Automatiseret analyse af en Nematode Befolkningsbaseret Chemosensory Preference Assay

Summary

Vi præsenterer en opsætningsopsætning og protokol, der muliggør automatisk analyse af nematoden, Caenorhabditis elegans 'præference for opløselige forbindelser i en populationbaseret analyse. Denne artikel beskriver opførelsen af ​​et adfærdskammer, den adfærdsmæssige analyseprotokol og brugen af ​​videoanalyseprogrammer.

Abstract

Den nematode, Caenorhabditis elegans 'kompakte nervesystem af kun 302 neuroner ligger under et varieret repertoire af adfærd. For at lette dissektionen af ​​de neurale kredsløb, der ligger til grund for disse adfærd, er udviklingen af ​​robuste og reproducerbare adfærdsmæssige analyser nødvendig. Tidligere C. elegans adfærdsmæssige undersøgelser har anvendt variationer af en "drop test", et "chemotaxis assay" og et "retention assay" for at undersøge C. elegans reaktion på opløselige forbindelser. Fremgangsmåden beskrevet i denne artikel søger at kombinere de komplementære styrker af de tre ovennævnte analyser. Kort fortalt er en lille cirkel midt på hver analyseplade opdelt i fire kvadranter med kontrol og eksperimentelle løsninger skiftevis placeret. Efter tilsætningen af ​​ormene er assaypladerne indlæst i et adfærdskammer, hvor mikroskopkameraer registrerer ormernes møder med de behandlede områder. Automatiseret videoanalyse udføres derefter aNd en præferenceindeks (PI) værdi for hver video genereres. Videooptagelses- og automatiserede analysegenskaber ved denne metode minimerer eksperimentets involvering og eventuelle tilknyttede fejl. Endvidere anvendes små mængder af forsøgsforbindelsen pr. Assay, og adfærdskammerets multikameraopsætning øger eksperimentelt gennemløb. Denne metode er særlig nyttig til at udføre adfærdsmæssige skærmbilleder af genetiske mutanter og nye kemiske forbindelser. Denne metode er imidlertid ikke hensigtsmæssig til undersøgelse af stimulusgradientnavigering på grund af nærhed af kontrol- og eksperimentelle opløsningsområder. Det bør heller ikke bruges, når kun en lille population af orme er til rådighed. Selvom det kun er egnet til at analysere responser kun på opløselige forbindelser i sin nuværende form, kan denne metode let ændres til at rumme multimodal sensorisk interaktion og optogenetiske undersøgelser. Denne metode kan også tilpasses til at analysere de kemosensoriske responser af andre nematod-arter.

Introduction

Foraging dyr skal integrere input fra flere sensoriske modaliteter og vælge passende adfærdsmæssige strategier for at kunne navigere deres miljø. Forståelse af hvordan eksterne sensoriske indgange modtages og transduceres til neurale informationer til at styre actionvalg er et centralt mål inden for neurobiologi. Den genetisk trækkelige nematode, C. elegans , er en attraktiv modelorganisme, hvor man studerer de neurale mekanismer, der ligger til grund for sensorisk biologi og multimodal integration. Selvom C. elegans kun har 302 neuroner, kan den opdage og diskriminere mellem en lang række miljømæssige stimuli, herunder opløselige forbindelser, flygtige lugtstoffer og omgivelsestemperatur ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7} . DetNematode C. elegans er stærkt afhængig af dets kemosensoriske apparat for at lokalisere fødekilder og til at advare sig mod potentielle trusler. Således spiller adfærdsmæssige analyser, der er designet til at screene svarene fra vildtype og mutant C. elegans til kemiske stimuli, en afgørende rolle i dissekere de genetiske, cellulære og neurale mekanismer, der ligger til grund for C. elegans bemærkelsesværdige sensoriske evner.

For at analysere responset på opløselige forbindelser er der beskrevet tre typer af assays - drop testen, chemotaxis assayet og retention assayet. I drop-testen placeres en lille dråbe af forbindelsen i en bevægelsesorms hale, og ormens beslutning om at vende om eller bevæge sig fremad, når væsken når det fremre sensoriske apparat, er scoret ⁴ . Drop testen kræver lidt eksperimentelt forberedelse og er nyttigt, når ormestørrelsen er lille, som i tilfældet med laserdrevne orme. Men som kun en ormKan analyseres ad gangen, og eksperimentatoren skal være til stede i løbet af analysens varighed, kan dråptesten være tidskrævende. Drop testen er også sårbar over for variationer i drop levering mellem hver orm i en prøve, hvilket kan påvirke de samlede resultater af analysen. En anden begrænsning af drop testen er, at den kun kan bruges til at analysere ormens reaktion på aversive forbindelser, da det ikke er muligt at diskriminere mellem en attraktiv eller neutral virkning af forbindelsen fra ormens fremadrettede bevægelse.

Chemotaxis-analysen for opløselige forbindelser indebærer generelt at dele en agarplade i fire kvadranter, idet den eksperimentelle opløsning blandes i agaret af to modstående kvadranter, og kontrolopløsningen blandes i de andre to kvadranter ^{8 , 9} . Ved analysens begyndelse placeres en dråbe buffer indeholdende orme i midten af ​​pladen og antallet af orme i Hver kvadrant bliver scoret på forskellige tidspunkter. Chemotaxis-analysen giver større statistisk effekt sammenlignet med drop testen, da et stort antal orme testes i hvert assay. En begrænsning af denne metode er imidlertid, at fremstilling af chemotaxis-assaypladerne kræver store mængder af forsøgsforbindelsen. Dette vil gøre det vanskeligt at udføre storskala adfærdskanaler, hvis en kompliceret rensningsproces med begrænsede udbytter er påkrævet for at opnå den ønskede forbindelse, som i tilfældet med ascarosid-signalmolekylerne ¹⁰ . Derudover er manuel tælling af orme gennem analysen modtagelig for fejl, og pladens forstyrrelse under tællingsprocessen kan påvirke resultaterne.

