Vi presenterar en uppspelningsuppställning och ett protokoll som möjliggör automatisk analys av nematoden, Caenorhabditis elegans 'preferens för lösliga föreningar i en populationbaserad analys. I denna artikel beskrivs konstruktionen av en beteendeskammare, beteendeanalysprotokollet och användningen av videoanalysprogram.
Den nematod, Caenorhabditis elegans 'kompakta nervsystemet av endast 302 neuroner ligger till grund för en mångsidig repertoar av beteenden. För att underlätta dissektionen av neurala kretsar som ligger bakom dessa beteenden är utvecklingen av robusta och reproducerbara beteendeanalyser nödvändigt. Tidigare C. elegans beteendestudier har använt variationer av ett "dropptest", en "kemotaxisanalys" och en "retentionsanalys" för att undersöka responsen av C. elegans till lösliga föreningar. Metoden som beskrivs i denna artikel syftar till att kombinera de komplementära styrkorna hos de tre ovannämnda analyserna. I korthet är en liten cirkel i mitten av varje analysplatta uppdelad i fyra kvadranter med kontrollen och experimentella lösningar placeras växelvis. Efter tillsatsen av maskarna laddas analysplattorna i en beteendekammare där mikroskopkameror registrerar maskarnas möten med de behandlade områdena. Automatiserad videoanalys utförs sedan aNd ett preferensindex (PI) -värde för varje video genereras. Videoinsamlingen och automatiserade analysfunktioner i denna metod minimerar experimentets engagemang och eventuella associerade fel. Vidare används små mängder av experimentföreningen per analys och beteendekammarens multikamera-inställning ökar experimentell genomströmning. Denna metod är särskilt användbar för att utföra beteendesskärmar av genetiska mutanter och nya kemiska föreningar. Denna metod är emellertid inte lämplig för studier av stimulusgradientnavigering på grund av närhet av kontroll- och experimentella lösningsområdena. Det ska inte användas när endast en liten population av maskar är tillgänglig. Medan det är lämpligt att analysera svar endast på lösliga föreningar i sin nuvarande form, kan denna metod lätt modifieras för att rymma multimodal sensorisk interaktion och optogenetiska studier. Denna metod kan också anpassas för att analysera de kemosensoriska svaren hos andra nematodarter. </p>
Foderdjur måste integrera ingångar från flera sensoriska modaliteter och välja lämpliga beteendestrategier för att lyckas navigera i sin miljö. Förstå hur externa sensoriska ingångar tas emot och omvandlas till neural information för att styra åtgärdsval är ett centralt mål inom neurobiologi. Den genetiskt skurbara nematoden, C. elegans , är en attraktiv modellorganisme för att studera neurala mekanismer som ligger bakom sensorisk biologi och multimodal integration. Även om C. elegans har endast 302 neuroner kan den upptäcka och diskriminera mellan en mängd olika miljöstimuler inklusive lösliga föreningar, flyktiga luktmedel och omgivande temperatur 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . DeNematode C. elegans är starkt beroende av sin kemosensoriska apparat för att lokalisera livsmedelskällor och att varna sig för potentiella hot. Sålunda spelar beteendeanalyser som utformats för att skärma svaren av vildtyp och mutant C. elegans till kemiska stimuli en avgörande roll för att dissekera de genetiska, cellulära och neurala mekanismerna som ligger till grund för C. elegans anmärkningsvärda sensoriska förmåga.
För att analysera svaret på lösliga föreningar har tre typer av analyser beskrivits – dropptestet, kemotaxisanalysen och retentionsanalysen. I dropptestet placeras en liten droppe av föreningen i svansen på en rörlig mask och maskens beslut att vända eller flytta framåt när vätskan når den främre sensoriska apparaten är poäng 4 . Dropptestet kräver liten experimentell beredning och är användbar när maskstorlekens provstorlek är liten, som i fallet med laserstyrda maskar. Men som en enda maskKan analyseras i taget och experimenten måste vara närvarande under hela analysens varaktighet, kan dropptestet vara tidskrävande. Dropptestet är också sårbart för variationer i droppleverans mellan varje mask i ett prov, vilket kan påverka det totala resultatet av analysen. En annan begränsning av dropptestet är att den endast kan användas för att analysera maskens svar på aversiva föreningar, eftersom det inte är möjligt att diskriminera mellan en attraktiv eller neutral effekt av föreningen från maskens framåtriktade rörelse.
