Vi presenterer en opptaksoppsett og protokoll som muliggjør automatisk analyse av nematoden, Caenorhabditis elegans 'preferanse for oppløselige forbindelser i en populasjonsbasert analyse. Denne artikkelen beskriver konstruksjonen av et oppførselskammer, adferdsanalyseprotokollen og bruk av videoanalyseprogrammer.
Den nematode, Caenorhabditis elegans 'kompakte nervesystemet av bare 302 nevroner, ligger under et mangfoldig repertoar av oppførsel. For å lette disseksjonen av nevrale kretser som ligger til grund for disse atferdene, er utviklingen av robuste og reproducerbare atferdsanalyser nødvendig. Tidligere C. elegans atferdsstudier har brukt variasjoner av en "drop test", en "chemotaxis assay" og en "retensjonsanalyse" for å undersøke responsen fra C. elegans til oppløselige forbindelser. Fremgangsmåten beskrevet i denne artikkelen søker å kombinere de komplementære styrker av de tre ovennevnte analysene. Kort fortalt er en liten sirkel i midten av hver analyseplass oppdelt i fire kvadranter med kontrollen og eksperimentelle løsninger skiftevis plassert. Etter tilsetningen av ormene blir analyseplaten lastet inn i et oppførselskammer hvor mikroskopkameraer registrerer ormene i de behandlede områdene. Automatisert videoanalyse utføres deretter aNd en preferanseindeks (PI) -verdi for hver video genereres. Videooppkjøpet og automatiserte analysegenskaper av denne metoden minimerer eksperimentørens involvering og eventuelle tilknyttede feil. Videre brukes små mengder av eksperimentell forbindelse per analyse og adferdskammerets multikameraoppsett øker eksperimentell gjennomstrømning. Denne metoden er spesielt nyttig for å utføre adferdsskjermbilder av genetiske mutanter og nye kjemiske forbindelser. Denne metoden er imidlertid ikke egnet for å studere stimulusgradientnavigasjon på grunn av nærhet av kontroll- og eksperimentelle løsningsområder. Det bør heller ikke brukes når bare en liten populasjon ormer er tilgjengelig. Selv om det er egnet for å analysere responser bare på løselige forbindelser i sin nåværende form, kan denne metoden lettmodifiseres for å imøtekomme multimodal sensorisk interaksjon og optogenetiske studier. Denne metoden kan også tilpasses for å analysere de kjemosensoriske responsene til andre nematodearter. </p>
Foraging dyr må integrere innganger fra flere sensoriske modaliteter og velge passende atferdsstrategier for å kunne navigere i deres miljø. Forståelse av hvordan eksterne sensoriske innganger mottas og omdirigert til nevral informasjon for å styre handlingsvalg, er et sentralt mål innen neurobiologi. Den genetisk trekkbare nematoden, C. elegans , er en attraktiv modellorganisme for å studere de nevrale mekanismene som ligger til grunn for sensorisk biologi og multimodal integrasjon. Selv om C. elegans har bare 302 nevroner, kan den oppdage og diskriminere mellom et bredt spekter av miljøstimuli, inkludert oppløselige forbindelser, flyktige luktstoffer og omgivelsestemperatur 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . DeNematode C. elegans er avhengig av sin kjemosensoriske apparat for å lokalisere matkilder og å varsle seg for potensielle trusler. Dermed utfører adferdsanalyser for å skjerme responsene til villtype og mutant C. elegans til kjemiske stimuli en avgjørende rolle i å dissekere de genetiske, cellulære og nevrale mekanismene som ligger til grund for C. elegans bemerkelsesverdige sensoriske evner.
For å analysere responsen på oppløselige forbindelser har tre typer analyser blitt beskrevet – drop-testen, chemotaxis-analysen og retensjonsanalysen. I droppprøven plasseres en liten dråpe av forbindelsen på halen av en bevegelig orm, og ormen har til hensikt å reversere eller bevege seg fremover når væsken når det fremre sensoriske apparatet, scoret 4 . Dråpetesten krever lite eksperimentelt preparat og er nyttig når maskestørrelsen er liten, som i tilfelle laseropererte ormer. Men som bare en ormKan analyseres ad gangen og eksperimentet må være til stede i løpet av analysens varighet, kan droppprøven være tidkrevende. Drop-testen er også sårbar for variasjoner i drop-levering mellom hver orm i en prøve, noe som kan påvirke de samlede resultatene av analysen. En annen begrensning av drop testen er at den bare kan brukes til å analysere ormenes respons på aversive forbindelser, da det ikke er mulig å diskriminere mellom en attraktiv eller nøytral effekt av forbindelsen fra ormens fremadrettede bevegelse.