I modsætning til de to ovennævnte fremgangsmåder udnytter retensionsassayet maskinsyn, som minimerer fejl under scoreprocessen og reducerer eksperimentatorens interferens under analysen > 11. Computeriseret analyse af videooptagelser af ormadfærd kan også potentielt afsløre subtile adfærdsmønstre, som vil blive savnet, når scoring kun udføres på et par diskrete tidspunkter. I retentionsassayet tilsættes to opløsningspletter på modsatte sider af en lille cirkulær bakteriel fødeplaster efterfulgt af placeringen af ​​et lille antal orme i midten af ​​fødeplaster. Ormenes adfærd registreres derefter, analyseres, og en præferenceindeksværdi beregnes ud fra det samlede antal ormpixel i hver opløsningsregion. Skønt tilstedeværelsen af ​​et attraktivt fødepatch gør det muligt at anvende mindre populationer af orme i hvert assay, har fødevarer tidligere vist sig at sensibilisere undvikelsesadfærd til opløselige repellanter ¹² . Desuden udviser orme et fotofob svar på kortbølgelængde lys, og brugen af ​​mikroskop lyskilder, der udsender hvidt lys i opførelsen af ​​optagelsesoptagelsen, kan påvirke adfærdS = "xref"> 13.

Formålet med metoden, der er diskuteret i denne artikel, er at registrere og analysere C. elegans ' præference for opløselige forbindelser under anvendelse af en populationsbaseret analyse. Til dette formål integrerer og forbedrer den nuværende metode aspekter fra alle tre af de tidligere diskuterede metoder. Det gør det muligt at teste store populationer af orme og kræver kun små mængder af den eksperimentelle opløsning, som skal anvendes i hvert assay. Desuden udføres analysen inden for et specialbygget lukket adfærdskammer med infrarød LED-baggrundsbelysning for at minimere virkningerne af kortbølgelængde lys på adfærd. Hvert kammer kan også udstyres med flere mikroskopkameraer, hvilket øger eksperimentelt gennemløb uden at gå på kompromis med bænkplads. Endelig udsender videoanalyseprogrammet præferenceindeksværdien for hver video samt et ledsagende ormbelægningsplan for at visualisere befolkningsadfærdsdynamikken over tid. Kammeropsætningen og aSsay-protokollen kan modificeres yderligere for at studere multimodale adfærdsmæssige reaktioner, såsom virkningen af ​​lugtstoffer eller temperatur på kemosensoriske adfærd.

Denne artikel beskriver opførelsen af ​​adfærdskammeret og analyseprotokollen. Det demonstrerer også anvendeligheden af ​​denne fremgangsmåde ved at analysere responsen af ​​vildtype-orme og kemosensoriske defekte mutanter til det kendte opløselige afstødningsmiddel, kobberioner ⁴ . Endelig er videoanalyseprocessen ved hjælp af den medfølgende software detaljeret.

Protocol

1. Adfærdskammerforsamling

BEMÆRK: Adfærdskammeret består af en kubeformet ramme, der er fremstillet af ekstruderede aluminiumstænger, dækket af uigennemsigtige stofdæksler med klar akrylbund og kameraunderstøtninger. Samlinger mellem de ekstruderede aluminiumstænger, der danner adfærdskammeret, er alle vinkelrette og er fastgjort ved hjælp af "L" -formede hjørnebeslag (1 tommer bred med 1 tommer ben), der fastgør et hjørnebeslag til hvert stang med skruer og indløb T-nødder. Hver ledning er fastgjort med enten en eller to hjørnebeslag som beskrevet nedenfor. Tekstildækslerne over kammeret er fastgjort til aluminiumsrammerne med samme skruer og indskyde T-møtrikker, men gennem gitter i hjørnerne af stoffet. Skruerne sættes korrekt ind i den forsænkede side af T-møtrikkerne, ikke i siden med den udragende læbe. Når du fastgør en skrue / T-møtrikker til en aluminiumstang, skal du glide T-møtrikken ind i kanalenPå den rigtige side af stangen med skruens hoved stikker ud af spalten.