Kemotaxisanalysen för lösliga föreningar innefattar allmänt att en agarplatta delas in i fyra kvadranter, varvid den experimentella lösningen blandas i agar av två motstående kvadranter och kontrolllösningen blandas i de andra två kvadranterna 8 , 9 . Vid analysens början placeras en droppe buffert innehållande maskar i mitten av plattan och antalet maskar i Varje kvadrant görs på olika tidspunkter. Chemotaxis-analysen ger större statistisk effekt jämfört med dropptestet, eftersom ett stort antal maskar testas vid varje analys. En begränsning av denna metod är emellertid att beredning av kemotaxisanalysplattorna kräver stora mängder av experimentföreningen. Detta kommer att göra det svårt att genomföra storskaliga beteendesskärmar om en komplicerad reningsprocess med begränsade utbyten erfordras för erhållande av föreningen av intresse, som i fallet med askarosidsignalmolekylerna 10 . Dessutom är manuell räkning av maskar genom analysen mottaglig för fel och störningen av plattorna under räkningsprocessen kan påverka resultatet.
Till skillnad från de två ovannämnda metoderna utnyttjar retentionsanalysen maskinsyn som minimerar fel under scoringprocessen och reducerar experimentens interferens under analysen > 11. Datoriserad analys av videoinspelningar av maskbeteende kan också potentiellt avslöja subtilt beteendynamik som missas när scoring endast utförs på några diskreta tidspunkter. I retentionsanalysen läggs två lösningsfläckar på motsatta sidor av en liten cirkulär bakteriell matplåster följt av placeringen av ett litet antal maskar i mitten av matplåstret. Ormarnas beteende registreras sedan videoinspelat, analyseras och ett preferensindexvärde beräknas baserat på det totala antalet maskpixlar i varje lösningsområde. Fastän närvaron av en attraktiv matplåster möjliggör mindre populationer av maskar att användas i varje analys har mat tidigare visat sig sensibilisera undvikande beteenden till lösliga repellanter 12 . Vidare uppvisar maskar ett fotofobiskt svar på kortvåglängdsljus och användningen av mikroskopljuskällor som avger vitt ljus i uppspelningsregistreringsuppställningen kan påverka beteendetS = "xref"> 13.
Syftet med metoden som diskuteras i denna artikel är att registrera och analysera C. elegans preferens för lösliga föreningar med användning av en populationbaserad analys. För detta ändamål integreras och förbättras den nuvarande metoden på aspekter från samtliga tre av de tidigare diskuterade metoderna. Det gör att stora populationer av maskar kan testas och kräver endast små mängder av den experimentella lösningen som ska användas i varje analys. Dessutom utförs analysen inom en specialbyggd sluten beteendekammare med infraröd LED-bakgrundsbelysning för att minimera effekterna av kortvåglängdsljus på beteende. Varje kammare kan också vara utrustad med flera mikroskopkameror, vilket ökar experimentell genomströmning utan att kompromissa med bänkutrymmet. Slutligen matar videoanalysprogrammen preferensindexvärdet för varje video samt en åtföljande maskbeläggningsplan för att visualisera befolkningsbeteendynamiken över tiden. Kammarinstallationen och aSsay-protokollet kan modifieras ytterligare för att studera multimodala beteendesvar, såsom effekten av luktmedel eller temperatur på kemosensoriska beteenden.
Denna artikel beskriver konstruktionen av beteendekammaren och analysprotokollet. Det visar också nyttan av denna metod vid analys av svaret av vildtypsmaskar och kemosensoriska defekta mutanter till den kända lösliga repellanten, kopparjoner 4 . Slutligen är videoanalysprocessen som använder den medföljande mjukvaran detaljerad.