Chemotaxis-analysen for oppløselige forbindelser innebærer generelt å dele en agarplate i fire kvadranter, idet eksperimentell oppløsning blandes i agar av to motstående kvadranter og kontrolloppløsningen blandes inn i de andre to kvadranter 8 , 9 . Ved starten av analysen plasseres en dråpe buffer som inneholder ormer i midten av platen og antall ormer i Hver kvadrant blir scoret på forskjellige tidspunkter. Chemotaxis-analysen gir større statistisk effekt sammenlignet med dropptesten, da et stort antall ormer blir testet i hver analyse. En begrensning av denne metoden er imidlertid at fremstilling av kjemotaksisanalyseplater krever store mengder av forsøksforbindelsen. Dette vil gjøre det vanskelig å utføre storskala adferdsskjerm hvis en komplisert renseprosess med begrensede utbytter er nødvendig for å oppnå forbindelsen av interesse, som i tilfelle av askarosid-signalmolekylene 10 . I tillegg er manuell telling av ormer gjennom analysen utsatt for feil, og forstyrrelsen av platene under telleprosessen kan påvirke resultatene.
I motsetning til de to nevnte metodene benytter retensjonsanalysen maskinsyn, som minimerer feil under scoringprosessen og reduserer eksperimenters interferens under analysen > 11. Datastyrt analyse av videoopptak av ormadferd kan også potensielt avsløre subtilt atferdsdynamikk som vil bli savnet når scoring bare utføres på enkelte diskrete tidspunkter. I retensjonsanalysen legges to løsninger flekker på motsatte sider av en liten sirkulær bakteriell matrett, fulgt av plassering av et lite antall ormer i midten av matlapet. Ormenes oppførsel blir deretter innspilt, analysert og en preferanseindeksverdi beregnes basert på totalt antall ormpiksler i hver løsningsområde. Selv om tilstedeværelsen av et attraktivt matopplegg muliggjør bruk av mindre populasjoner av ormer i hver analyse, har det tidligere vist seg at mat har blitt sensitivisert for å unngå oppførselstiltak til oppløselige repellanter 12 . Videre utviser ormer en fotofob respons på kortbølgelengde lys og bruken av mikroskop lyskilder som avgir hvitt lys i opptaksoppsettoppsettet kan påvirke atferdS = "xref"> 13.
Formålet med metoden som diskuteres i denne artikkelen er å registrere og analysere C. elegans ' preferanse for oppløselige forbindelser ved bruk av en populasjonsbasert analyse. For dette formål integrerer og forbedrer den nåværende metoden på aspekter fra alle tre av de tidligere diskuterte metodene. Det gjør at store populasjoner av ormer kan testes og krever bare små mengder av den eksperimentelle løsningen som skal brukes i hver analyse. I tillegg utføres analysen i et spesialbygd lukket adferdskammer med infrarød LED-bakgrunnsbelysning for å minimere effektene av kortbølgelengde lys på oppførsel. Hvert kammer kan også utstyres med flere mikroskopkameraer, noe som øker eksperimentell gjennomstrømning uten å kompromittere benkplass. Til slutt produserer videoanalyseprogrammet preferanseindeksverdien for hver video, samt en tilhørende ormenes okkupasjonsplott for å visualisere populasjonsadferd dynamikken over tid. Kammeroppsettet og aSsay-protokollen kan endres ytterligere for å studere multimodale adferdsresponser, for eksempel effekten av luktemidler eller temperatur på kjemosensorisk oppførsel.
Denne artikkelen beskriver konstruksjonen av oppførselskammeret og analyseprotokollen. Det demonstrerer også nytten av denne metoden ved å analysere responsen av villtype-ormer og kjemosensoriske defekte mutanter til den kjente oppløselige repellanten, kobberioner 4 . Endelig er videoanalyseprosessen ved hjelp av den medfølgende programvaren detaljert.