1. Forbered stofbetræk.
   1. Brug saks til at skære fem stykker af det uigennemsigtige polyesterstof til at dække de øverste og fire sider af kammeret.
      1. Skær en firkant 14 x 14 tommer ² ark stof til toppen af ​​kammeret. Skær fire rektangulære 11 x 14 tommer ² ark stof til siderne af kammeret.
   2. Installer grommets i hjørnerne af stofarkene.
      1. Markér en referencelinje på 0,5 tommer fra hver kant af alle fem polyesterstofplader ved hjælp af blyant og ridser.
      2. For de fire rektangulære plader skal du bruge grommetænger til at indsætte grommets centrerede, hvor blyantslinjerne skærer hvert hjørne (det vil sige 4 grommets pr. Ark).
      3. Til firkantet ark indsættes to grommets langs hver kant med hver grommet centreret på blyantlinjen og anbragt 1,5 tommer fra slutningen af ​​hver afDe fire blyantlinjer (det vil sige 8 grommets samlede, to nær hvert hjørne).
   3. Sæt en skrue ind i hvert hulrum og løst fastgør en T-møtrik til hver.
2. Fremstil kamera monteringsstænger.
   1. Brug en bandsave eller tilsvarende til at skære et 2 tommers lang stykke aluminiums ekstruderingsstang for hvert kamera, så den afskårne ende af stangen er vinkelret på stanglængden for at lette senere samling.
   2. Brug en boretryk med en borekrone på 0,25 tommer til at bore et hul gennem midterbanerne på hver kamerabjælke, 0,75 tommer fra den ene ende, således at hullet er vinkelret på top- og bundfladerne og passerer gennem midterlinjen af ​​linjen . Eventuelt bor hullet ved hjælp af en håndholdt elektrisk boremaskine med en 0,25 tommer bor, men sørg for, at hullet er vinkelret på barens øverste og nederste side.
3. Forbered alle hjørnebeslag.
   1. Sæt en skrue gennem hullet iHvert hjørnebeslagets ben, indsættelse af skruen fra indersiden af ​​vinkelsiden. Træk en T-møtrik løst på hver skrue.
4. Forbered kameramonteringsenheden ( figur 1B , lag 2).
   BEMÆRK: Kameramonteringsenheden er en "H" -formet enhed, der understøtter de tre kameraholdere.
   1. Fastgør kameraets monteringsstænger til midterstangen på kameraholderen.
      1. Udsæt de tre kamera monteringsstænger fremstillet i trin 1.2 med de borede huller orienteret lodret. Sæt to hjørnebeslag på siderne af hver monteringsbjælke ved enden længst væk fra det borede hul.
      2. Placer hjørnebeslagene med beslagene på benene i spidsen med stangens ende og stram skruerne for at fastgøre dem på plads. Dette danner en "T" form med det borede hul i bunden af ​​"T".
      3. Læg en 1 fod aluminium ekstrudering på arbejdsfladen. Slip T-møtrikkerne på et kamera monteringsstangMbly (fra det foregående trin) på den ene side af 1-fods baren. Centrer monteringsbjælken langs 1 fods stanglængde og stram skruerne for at fastgøre på plads. Slip de to andre monteringsstænger på den modsatte side af 1 fodstangen.
      4. Placer de to stænger lige imod midten af ​​1-fods stangen, med deres indvendige hjørnebeslag ca. 2,5 inches fra hinanden. Slip hjørnebeslag på siderne af 1-fods stang, to i hver ende af stangen. Placer hjørnebeslagene med beslagene på benene i spidsen med barens ender og stram skruerne for at fastgøre dem på plads.
   2. Fastgør endebjælkerne til midterstangen.
      1. Slip to 1-fods aluminiumprofiler på T-møtrikkerne i hver ende af samlingen fra det foregående trin, der danner en "H" -form. Centrér hver endebjælke på midterstangen og sikr ved at stramme de fire skruer.
      2. Sæt fire hjørnebeslag på toppen af ​​de to endebjælker, der er tilføjet i det foregående trin, en i hver endeAf hver bar. Placer hjørnebeslagene med beslagets ben i spidsen med stængernes ender og stram skruerne for at fastgøre dem på plads.
   3. Fastgør kameraholder og holster til kameraholderen.
      1. For hvert af de tre mikroskopkameraer skal du fjerne kamerahylsteret ved at løsne tommelfingeren og glide af stativstangen.
      2. Til hver kamera monteringsbjælke (nu fastgjort til midterstangen på "H") placeres en vaskemaskine på en rundhovedskrue, slip skruen op gennem det borede hul i kameraholderen og læg en anden vaskemaskine ned over skruen . Træk det tappede hul på kameraholderstangen ned på skruen, og spænd godt fast mod kameraholderen.
      3. Gentag trin 14.3.2 for de to andre kamera monteringsstænger.
      4. Sæt et kamerahylster på hver kamerestativ med den bredere åbning orienteret mod kameraholderen og skruen. Fastgør holsteret midlertidigt til kameraholderen rOd med hylsterens tommelfinger.
         BEMÆRK: Den endelige driftsposition indstilles i afsnit 2.
5. Saml opførselskammerrammen ( figur 1A ).
   BEMÆRK: For at lette konstruktionen skal du montere rammen på hovedet, begyndende med "top" af karmens ramme på arbejdsfladen ( figur 1B , lag 1) og arbejde opad mod rammens "fødder" ( figur 1B , lag 3).
   1. For at montere det øverste lag af adfærdskammeret, fastgør fire 1-fods ekstruderede aluminiumstænger til den firkantede polyesterplade ( figur 1B , lag 1).
      1. Skub en stang på de to T-møtrikker langs hver kant af stofarket, centrerer stangen langs stofbredden. Stram fastgørelseselementerne for at sikre stoffarket til hver stang.
      2. Spred den firkantede polyesterplade på arbejdsfladen wiDe fire vedhæftede aluminiumstænger på toppen. Slip otte hjørnebeslag på de øverste overflader af de fire aluminiumstænger, en i hver ende af hver stang. Placer hjørnebeslagene på stængerne med beslagets lodrette ben flush med enderne af stængerne. Fastgør skruerne i T-møtrikkerne.
   2. Til gengæld ved hvert hjørne står en ekstra 1-fods aluminiumekstrudering oprejst, idet ekstruderingen glider over T-møtrikkerne på de to hjørnebeslag.
   3. Fastgør den stående stang til de vandrette stænger ved at spænde fastgørelseselementerne, således at de forbinder de to tilstødende vandrette stænger.
      BEMÆRK: Når de er færdige vil de otte ekstruderinger (fire vandrette og fire lodrette) danne en firkantet ring på bordet med fire indlæg stående opad ( figur 1B , lag 1).
   4. Sæt de løse T-møtrikker på den "H" -formede kamerabesamlingsenhed fra afsnit 1.4 ned i rammens stolper fra det foregående trin. Lad "H & #34; Slip helt ned for at hvile på toppen af ​​hjørnebeslagene på hvert hjørne af rammen. Fastgør kameraholderen på plads ved at stramme de fire hjørnebeslagskruer.
   5. Sammensæt kammerets bundlag ved brug af de sidste fire 1 fod ekstruderede aluminiumstænger ( figur 1B , lag 3).
      1. Sæt et hjørnebeslag på hver ende af hver 1 fods bar, og placér hjørnebeslagene med beslagets ben i spidsen med barens ender og stram skruerne for at fastgøre på plads.
      2. Træk stængerne ned mellem rammens stolpe med de løse T-møtrikker i stolpenes kanaler. Placer stængerne, så de øverste kanter af deres hjørnebeslag er 1 tommer under den åbne ende af stativene og fastgør dem ved at spænde skruerne på hjørnebeslaget.
6. Skub T-møtrikkerne på de fire rektangulære polyesterplader ned i kanalerne på de stående ekstruderingsstænger for at dække siderne af kammenR og stram fastgørelseselementerne fast på plads.
7. Vælg den ene side for at være en dør for adgang til kammerets indre og fjern de to skruer og T-møtrikkerne i kammerets nederste lag.
   BEMÆRK: Når rammen er drejet oprejst, vil bunden af ​​dette dæksel hænge løst i bunden og kan løftes for at få adgang til kammerets interiør.
8. Anbring en plastikkappe på den øverste ende af hvert hjørneelement for at tjene som fødder til den færdige ramme. Drej rammen højre opad. Indsæt to panelholdere pr. Side inde i rammens basislag og drej for at sikre dem på plads ( figur 1B , lag 3). Anbring et 12 x 12 tommer ² stykke klart akryl oven på panelholderne for at tilvejebringe et trin til analyseplade ( figur 1B , lag 3).

