Analisi di frammento di restrizione terminale modificata per quantificare la lunghezza di telomere utilizzando l'ibridazione in gel

Summary

In questo articolo viene descritto un protocollo dettagliato per quantificare la lunghezza del telomere utilizzando un'analisi del frammento di restrizione terminale modificata che fornisce una misurazione diretta veloce ed efficiente della lunghezza del telomere. Questa tecnica può essere applicata a una varietà di fonti cellulari di DNA per quantificare la lunghezza del telomere.

Abstract

Ci sono diverse tecniche per misurare la lunghezza del telomere, ciascuno con i propri vantaggi e svantaggi. L'approccio tradizionale, l'analisi del frammento di restrizione di Telomere (TRF), utilizza una tecnica di ibridazione del DNA in cui i campioni di DNA genomici vengono digeriti con enzimi di restrizione, lasciando dietro le ripetizioni dei telomeri e qualche DNA sub-telomerico. Questi sono separati dall'elettroforesi del gel agarosio, trasferiti su una membrana filtrante e ibridati a sonde di oligonucleotide tagliate con chemiluminescenza o radioattività per visualizzare i frammenti di restrizione telomere. Questo approccio, pur richiedendo una maggiore quantità di DNA rispetto ad altre tecniche come la PCR, può misurare la distribuzione della lunghezza del telomere di una popolazione di cellule e consente la misurazione espresso in kilobasi assoluti. Questo manoscritto dimostra una procedura di ibridazione del DNA modificata per determinare la lunghezza del telomero. Il DNA genomico viene prima digerito con enzimi di restrizione (che non taglianoTelomeri) e separati da elettroforesi con agarosio gel. Il gel viene quindi asciugato e il DNA viene denaturato e ibridato in situ ad una sonda oligonucleotidica radiolabeled. Questa ibridazione in situ evita la perdita del DNA del telomere e migliora l'intensità del segnale. Dopo l'ibridazione, i gel vengono immagazzinati utilizzando schermi di fosforo e la lunghezza del telomero viene quantificata utilizzando un programma di grafica. Questa procedura è stata sviluppata dai laboratori del Dott. Woodring Wright e Jerry Shay presso l'Università del Texas Southwestern ^{1 , 2} . Qui presentiamo una descrizione dettagliata di questa procedura, con alcune modifiche.

Introduction

I telomeri, situati alle estremità dei cromosomi, sono ripetuti nucleotidi della sequenza TTAGGG (sui cromosomi umani) che svolgono un ruolo fondamentale nella protezione delle informazioni genetiche cellulari ^{3 , 4 , 5} . Telomeres sono diverse migliaia di coppie di base in lunghezza e servono a proteggere l'integrità del resto del cromosoma durante la replicazione del DNA. La replicazione dei cromosomi non è perfetta, con conseguente che le estremità del cromosoma non vengono completamente copiate. Questa inefficienza nella replica viene definita "il problema di replicazione finale" e provoca la perdita di alcune ripetizioni telomere durante ogni ciclo di replica ^{6 , 7} . La lunghezza del telomere può essere ripristinata dopo la divisione cellulare mediante telomerasi, un enzima che sostituisce le sequenze telomere perse ^{8 , 9} . La telomerasi, tuttavia, non lo èAttivato nella maggior parte delle cellule somatiche umane e, di conseguenza, nel tempo, i telomeresi accorceranno, determinando una senescenza cellulare ¹⁰ . A causa dell'allungamento dei telomeri, i telomeri sono considerati biomarker dell'invecchiamento e rischio di malattie legate all'età ^{11 , 12} . Inoltre, la lunghezza del telomere può essere influenzata da fattori genetici, ambientali e di stile di vita e altri stimoli come lo stress ossidativo, che indica che la lunghezza del telomero può svolgere un ruolo di biomarker negli studi tossicologici, epidemiologici e comportamentali ^{13 , 14 , 15} .

Questo articolo dimostra una tecnica per misurare la lunghezza del telomere utilizzando un'analisi modificata del frammento di restrizione terminale (TRF) modificata da Mender e Shay ² e Kimura et al. ¹⁶ , e simili a Herbert, Shay e WrigHt ¹ e Haussmann e Mauck ¹⁷ . Tradizionalmente, l'analisi TRF comporta una procedura di blot Southern. Le macchie meridionali sono considerate "standard gold" per studiare la lunghezza del telomere e sono attivamente utilizzate per esaminare la lunghezza del telomere di leucociti negli studi epidemiologici ¹⁸ . Questa analisi TRF utilizza il DNA genomico digerito lasciando dietro le ripetizioni dei telomeri. I frammenti di DNA vengono quindi separati mediante elettroforesi a gel, denaturati e trasferiti a una membrana di nitrocellulosa. Le sequenze telomere sono ibridizzate ad una sonda di telomere oligonucleotide. Piuttosto che trasferire i telomeresi separati in una membrana, altre tecniche TRF utilizzano tecniche di ibridazione in-gel con e senza denaturazione del DNA. L'inclusione della denaturazione è importante quando si considera la rilevazione di telomeri interstiziali, che sono stati riportati in alcune specie ¹⁹ . Le procedure che non hanno la denaturazione fanno solo rilevareI DNA a singolo filamento presentano sovrapposizioni nei telomeresi terminali e non si legano alle sequenze telomeriche interstiziali ¹⁸ .