Et kritisk trinn i protokollen er å sikre at analyseplatene har et konsistent tørhetsnivå over ulike eksperimentelle dager. Forskjellige tørhetsnivåer vil resultere i forskjellige diffusjonshastigheter av løsningen i agar og følgelig variasjoner i atferdsmessig utfall. Dermed skal analyseplater alltid gjøres friske på ettermiddagen før eksperimenter. Antall ormer som testes per test bør også reguleres for å lette sammenligningen mellom behandlinger. Til referanse ligger en vildtypeorm på 4-10 egg / h i gjennomsnitt som gir> 360 ormer per test hvis ormsynkroniseringsprotokollen ovenfor følges 17 . Hvis visse mutantstammer egglegger mangelfull, velger du mer gravid voksenorm for egglegging for å nå måletallet av avkom. Et annet viktig skritt i protokollen er å håndtere ormer forsiktig under vaskeprosessen og ormenes plassering. Ormer er følsomme for mekaniske stimuli, noe som fremkaller stressresponser slik S reverseringer og eggleggingsinhibering 18 . Videre bør det tas hensyn til å definere avkastningen nøyaktig og for å bestemme den optimale terskelkonstantverdien for bestemte lysforhold før du fortsetter med videoanalysen. Det anbefales også at kalibrerings- og terskelprosessene gjentas hvis det har gått lang tid siden det siste eksperimentet ble kjørt.
En begrensning av denne metoden er at den ikke er egnet for å analysere små ormpopulasjoner. Imidlertid, hvis det er utført passende kontroller for å bestemme innflytelsen av nærværet av mat på sensorisk oppførsel, utnytter man mat for å begrense ormens romlige undersøkelsessted som i retensjonsanalysen med dette oppsettet. I tillegg er denne metoden ikke ment for å studere stimulusgradientnavigasjon på grunn av nærhet og små mengder av kontroll- og eksperimentelle løsningsdråper som brukes.
E_content "> I fremtiden kan programmeringsprogramvaren som muliggjør flerwormsporing og singleworm-ekstraksjon, integreres i dette systemet 19 , 20. Opptak av subtile oppførselsparametre for enkelormsoppførsel som reverseringshastigheter og amplitud av kroppsbuer vil gi Et mer detaljert bilde av en individuell ormos kjemosensoriske oppførsel i sammenheng med et populasjonsbasert assay. Analysen kan også modifiseres for å studere habituering ved å kjede hull gjennom ROI ved hjelp av sprøyteåler med passende måleformat og fylle hullene med agar infundert Med den eksperimentelle forbindelsen eller kontrollbufferen. Dette vil sikre en mer konsistent overflatekonsentrasjon av forbindelsen over en lengre periode av opptakstid som er nødvendig under vanningsstudier. En annen potensiell anvendelse av denne metoden er å gjennomføre sammenlignende oppførselsstudier på tvers av forskjellige nematodearter. I tillegg oppførselskammeretKan modifiseres på flere måter for å studere atferdsresponser til multimodale stimuli. For optogenetiske applikasjoner kan høyintensitets LED-arrays festes ved siden av kamerafesten for å selektivt aktivere nevroner av interesse under analysen. Varmeelementer, kjølesystemer og temperatursensorer kan også legges til oppsettet for å studere effekten av temperatur på sensorisk oppførsel. Videre kan luktleveringssystemer installeres inne i kammeret for å undersøke samspillet mellom luktsensoriske og kjemosensoriske modaliteter.The authors have nothing to disclose.
Noen stammer ble levert av Caenorhabditis Genetics Center (CGC), som er finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Dette arbeidet støttes av Howard Hughes Medical Institute, med hvilket PWS er en etterforsker.
Aluminum T-slotted framing extrusions | McMaster-Carr | 47065T101 | Single profile, 1" size, solid |
Brackets | McMaster-Carr | 47065T236 | 1" long for 1" high single profile extrusions |
Compact end-feed fasteners | McMaster-Carr | 47065T139 | 1" (single), pack of 4 |
Twist-in solid panel holders | McMaster-Carr | 47065T251 | For 1" high extrusion |
Plastic end caps | McMaster-Carr | 47065T91 | For 1" high extrusion |
Optically clear cast acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K211 | 3/16" thick, 12" x 12" |
Vinyl-coated polyester fabric | McMaster-Carr | 88505K57 | 0.027" thick, 61" width, black |
Brass grommets | McMaster-Carr | 9604K22 | Trade size 0, 0.545" outer diameter |
Steel washers | McMaster-Carr | 90107A029 | 1/4" screw size |
Rounded head screws | McMaster-Carr | 90272A546 | 1/4"-20 thread size, 1-1/2" long |
Standard operating backlight | Smart Vision Lights | See local vendor | 8"x8", infrared 850nm |
IVP-C1 Variable Control Pot | Smart Vision Lights | See local vendor | |
T1 Power Supply | Smart Vision Lights | See local vendor | |
Dino lite Pro AM4113T | Dino-Lite Digital Microscope | See local vendor | |
MS09B microscope stand | Dino-Lite Digital Microscope | See local vendor |