2. Placering af kamera og sceneformat

1. Download og installer videooptagelsessoftwaren til mikroskopkameraet på computerenFra producentens hjemmeside.
2. Skub et mikroskopkamera ind i hver af de tre kameraholdere med kameraoptikken peget ned mod akrylstadiet og baggrundslyset. Slut kameraerne til computerens USB-porte. Placer det infrarøde LED-baggrundslyspanel under rammen, centrerer under scenen. Tilslut baggrundslyspanelet for at tænde.
3. Udskriv de angivne løsningsplaceringer og pladejusteringsskabeloner på transparensark (se Supplerende fil ).
   BEMÆRK: Pladens perimetercirkel er på 3 cm i diameter, og den indre region af interessecirkel er 0,9 cm i diameter.
4. Skær langs gitterlinjerne for at opnå rektangulære gennemsigtighedsstykker, der omslutter de cirkulære skabeloner.
5. Start videooptagelsessoftwaren, og klik på de nummererede miniaturer øverst i vinduet for at se kameraets feeds.
6. Juster mikroskopkamerajustering og forstørrelse.
7. Placer en pladejusteringsskabelon under en mikroskopkameraobjektiv ( figur 2B ).
8. Skift arbejdsafstand ved at skubbe kamerahylsteret lodret langs kamerestativet og justere kameraets forstørrelse ved at dreje kameraets forstørrelsesskive, indtil skabelonens nummermarkører er tydeligt synlige ved kanterne af kameraets synsfelt.
9. Tape pladejusteringsskabelonen til akrylstadiet.
10. Placér en prøveplade af orme på pladejusteringsskabelonen under mikroskopkameraet og yderligere forbedre forstørrelses- og arbejdsafstanden, indtil et skarpt billede af ormerne opnås, mens nummermarkørerne stadig bevares inden for synsfeltet.
11. Gentag trin 2.6.1-2.6.4 for de to andre mikroskopkameraer.

3. Nematodvækst og synkronisering

1. Fire dage før forsøgene, frø 24 fireNematod Growth Media (NGM) agarplader med 50 μl OP50 Escherichia coli i Luria-Bertani (LB) bouillon (se afsnit 5 for opskrift).
   BEMÆRK: Hver 60 mm plade giver nok orme til en analyseplade. Det anbefales at erhverve seks replikater pr. Behandling eller genotype.
2. Lad de podede plader tørre oprejst med låg på natten over ved stuetemperatur.
3. Næste dag, overfør femten godt fodrede, grave hermaphrodites på hver podet plade og lad hvormes lægge æg i seks timer. Dette vil give> 360 æg pr. Plade.
4. Efter 6 timer skal du fjerne orme fra frøplader og lade afkom vokse i 3 dage til voksne ved 20 ° C.

