我们提出一种行为记录设置和协议,能够自动分析线虫, 秀丽隐杆线虫在基于群体的测定中对可溶性化合物的偏好。本文介绍了行为室的构造,行为测定方案和视频分析软件的使用。
线虫, 秀丽隐杆线虫的紧凑型神经系统只有302个神经元,构成了各种各样的行为。为了便于基于这些行为的神经回路的解剖,需要开发健壮和可重复的行为测定。以前的线虫行为研究已经使用“滴定测试”,“趋化性测定”和“保留测定”的变化来研究秀丽隐杆线虫对可溶性化合物的反应。本文中描述的方法旨在结合上述三种测定的互补优势。简而言之,每个测定板中间的一个小圆圈被分成四个象限,其中交替放置对照和实验溶液。在添加蠕虫之后,将测定板装载到行为室中,其中显微镜照相机记录蠕虫与被处理区域的相遇。然后执行自动视频分析a并生成每个视频的偏好索引(PI)值。该方法的视频采集和自动分析功能最大限度地减少了实验者的参与和任何相关错误。此外,每个测定使用微量的实验化合物,并且行为室的多摄像机设置增加了实验吞吐量。该方法对于进行遗传突变体和新化合物的行为筛选是特别有用的。然而,这种方法不适合于研究刺激梯度导航由于控制和实验解决方案区域的紧密接近。当只有少量蠕虫可用时,也不应该使用它。虽然适用于仅测定其当前形式的可溶性化合物的反应,但是该方法可以容易地修饰以适应多峰感官相互作用和光遗传学研究。该方法也可适用于测定其他线虫物种的化学感应反应。 </p>
觅食动物必须整合来自多种感官模式的输入,并选择适当的行为策略,以便成功地导航他们的环境。了解外部感觉输入如何接收和转导到神经信息中以指导动作选择是神经生物学领域的核心目标。遗传易感线虫秀丽隐杆线虫是一种有吸引力的模型生物体,用于研究感官生物学和多模态整合的神经机制。尽管线虫仅具有302的神经元,它可以检测和各种环境刺激包括可溶性化合物,挥发性芳香剂,和环境温度1,2,3,4,5,6,7的区分。该线虫C.线虫在很大程度上依赖其化学感应器来本地化食物来源,并提醒自己潜在的威胁。因此,设计用于筛选野生型和突变体线虫对化学刺激的反应的行为测定在解剖线虫的显着感官能力的基因,细胞和神经机制中起着至关重要的作用。
为了测定对可溶性化合物的反应,已经描述了三种类型的测定 – 滴剂测试,趋化性测定和保留测定。在跌落试验中,该化合物的一小滴被放置在移动蜗杆和蜗轮的决定逆转或向前移动,一旦液体到达前感觉装置被拿下4的尾部。滴液测试需要很少的实验准备,并且当蠕虫的样品尺寸小时,如在激光操作的蠕虫的情况下是有用的。但是,只有一个蠕虫可以一次测定,并且实验者必须在整个测定期间存在,滴液测试可能是耗时的。跌落测试也容易受到样品中每个蠕虫之间滴落递减的变化的影响,这可能影响测定的总体结果。跌落测试的另一个限制是,它只能用于测定蠕虫对厌恶化合物的反应,因为不可能区分化合物与蠕虫向前运动的有吸引力或中性作用。
对于可溶性化合物的趋化性试验通常涉及将在琼脂平板分成四个象限,以混合成两个相对的象限的琼脂并混合到其他两个象限8,9对照溶液实验溶液。在测定开始时,将一滴含有蠕虫的缓冲液放置在板的中心,并将蠕虫的数量放入每个象限在不同的时间点得分。与滴定试验相比,趋化性测定提供了更大的统计学功效,因为在每个测定中测试了大量蠕虫。然而,该方法的一个限制是趋化性测定板的制备需要大量的实验化合物。如果需要具有有限产率的复杂纯化方法来获得感兴趣的化合物,如在白加罗糖信号分子10的情况下,这将使得难以进行大规模行为筛选。此外,在整个测定过程中手动计数蠕虫易受错误影响,并且计数过程中板的扰动可能会影响结果。
与上述两种方法不同,保留测定利用机器视觉,其在评分过程中最小化误差并降低实验者在测定过程中的干扰 > 11。计算机化分析的蠕虫行为的视频记录也可能潜在地显示微妙的行为动态,只有在几个离散的时间点进行评分时才会错过。在保留测定中,在小圆形细菌食物贴片的相对侧上加入两个溶液斑点,随后在食物贴片中间放置少量蠕虫。然后将该蠕虫的行为进行视频记录,分析,并且基于每个解决方案区域中的蠕虫像素的总数来计算偏好索引值。尽管存在有吸引力的食品贴片能够在每个测定中使用更少的蠕虫群体,但是食物以前已被证明可以使回避行为对可溶性驱避剂12敏感。此外,蠕虫对短波长光表现出光亮响应,并且在行为记录设置中使用发出白光的显微镜光源可能影响行为s =“xref”> 13。
本文讨论的方法的目的是使用基于群体的测定来记录和分析秀丽隐杆线虫对可溶性化合物的偏好。为此,目前的方法整合并改进了前面讨论过的三种方法的各个方面。它可以测试大量的蠕虫,并且只需要在每个测定中使用少量的实验溶液。此外,该测定在具有红外LED背光的定制封闭行为室内进行,以最小化短波长光对行为的影响。每个室也可以配备多台显微镜相机,这样可以提高实验产量而不会影响工作台面积。最后,视频分析软件输出每个视频的偏好索引值,以及随附的蠕虫占用情况,以随时间推测人口行为动态。房间设置和assay方案可以进一步修改以研究多模态行为响应,例如气味剂或温度对化学感觉行为的影响。
本文介绍了行为室和测定方案的构建。它还证明了该方法在测定野生型蠕虫和化学感染缺陷突变体对已知可溶性驱避剂铜离子的反应的实用性4 。最后,详细介绍使用提供的软件进行视频分析的过程。
