارد 12 . وعلاوة على ذلك، تظهر الديدان استجابة فوتوفوبيك لضوء الموجة القصيرة واستخدام مصادر الضوء المجهر التي تنبعث الضوء الأبيض في الإعداد تسجيل السلوك قد تؤثر على السلوكs = "كريف"> 13.
الغرض من الطريقة التي نوقشت في هذه المقالة هو لتسجيل وتحليل C. ايليجانس " تفضيل المركبات القابلة للذوبان باستخدام مقايسة سكانية. وتحقيقا لهذه الغاية، فإن الأسلوب الحالي يدمج ويحسن الجوانب من كل ثلاث طرق سبق مناقشتها. فإنه يتيح مجموعات كبيرة من الديدان لفحصها ويتطلب كميات صغيرة فقط من الحل التجريبي لاستخدامها في كل فحص. وبالإضافة إلى ذلك، يتم إجراء مقايسة داخل غرفة السلوك المغلقة بنيت خصيصا مع الأشعة تحت الحمراء ليد الخلفية للحد من آثار ضوء الموجة القصيرة على السلوك. ويمكن أيضا أن تجهز كل غرفة مع الكاميرات المجهر متعددة، مما يزيد من الإنتاجية التجريبية دون المساس مساحة مقاعد البدلاء. وأخيرا، يخرج برنامج تحليل الفيديو قيمة مؤشر التفضيل لكل مقطع فيديو بالإضافة إلى مؤامرة إشغال دودة مصاحبة لتصور ديناميات سلوك السكان بمرور الوقت. إعداد غرفة وبروتوكول ساي يمكن تعديلها أكثر لدراسة ردود السلوك المتعدد الوسائط مثل تأثير الروائح أو درجة الحرارة على السلوكيات الحسية الحسية.
توضح هذه المقالة بناء غرفة السلوك وبروتوكول الفحص. كما أنه يدل على فائدة هذه الطريقة في فحص استجابة من نوع البرية الديدان والمسخنات المعيبة كيميائية الحسية إلى طارد للذوبان المعروفة، أيونات النحاس 4 . وأخيرا، يتم تفصيل عملية تحليل الفيديو باستخدام البرنامج المقدم.
خطوة حاسمة في البروتوكول هو ضمان أن لوحات الفحص لديها مستوى ثابت من جفاف في مختلف أيام التجريبية. سوف مستويات جفاف مختلفة يؤدي إلى معدلات انتشار مختلفة من الحل في أجار وبالتالي، والتغيرات في النتائج السلوكية. وبالتالي، لوحات الفحص يجب دائما أن تكون جديدة في فترة ما بعد الظهر قبل التجارب. وينبغي أيضا أن ينظم عدد الديدان اختبار لكل فحص لسهولة المقارنة بين العلاجات. للاشارة، دودة من النوع البري يضع 4-10 بيضة / ساعة في المتوسط ينتج> 360 الديدان لكل مقايسة إذا تم اتباع بروتوكول تزامن دودة أعلاه 17 . إذا سلالات متحولة معينة هي وضع البيض معيبة، واختيار الديدان الكبار أكثر حمولة لوضع البيض للوصول إلى العدد المستهدف من النسل. خطوة هامة أخرى في البروتوكول هو التعامل مع الديدان بلطف خلال عملية الغسيل ودودة التنسيب. الديدان حساسة للمؤثرات الميكانيكية، والتي تثير ردود الإجهاد مثل هذا s و تثبيط وضع البيض 18 . وعلاوة على ذلك، ينبغي توخي الحذر لتحديد العائد على الاستثمار بدقة وتحديد القيمة الثابتة العتبة المثلى لظروف الإضاءة المحددة قبل الشروع في تحليل الفيديو. ويوصى أيضا بأن تتكرر عمليات المعايرة والعطف إذا انقضت فترة طويلة من الزمن منذ تشغيل التجربة الأخيرة.