4. Kemosensory Preference Assay

1. Dagen før forsøget fremstilles 35 mm NGM agar assay plader.
   1. Forbered 250 ml NGM agar (se afsnit 5 for opskrift).
   2. Ordne otteogtyve tomme 35 mm plader i stakke på fem eller mindre på en flad surface. Fyld hver analyseplade med 5 ml NGM-agar. Lad prøvepladerne tørre oprejst med låg på natten over ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: Som en tommelfingerregel skal du udarbejde en yderligere analyseplade for hver behandling eller genotype, der skal analyseres i tilfælde af uregelmæssigheder.
2. På forsøgsdagen tændes baggrundsbelysningen, starter computeren og starter mikrofonkameraet videooptagelsessoftware.
3. Slut et mikroskopkamera til computeren og juster indstillingerne for videooptagelse.
   1. Klik på det nummererede kameraets miniaturebillede øverst i softwarevinduet for at se kameraets live feed.
   2. Træk menuen 'Videoformat' i øverste venstre hjørne af kameraindføringen og vælg 'MJPG 1280 x 1024'. Træk menuen 'Folder' ud for menuen 'Videoformat', og vælg en mappe, hvor videofilerne skal gemmes.
   3. Klik på ikonet 'Auto eksponering' øverst til højre påKameraet indfører og slukker for automatisk eksponering. Klik på ikonet 'LED' umiddelbart til højre for ikonet 'Auto eksponering' for at slukke for de indbyggede mikroskopkamera-LED'er. Klik på ikonet ved siden af ​​'Indstillinger': Vælg 'Monokrom', maksimér 'Kontrast', og juster 'Lysstyrke', indtil ormer virker adskilte fra baggrunden.
4. Få kalibreringsvideoer.
   1. Juster en løsning-placeringsskabelon oven på en skabelonjusteringsskabelon ( figur 2A ). Klik på ikonet 'Time-Lapsed Video' på venstre side af kameraet, og indtast '5' s for varighed og '1' s for interval for at optage en 5-sekunders video ved 1 frame / s. Klik på 'Start' for at starte videooptagelse.
5. Gentag trinene i 4.3 og 4.4 for de to andre mikroskopkameraer.
6. Fjern løsningsplaceringsskabelonen fra kammeret.
8. Brug en 5 ml glaspipette til at tilføje 1,2 ml NGM-buffer til en plade af synkroniserede orme og omrør forsigtigt pladen for at forskyde ormene ind i bufferen. Pipetter op buffer fra pladen og dispensere orme i buffer i et rent mikrocentrifugerør.
   BEMÆRK: Orme er følsomme over for afvigelser fra deres dyrkning agar salt koncentration ¹⁴ . For at minimere ændringer i agarsaltkoncentration efter ormplacering anbefales det at bruge NGM-buffer til vaskeprocessen (se afsnit 5 for opskrift). Brug ikke plastpipetter til at fjerne orme fra plader, da ormer vil holde sig til siderne. Forbered et tilsvarende antal rør som antallet af assayplader, der skal køres samtidigt.
9. Lad de tre rør stå i 1-2 minutter for at give orme mulighed for at slå sig ned til bunden. Brug en plastikpipetip til at fjerne så meget vaskebuffer fra rørene som muligt uden at forstyrre aggregatets pelletEd orme i bunden af ​​rørene. Påfyld rørene med 1 ml ren NGM buffer hver.
10. Gentag trin 4.7.2 en gang.

Tilføje 10 mM _CuCl2 og M13 bufferopløsninger til analyse plader (se afsnit 5 til opskrifter).

1. Tape en løsning-placeringsskabelon oven på scenen af ​​dissekeringsmikroskopet.
2. Anbring en strimmel med dobbeltsidet tape på hver side af en pladejusteringsskabelon. Sørg for, at båndet overlapper med cirkelpladen, men udelukker ikke optagelsesområdet af interesse i midten af ​​skabelonen.
3. Indstil assaypladens omkreds med cirklen på pladejusteringsskabelonen, og tryk ned, indtil skabelonen klæber til bunden af ​​pladen. Juster analyseplade-skabelonnummermarkørerne med løsningsplaceringskabelmarkørerne på dissekeringsmikroskopet.
4. Brug en P2-pipette og plastikspids til at placere 1 μL af M13-bufferen hver i kvadranter 1 og 4 ( 2 opløsning hver i kvadranter 2 og 3 ( Figur 2A ).
5. Gentag trin 4.8.2-4.8.4 for de andre to analyseplade.

Når opløsningen falder, er absorberet fuldstændigt i agaren, skal du bruge en glaspasteurpipette til overførsel af vaskede orme fra hvert mikrocentrifugerør til den tilsvarende analyseplade.

Placer en dråbe orme hver på området over og under det cirkulært behandlede område. Fold et væv fire gange, og brug den blanke kant til at absorbere overskydende vaskebuffer på alle analyseplader.

Omgående arrangere de tre analyseplader under mikroskopkameraerne i adfærdskammeret ved at justere tallene ved skabelonhjørnerne. Vent i 2-3 minutter for at tillade ormene at acclimate til assaypladerne.
BEMÆRK: Sørg for, at døren til adfærdskammerets dør er lukket, inden du starter videooptagelsen i næste trin.

Gentag trin 4.7-4.12 til næste runde af analyseplader. Erhverv mindst seks replikater eller to registreringsrunder for hver behandling eller genotype.

5. Reagensfremstilling

1. Forbered NGM agar og buffer.
   1. I en 1 L glasflaske tilsættes 1,5 g natriumchlorid, 8,5 g agar og 1,25 g pepton. Tilsæt 500 ml destilleret vand og en omrøringsstang til flasken. Autoklavflaske med indhold.
   2. Anbring flasken på en omrøringsplade og tænd for rørefunktionen.
   3. Tilsæt i rækkefølge ved anvendelse af steril teknik: 0,5 ml 5 mg / ml kolesterol, 0,5 ml 1 M calciumChlorid, 0,5 ml 1 M magnesiumsulfat og 12,5 ml 1 M kaliumphosphat.
   4. Gentag trin 5.1.1 til 5.1.2 for at lave NGM-buffer, men slip agar og pepton i trin 5.1.1.
2. Forbered LB bouillon.
   1. I en 1 L glasflaske tilsættes 5 g trypton, 2,5 g gær ekstrakt, 2,5 g natriumchlorid, 500 ml destilleret vand og 0,5 ml 1 N natriumhydroxid. Autoklavflaske med indhold.
3. Forbered M13 buffer.
   1. I en 1 L glasflaske tilsættes 1,817 g Tris, 2,922 g natriumchlorid, 0,373 g kaliumchlorid og 500 ml destilleret vand. Autoklaver flasken med indhold.
4. Forbered kobberchlorid (CuCl ₂ ) opløsning.
   1. Udvej 0,134 g CuCl ₂ . Tilføj solut til 10 ml M13-buffer i 15 ml plastrør til at gøre 100 mM _CuCl2 stamopløsning. Inverter plastrøret indtil alt opløst stof har dissolved.
   2. Brug en sprøjte og 0,2 um membranfilter til at filtrere oprense 100 mM _CuCl2 opløsning i en ren 15 ml plastrør.
   3. At gøre 10 mM _CuCl2 opløsning tilsættes 900 pi af M13-buffer og 100 pi 100 mM _CuCl2 stamopløsning til et mikrocentrifugerør. Inverter mikrocentrifugerøret for at blande godt.