该方案的关键步骤是确保测定板在不同的实验日内具有一致的干燥度。不同的干燥度将导致溶液进入琼脂的不同扩散速率,从而导致行为结果的变化。因此,测试板应在实验前的下午始终保持新鲜。为了便于比较处理,也应调整每次测定的蠕虫数量。作为参考,如果上述蠕虫同步协议遵循17 ,则野生型蠕虫平均产生每次测定产生> 360个蠕虫的4-10个卵/ h。如果某些突变菌株产卵有缺陷,选择更多的妊娠成虫虫卵来达到目标数量的后代。协议的另一个重要步骤是在洗涤过程和蠕虫放置期间轻轻地处理蠕虫。蠕虫对机械刺激敏感,引起应激反应的逆转和产卵抑制18 。而且,在进行视频分析之前,应该注意准确定义ROI并确定特定照明条件的最佳阈值常数值。还建议如果自上次实验运行以来经过了漫长的一段时间,则重复校准和阈值处理。
这种方法的局限性在于它不适用于测定小蠕虫群体。然而,如果进行适当的控制来确定食物的存在对感觉行为的影响,那么利用食物来限制蠕虫的空间探索位置,如在保留测定中也是可能的。此外,该方法不是用于研究刺激梯度导航由于紧密接近和少量的控制和实验溶液滴使用。
e_content“>在未来,编程软件,使多虫跟踪和单蠕虫特征提取可以集成到该系统19,20。记录的单个蠕虫行为微妙行为参数,如反转速度和身体弯曲的幅度将提供更详细地描述了在基于群体的检测方法中个体蠕虫的化学感应行为,还可以通过使用具有适当规格尺寸的注射器针孔通过ROI钻孔来修改测定以研究习惯,并用琼脂灌注孔与实验化合物或对照缓冲液,这将确保化合物在习性研究期间在更长的记录时间内更加一致的表面浓度。该方法的另一个潜在应用是对不同线虫种进行比较行为研究。另外,行为室可以通过多种方式修改以研究对多模态刺激的行为反应。对于光生应用,高强度LED阵列可以安装在相机底座旁边,以便在分析过程中选择性地激活感兴趣的神经元。加热元件,冷却系统和温度传感器也可以添加到设置中,以研究温度对感官行为的影响。此外,气味递送系统可以安装在室内以调查感器和化学感应模式之间的相互作用。The authors have nothing to disclose.
一些菌株由美国国立卫生研究基金会研究基金项目办公室(P40 OD010440)资助的秀根索氏杆菌遗传中心(CGC)提供。这项工作得到霍华德休斯医学研究所的支持,PWS是研究者。
Aluminum T-slotted framing extrusions | McMaster-Carr | 47065T101 | Single profile, 1" size, solid |
Brackets | McMaster-Carr | 47065T236 | 1" long for 1" high single profile extrusions |
Compact end-feed fasteners | McMaster-Carr | 47065T139 | 1" (single), pack of 4 |
Twist-in solid panel holders | McMaster-Carr | 47065T251 | For 1" high extrusion |
Plastic end caps | McMaster-Carr | 47065T91 | For 1" high extrusion |
Optically clear cast acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K211 | 3/16" thick, 12" x 12" |
Vinyl-coated polyester fabric | McMaster-Carr | 88505K57 | 0.027" thick, 61" width, black |
Brass grommets | McMaster-Carr | 9604K22 | Trade size 0, 0.545" outer diameter |
Steel washers | McMaster-Carr | 90107A029 | 1/4" screw size |
Rounded head screws | McMaster-Carr | 90272A546 | 1/4"-20 thread size, 1-1/2" long |
Standard operating backlight | Smart Vision Lights | See local vendor | 8"x8", infrared 850nm |
IVP-C1 Variable Control Pot | Smart Vision Lights | See local vendor | |
T1 Power Supply | Smart Vision Lights | See local vendor | |
Dino lite Pro AM4113T | Dino-Lite Digital Microscope | See local vendor | |
MS09B microscope stand | Dino-Lite Digital Microscope | See local vendor |