Ett kritiskt steg i protokollet är att försäkra sig om att analysplattorna har en jämn torrhet över olika experimentella dagar. Olika torrnivåer resulterar i olika diffusionshastigheter för lösningen i agar och följaktligen variationer i beteendeutfall. Analysplattor bör därför alltid göras färsk på eftermiddagen före experiment. Antalet maskar som testas per analys bör också regleras för att underlätta jämförelsen mellan behandlingar. Som referens lägger en vildtypsmask 4-10 ägg / h i genomsnitt som ger 360 maskar per analys om ormsynkroniseringsprotokollet ovan följs 17 . Om vissa mutantstammar är äggläggande defekta, välj mer gravida vuxna maskar för äggläggning för att nå målantalet avkomma. Ett annat viktigt steg i protokollet är att hantera maskar försiktigt under tvättprocessen och maskplaceringen. Ormar är känsliga för mekaniska stimuli, vilket framkallar stressresponser en sådan S reverseringar och äggläggningsinhibering 18 . Vidare bör man se till att avkastningen definieras exakt och för att bestämma det optimala tröskelkonstantvärdet för specifika ljusförhållanden innan man går vidare med videoanalysen. Det rekommenderas också att kalibrerings- och tröskelprocesserna upprepas om en längre tidsperiod har gått sedan det senaste experimentet kördes.
En begränsning av denna metod är att den inte är lämplig för att analysera små maskpopulationer. Om lämpliga kontroller för att bestämma inflytandet av närvaro av mat på det sensoriska beteendet utförs, är det emellertid möjligt att utnyttja mat för att begränsa maskens rumsförforskande plats såsom i retentionsanalysen med denna inställning. Dessutom är denna metod inte avsedd att studera stimulansgradientnavigering på grund av närheten och små mängder av kontroll- och experimentella lösningsdroppar som används.
E_content "> I framtiden kan programmeringsprogramvaran som möjliggör spårning av flera maskar och extraktionsmoment med extraordinära funktioner integreras i detta system 19 , 20. Inspelning av subtila beteendeparametrar för enkelmaskuppförande som omkastningshastigheter och amplitud av kroppsböjningar kommer att ge En mer detaljerad bild av en enskild masks kemosensoriskt beteende i samband med en populationbaserad analys. Analysen kan också modifieras för att studera omvårdnad genom att köra hål genom ROI med hjälp av sprutnålar med lämplig mätstorlek och fylla hålen med agarinfunderad Med försöksföreningen eller kontrollbufferten. Detta kommer att säkerställa en mer konsekvent ytkoncentration av föreningen under en längre tid av inspelningstiden, vilket är nödvändigt vid provningsstudier. En annan potentiell tillämpning av denna metod är att genomföra jämförande beteendestudier över olika nematodsarter. Dessutom uppförandekammarenKan modifieras på flera sätt för att studera beteendemässiga svar på multimodala stimuli. För optogenetiska applikationer kan högintensiva LED-arrays anslutas bredvid kamerafästet för att selektivt aktivera neuroner av intresse under analysen. Värmeelement, kylsystem och temperaturgivare kan också läggas till inställningen för att studera temperaturens effekter på sensoriska beteenden. Dessutom kan luktleveranssystem installeras inuti kammaren för att undersöka växelverkan mellan luktsensor och kemosensoriska modaliteter.The authors have nothing to disclose.
Några stammar tillhandahölls av Caenorhabditis Genetics Center (CGC), som finansieras av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Detta arbete stöds av Howard Hughes Medical Institute, med vilket PWS är en utredare.
Aluminum T-slotted framing extrusions | McMaster-Carr | 47065T101 | Single profile, 1" size, solid |
Brackets | McMaster-Carr | 47065T236 | 1" long for 1" high single profile extrusions |
Compact end-feed fasteners | McMaster-Carr | 47065T139 | 1" (single), pack of 4 |
Twist-in solid panel holders | McMaster-Carr | 47065T251 | For 1" high extrusion |
Plastic end caps | McMaster-Carr | 47065T91 | For 1" high extrusion |
Optically clear cast acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K211 | 3/16" thick, 12" x 12" |
Vinyl-coated polyester fabric | McMaster-Carr | 88505K57 | 0.027" thick, 61" width, black |
Brass grommets | McMaster-Carr | 9604K22 | Trade size 0, 0.545" outer diameter |
Steel washers | McMaster-Carr | 90107A029 | 1/4" screw size |
Rounded head screws | McMaster-Carr | 90272A546 | 1/4"-20 thread size, 1-1/2" long |
Standard operating backlight | Smart Vision Lights | See local vendor | 8"x8", infrared 850nm |
IVP-C1 Variable Control Pot | Smart Vision Lights | See local vendor | |
T1 Power Supply | Smart Vision Lights | See local vendor | |
Dino lite Pro AM4113T | Dino-Lite Digital Microscope | See local vendor | |
MS09B microscope stand | Dino-Lite Digital Microscope | See local vendor |