6. Video analyse

1. Download Python 3 (https://www.python.org/downloads/) og OpenCV softwarebiblioteket (http://opencv.org/downloads.html).
2. Download de tre Python-scripts til analyse (https://github.com/WormLabCaltech/ResidentWorm).
   BEMÆRK: Sørg for, at alle videofiler, der skal bruges, er i mp4-format, inden du fortsætter.
3. For at se funktionen og parameterbeskrivelserne, skriv 'help (enter function name)' i konsollen og tryk enter. Skriv f.eks. 'Hjælp (kalibrering)' og tryk på Enter.
4. Udfør kalibreringsfunktionenMed inputparametre til at definere de interesserede videoområder (ROI).
   1. Indtast filnavnet på kalibreringsvideoen taget i afsnit 4 for variablen 'mp4filnavn'. Inkluder citatmærker, når du indtaster filnavnet.
   2. Start med værdierne 600 og 360 for variablerne 'Q * x' og 'Q * y'. * Indtast kvadrantnumre 1 til 4. Start med værdien 310 for variablen 'rad'. Juster variabelværdierne, indtil ROI-maskerne er justeret med kvadrantskitse på skabelonen.
   3. Optag det samlede antal pixels i hvert afkast, som vil blive udskrevet i konsollen, når denne funktion udføres. Indtast denne værdi for parameteren 'ROI_size' i preference_index-funktionen.
5. Udfør tærskelkonstantfunktionen for at bestemme den relevante tærskelkonstant. Juster "konstant" værdien, indtil ormene (hvide) kan ses tydeligt, og der er minimal salt og peberstøj i baggrunden (sort).
6. Udfør præference_index-funktionen for at generere et csv-dataark, videoens præferenceindeks og den tilhørende ormbelægningsplan.
   1. Brug 'Q * x', 'Q * y', 'rad', 'ROI_size' og 'konstant' værdier bestemt fra trin 6.4 og 6.5 som input parametre for preference_index-funktionen.
      BEMÆRK: For hver videoramme tæller funktionen preference_index antallet af ormpixel i hvert afkastning og beregner procentdelen af ​​ormpixelpunkter ud af det samlede antal ROI-pixel. Funktionen genererer derefter en præferenceindeksværdi for hver videoramme ved hjælp af formlen:
      
      BEMÆRK: Når programmet har analyseret alle rammerne i videoen, genereres en gennemsnitlig præferenceindeksværdi for videoen. Et ormbelægningsområde med videoens præferenceindeks printet øverst såvel som et csv dataark indeholdendeOrm pixel, procentvise ormbelægningsværdier og præferenceindekset for hver videoramme gemmes i den udpegede mappe, når programmet er færdig.

Representative Results

Figur 3A viser præferenceindeksværdierne opnået for forskellige genotype- og behandlingsparringer. En præferenceindeksværdi på 1 angiver stærk attraktion for løsningen placeret i eksperimentelle ROI, mens en præferenceindeksværdi på -1 angiver stærk afstødning. Et præferenceindeks på 0,02 blev opnået, når M13-bufferopløsningen blev anbragt i både kontrol- og eksperimentelle ROI'er, hvilket demonstrerede, at der ikke er nogen rumlig bias mod enten ROI. N2 orme undgik stærkt kobberionerne, hvilket resulterede i et præferenceindeks på -0,67, hvilket bekræfter tidligere konstateringer, at kobberioner er en stærk repellant ( Supplementary Movie 1 ) ⁴ . Osm-3- mutanter, som mangler korrekt dannelse af de distale segmenter af sensoriske cilia, viste en signifikant nedsat undgåelse af kobberioner (PI = -0,19) ¹⁵ . Ocr-2 mutanter, som er de Fektive i mange ASH-medierede nociceptive responser, herunder kobberunddragelse, udviser også signifikant nedsat undgåelse og endog en vis mild attraktion for kobberioner (PI = 0,19) ( Supplementary Movie 2 ) ¹⁶ .

Figur 3B viser repræsentative ormbelægningsgrader, der angiver tyngden af ​​orme i kontrollen versus de eksperimentelle ROI'er over tid i hver video. Jo mørkere farven på plottingsområdet er, desto større er antallet af ormpixel i afkastet. Beboelsesplottet for N2 orme behandlet med M13 buffer kontrol viser, at antallet af orme i begge ROI'er forbliver ens i hele analysen. Imidlertid indikerer belægningsgraven for N2-orme behandlet med kobberioner at ormene stærkt og konsekvent undgår det eksperimentelle ROI i hele analysen.