الحد من هذه الطريقة هو أنها ليست مناسبة لفحص السكان دودة صغيرة. ومع ذلك، إذا تم تنفيذ الضوابط المناسبة لتحديد تأثير وجود الطعام على السلوك الحسي، ثم استخدام الغذاء لتقييد موقع الاستكشاف المكاني الديدان كما هو الحال في فحص الاحتفاظ هو ممكن أيضا مع هذا الإعداد. وبالإضافة إلى ذلك، لا يقصد هذا الأسلوب لدراسة التحفيز الملاحة التدرج نظرا لقربها وكميات صغيرة من السيطرة والحلول التجريبية قطرات المستخدمة.
e_content "> في المستقبل، يمكن دمج برامج البرمجة التي تمكن تتبع متعددة الدودة واستخلاص ميزة دودة واحدة في هذا النظام 19 ، 20. تسجيل المعلمات سلوك خفية من سلوك دودة واحدة مثل سرعات عكسية واتساع منحنى الجسم ستوفر صورة أكثر تفصيلا للسلوك الحسي الكيميائي للديدان الفردية في سياق مقايسة تعتمد على السكان.يمكن أيضا أن يتم تعديل الفحص لدراسة التعود الثقوب مملة من خلال عائد الاستثمار باستخدام الإبر حقنة مع حجم قياس مناسب وملء الثقوب مع أجار غارقة مع المختبر التجريبي أو المخزن المؤقت السيطرة.هذا سيضمن تركيز سطح أكثر اتساقا للمركب على مدى فترة أطول من وقت التسجيل كما هو ضروري خلال دراسات التكرار.ومن التطبيقات المحتملة الأخرى لهذه الطريقة لإجراء دراسات السلوك المقارنة عبر أنواع مختلفة من الديدان الخيطية. بالإضافة إلى ذلك، غرفة السلوكيمكن تعديلها بطرق متعددة لدراسة الاستجابات السلوكية للمؤثرات متعددة الوسائط. لتطبيقات أوبتوجينيتيك، عالية الكثافة الصمام صفائف يمكن تركيبها بجانب جبل الكاميرا لتنشيط الخلايا العصبية ذات الاهتمام الانتقائي خلال الفحص. ويمكن أيضا إضافة عناصر التدفئة، وأنظمة التبريد، وأجهزة استشعار درجة الحرارة إلى الإعداد لدراسة آثار درجة الحرارة على السلوكيات الحسية. وعلاوة على ذلك، يمكن تركيب أنظمة تسليم الرائحة داخل الغرفة للتحقيق في التفاعلات بين الطرائق الحسية والروحية الحسية.The authors have nothing to disclose.
تم توفير بعض السلالات من قبل مركز علم الوراثة كاينورهابديتيس (سغك)، الذي يتم تمويله من قبل المعاهد الوطنية للصحة مكتب برامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440). ويدعم هذا العمل معهد هوارد هيوز الطبي، الذي بوس هو المحقق.
Aluminum T-slotted framing extrusions | McMaster-Carr | 47065T101 | Single profile, 1" size, solid |
Brackets | McMaster-Carr | 47065T236 | 1" long for 1" high single profile extrusions |
Compact end-feed fasteners | McMaster-Carr | 47065T139 | 1" (single), pack of 4 |
Twist-in solid panel holders | McMaster-Carr | 47065T251 | For 1" high extrusion |
Plastic end caps | McMaster-Carr | 47065T91 | For 1" high extrusion |
Optically clear cast acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K211 | 3/16" thick, 12" x 12" |
Vinyl-coated polyester fabric | McMaster-Carr | 88505K57 | 0.027" thick, 61" width, black |
Brass grommets | McMaster-Carr | 9604K22 | Trade size 0, 0.545" outer diameter |
Steel washers | McMaster-Carr | 90107A029 | 1/4" screw size |
Rounded head screws | McMaster-Carr | 90272A546 | 1/4"-20 thread size, 1-1/2" long |
Standard operating backlight | Smart Vision Lights | See local vendor | 8"x8", infrared 850nm |
IVP-C1 Variable Control Pot | Smart Vision Lights | See local vendor | |
T1 Power Supply | Smart Vision Lights | See local vendor | |
Dino lite Pro AM4113T | Dino-Lite Digital Microscope | See local vendor | |
MS09B microscope stand | Dino-Lite Digital Microscope | See local vendor |