Gimg "src =" / files / ftp_upload / 55963 / 55963fig1.jpg "/>
Figur 1: Foto og skematisk repræsentation af adfærdskammerdesign. ( A ) Set forfra af opførselskammeropsætning (venstre) og tilsvarende skematisk repræsentation af kammerramme (højre). Uigennemsigtige polyesterplader lukker kammeret på alle ansigter undtagen bundfladen, som giver lys gennem det infrarøde baggrundsbelysningspanel. Numrene 1, 2 og 3 svarer til ekstruderingslaget i (B). ( B ) Skematisk af ovenfra af ekstruderingslag omfattende opførselskammerrammen. Dette omfatter toplaget (1), det midterste kamera mount monteringslag (2) og det nederste trinlag (3). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Løsningsplacering og pladejusteringskabeloner. ( A ) Løsningsplaceringsskabelonen har fire kvadranter og nummerjusteringsmarkører. Kontrolopløsningen placeres i øverste venstre og nederste højre kvadranter, mens den eksperimentelle løsning placeres i øverste højre og venstre venstre kvadranter. ( B ) Pladjusteringsmalen har kun nummerjusteringsmarkører for at minimere okklusion af orme i synsfeltet under videooptagelse og analyse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Eksempeldata indsamlet ved hjælp af dette assay. ( A ) Præferenceindeks (PI) værdier for vildtype N2 og mutant C. elegans m> reaktion på M13-buffer og 10 mM _CuCl2. N2 orme viste ingen præference mellem kontrol- og eksperimentelle ROI'er, når M13-kontrolopløsning blev placeret i begge ROI'er, men stærkt undgået det eksperimentelle ROI, når kobberioner blev placeret i den (henholdsvis PI = 0,02 og -0,67). Osm-3 (p802) mutanter og ocr-2 (ak47) mutanter viste signifikant nedsat undgåelse af kobberioner sammenlignet med N2 (PI = -0,1 og 0,2). N = 6 analyser for hver genotypebehandlingsparring,> 360 orme pr. Analyse, fejlstænger indikerer ± 1 SEM, *** p <0,001, envejs ANOVA efterfulgt af post-hoc Tukey Honestly Significant Difference (HSD) test. ( B ) Repræsentative ormbelægninger for N2 orme med M13 buffer i både ROI (top) og N2 orme med M13 buffer i kontrol ROI og kobberioner i eksperimentelle ROI (bund). Farveskalaen under hvert belægningsplot repræsenterer antallet af ormpixel.Pload / 55963 / 55963fig3large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende film 1: Adfærdsmæssig reaktion af N2 orme til 10 mM kobberchlorid. Ormer tiltrækkes af kontrolkvadranterne med M13 buffer (øverst til venstre og nederst til højre), men undgå stærkt kvadranterne, der indeholder kobberioner opløst i M13 buffer (øverst til højre og nederst til venstre). Videoen blev optaget til 1 billede pr. Sekund og sped op 15x. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende film 2: Adfærdsmæssigt svar fra ocr-2 (ak47) orme til 10 mM kobberchlorid. Worms strejfer i omtrent lige stor grad i begge kontrolkvadranterne med M13 buffer (øverst til venstre og nederst til højre) og kvadrantenS indeholdende kobberioner opløst i M13 buffer (øverst til højre og nederst til venstre) i hele registreringsvarigheden. Mutanterne udviser en lille præference for kvadranterne, der indeholder kobberioner ved starten af ​​optagelsen. Videoen blev optaget til 1 billede pr. Sekund og sped op 15x. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil: Solution-placement og Plate-alignment skabeloner. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Et kritisk trin i protokollen sikrer, at assaypladerne har en ensartet tørhedsgrad over forskellige eksperimentelle dage. Forskellige tørhedsniveauer vil resultere i forskellige diffusionshastigheder af opløsningen i agar og følgelig variationer i adfærdsmæssigt udfald. Analyseplader skal således altid laves frisk om eftermiddagen før forsøg. Antallet af orme testet pr. Test bør også reguleres for at lette sammenligningen mellem behandlinger. Til reference ligger en vildtypeorm 4-10 æg / h i gennemsnit, der giver> 360 orme pr. Assay, hvis ormsynkroniseringsprotokollen ovenfor følges ¹⁷ . Hvis visse mutante stammer er æglægning defekte, skal du vælge flere gravide voksne orme til æglægning for at nå målantalet afkom. Et andet vigtigt skridt i protokollen er at håndtere orme forsigtigt under vaskeprocessen og ormen placering. Orme er følsomme over for mekaniske stimuli, som fremkalder stressresponser sådan S reverseringer og æglægningshæmning ¹⁸ . Derudover bør man være opmærksom på at definere ROI nøjagtigt og for at bestemme den optimale tærskelkonstantværdi for specifikke lysforhold, før man fortsætter med videoanalysen. Det anbefales også at kalibrering og tærskelprocesserne gentages, hvis der er gået en længere periode siden det sidste forsøg blev kørt.

En begrænsning af denne metode er, at den ikke er egnet til at analysere små ormpopulationer. Men hvis de relevante kontroller til bestemmelse af indflydelsen af ​​tilstedeværelsen af ​​mad på den sensoriske adfærd udføres, er det også muligt at anvende mad til at begrænse ormernes rumlige udforskningssted som i retensionsassayet med denne opsætning. Desuden er denne metode ikke beregnet til at studere stimulusgradientnavigation på grund af nærheden og små mængder af de anvendte kontrol- og forsøgsløsninger.

E_content "> I fremtiden kan programmeringssoftware, der muliggør udnyttelse af multi-orm og single-worm-ekstraktion, integreres i dette system ^{19 , 20.} Optagelse af subtile adfærdsparametre for enkeltorms adfærd som omdrejningshastigheder og amplitude af kropsbøjninger vil tilvejebringe Et mere detaljeret billede af en individuel orms kemosensoriske opførsel i sammenhæng med et populationbaseret assay. Analysen kan også modificeres for at studere habituation ved at køre huller gennem afkastet ved hjælp af sprøjtenåle med passende måleformat og fylde hullerne med agar infunderet Med forsøgsforbindelsen eller kontrolpufferen. Dette vil sikre en mere konsistent overfladekoncentration af forbindelsen over en længere periode af optagetid, som det er nødvendigt under forsøgsforsøg. En anden potentiel anvendelse af denne metode er at gennemføre sammenlignende adfærdsstudier på tværs af forskellige nematodarter. Hertil kommer adfærdskammeretKan modificeres på flere måder til at studere adfærdsmæssige reaktioner på multimodale stimuli. Til optogenetiske applikationer kan højintensitets LED-arrays fastgøres ved siden af ​​kameraholderen for selektivt at aktivere neuroner af interesse under analysen. Varmeelementer, kølesystemer og temperatursensorer kan også tilføjes til opsætningen for at studere temperaturens virkninger på sensoriske opførsel. Desuden kan lugtleveringssystemer installeres inde i kammeret for at undersøge interaktioner mellem lugt- og kemosensoriske modaliteter.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Nogle stammer blev leveret af Caenorhabditis Genetics Center (CGC), som finansieres af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Dette arbejde støttes af Howard Hughes Medical Institute, hvor PWS er ​​en efterforsker.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum T-slotted framing extrusions	McMaster-Carr	47065T101	Single profile, 1" size, solid
Brackets	McMaster-Carr	47065T236	1" long for 1" high single profile extrusions
Compact end-feed fasteners	McMaster-Carr	47065T139	1" (single), pack of 4
Twist-in solid panel holders	McMaster-Carr	47065T251	For 1" high extrusion
Plastic end caps	McMaster-Carr	47065T91	For 1" high extrusion
Optically clear cast acrylic sheet	McMaster-Carr	8560K211	3/16" thick, 12" x 12"
Vinyl-coated polyester fabric	McMaster-Carr	88505K57	0.027" thick, 61" width, black
Brass grommets	McMaster-Carr	9604K22	Trade size 0, 0.545" outer diameter
Steel washers	McMaster-Carr	90107A029	1/4" screw size
Rounded head screws	McMaster-Carr	90272A546	1/4" - 20 thread size, 1 - 1/2" long
Standard operating backlight	Smart Vision Lights	See local vendor	8" x 8", infrared 850 nm
IVP-C1 Variable Control Pot	Smart Vision Lights	See local vendor
T1 Power Supply	Smart Vision Lights	See local vendor
Dino lite Pro AM4113T	Dino-Lite Digital Microscope	See local vendor
MS09B microscope stand	Dino-Lite Digital Microscope	See local vendor

References

1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314, 1-340 (1986).
2. Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).
3. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
4. Hilliard, M. A., Bargmann, C. I., Bazzicalupo, P. C. elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail. Curr Biol. 12 (9), 730-734 (2002).
5. Hilliard, M. A., Bergamasco, C., Arbucci, S., Plasterk, R. H., Bazzicalupo, P. Worms taste bitter: ASH neurons, QUI-1, GPA-3 and ODR-3 mediate quinine avoidance in Caenorhabditis elegans. EMBO J. 23 (5), 1101-1111 (2004).
6. Zariwala, H. A., Miller, A. C., Faumont, S., Lockery, S. R. Step response analysis of thermotaxis in Caenorhabditis elegans. J Neurosci. 23 (10), 4369-4377 (2003).
7. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 70 (3), 817-821 (1973).
8. Wicks, S. R., de Vries, C. J., van Luenen, H. G., Plasterk, R. H. CHE-3, a cytosolic dynein heavy chain, is required for sensory cilia structure and function in Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 221 (2), 295-307 (2000).
9. Jansen, G., Weinkove, D., Plasterk, R. H. A. The G-protein subunit gpc-1 of the nematode C. elegans is involved in taste adaptation. EMBO J. 21 (5), 986-994 (2002).
10. Srinivasan, J., et al. A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans. Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).
11. Choe, A., et al. Ascaroside signaling is widely conserved among nematodes. Curr Biol. 22 (9), 772-780 (2012).
12. Ezcurra, M., Tanizawa, Y., Swoboda, P., Schafer, W. R. Food sensitizes C. elegans avoidance behaviours through acute dopamine signalling. EMBO J. 30 (6), 1110-1122 (2011).
13. Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nat Neurosci. 11 (8), 916-922 (2008).
14. Kunitomo, H., et al. Concentration memory-dependent synaptic plasticity of a taste circuit regulates salt concentration chemotaxis in Caenorhabditis elegans. Nat Commun. 4, 2210 (2013).
15. Snow, J. J., et al. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).
16. Tobin, D. M., et al. Combinatorial expression of TRPV channel proteins defines their sensory functions and subcellular localization in C. elegans neurons. Neuron. 35 (2), 307-318 (2002).
17. Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans. Neuron. 21 (1), 203-214 (1998).
18. Sawin, E. R. Genetic and cellular analysis of modulated behaviors in Caenorhabditis elegans. , M.I.T. Cambridge, MA. (1996).
19. Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. The parallel worm tracker: A platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes. PLoS One. 3 (5), e2208 (2008).
20. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nat Methods. 8 (7), 592-598 (2011).

Tags

Behavior Nematode, Automatiseret adfærdsanalyse populationsbaseret assay kemosensorisk præference neurobiologi