Oltre all'analisi TRF, ci sono diverse altre tecniche per misurare la lunghezza del telomere che ognuno ha i propri vantaggi e svantaggi. La tecnica Flow-FISH può misurare la lunghezza media del telomero di singole cellule di un tipo cellulare distinto utilizzando la citometria a flusso ^{16 , 20} . Mentre può accuratamente tagliare telomeri con sonde altamente specifiche e ridurre l'errore umano attraverso l'automazione, Flow-FISH è costoso, meno efficiente e richiede campioni freschi e un tecnico altamente qualificato, limitando la sua capacità di studi epidemiologici ¹⁶ . Inoltre, questo metodo non tiene conto delle potenziali variazioni del numero di cromosomi nella popolazione cellulare. Un'altra tecnica, qPCR, è ampiamente accettata come mezzo per misurare la lunghezza del telomere per studi epidemiologici ²¹ .

La procedura TRF ha delle proprie carenze che limitano l'uso di alcuni studi. Le tecniche TRF richiedono una grande quantità di DNA rispetto ad altri metodi (tra 2 e 3 μg per campione). Ciò limita le applicazioni della tecnica per esaminare la lunghezza del telomero di campioni clinici per i quali può essere raccolto un sufficiente DNA genomico e non può essere utilizzato su campioni di DNA degradati. Inoltre, l'analisi TRF è costosa e intensa e richiede 4-5 giorni per produrre risultati. Tuttavia, il TRF produce un basso coefficiente di varianzaConcedendo la sua riproducibilità. Mentre questo protocollo è diverso dalla macchia tradizionale Southern (utilizzando l'ibridazione gel in situ ), le due tecniche sono fondamentalmente le stesse.

La tecnica presentata qui è una combinazione di una blotta Southern e l'ibridazione in gel; Associando il processo di denaturazione del DNA da macchie di Southern con l'ibridazione in gel. Questa combinazione ha il vantaggio aggiunto di una migliore resistenza del segnale della sonda rispetto alla macchia Southern e ha costantemente reso quantificabili risultati all'interno del nostro laboratorio. Inoltre, l'uso di sonde radioattive piuttosto che le sonde chemiluminescenti produce un'intensità del segnale più elevata e consente la visualizzazione e la quantificazione con un fosforimagno, rendendo le analisi del TRF facile da usare.

Protocol

1. Estrazione del DNA genomico

1. Eseguire un'estrazione genomica del DNA dalle cellule (qui, linea cellulare BJ-hTERT) da analizzare usando un kit di estrazione del DNA commerciale, secondo le istruzioni del produttore.
2. Misurare la concentrazione del DNA con uno spettrofotometro. Se la concentrazione di DNA è inferiore a 100 μg / ml, precipitare il DNA con etanolo e risospendere in un volume di tampone TE (10 mM Tris-Cl, 0,1 mM EDTA (Acido etilendiammetracecticico), pH 8,0). 100-600 μg / mL).

2. Valutazione dell'integrità del DNA

NOTA: Questa parte del protocollo delinea una valutazione dell'integrità del DNA utilizzando un sistema di elettroforesi a gel con un gel da 11 cm x 14 cm. Possono essere utilizzati anche altri sistemi e formati di gel, ma il tempo di migrazione del tensione e del DNA può variare.

1. Preparare un 1% agarosio gel combinando 1 g di agarosio di grado elettroforesi in 100 mL di tampone 1x TAE (40 mM Trè-base; 20 mM acido acetico; 2 mM EDTA; PH 8,5) e forno a microonde finché l'agarosio non viene sciolto e la soluzione è chiara. Raffreddare la soluzione a temperatura ambiente fino a raggiungere 50 ° C (circa 15-20 minuti).
2. Mentre la soluzione agarosa sta raffreddando, preparare il vassoio di fusione gel aggiungendo le porte terminali di colata al vassoio di fusione. Per evitare perdite di agarosio, raffreddare le porte finali a 4 ° C prima di attaccare al vassoio di fusione.
3. Una volta raffreddata la soluzione agarosica a 50 ° C, aggiungere 10 μl di bromuro di etidio (10 mg / ml in dH ₂ O) e versare la soluzione agarosica nel vassoio di fusione gel. Aggiungere il pettine al vassoio di fusione.
4. Lasciare che la soluzione agarosa si indurisca per 45 minuti a temperatura ambiente.
5. Preparare i campioni di DNA per l'elettroforesi diluendo 25 ng di DNA genomico usando 1x tampone TE fino a un volume finale di 9 μL e aggiungere 1 μl di 10x carica colorante (0,25% (w / v) blu bromofenolo, 0,25% (w / v) xilene Cianolo FF, 30% (v / v) glicerolo). Mescolare bene.
6. Eseguire la migrazione del DNA a 100 V per circa 2 ore o fino a quando la tintura blu bromofenol è approssimativamente a metà del gel.
7. Immagine il gel utilizzando un transilluminatore a luce ultravioletta o equivalente.
   NOTA: I campioni di DNA con buona integrità hanno bande ad alto peso molecolare senza deposizione (che è dovuto a DNA distaccato o rotto). Se le bande del DNA sono macchiate, hanno una bassa integrità e non sono adatte all'analisi del blot di Southern, e il DNA deve essere ri-isolato con le cellule fresche.

3. Digestione del DNA genomico

1. Eseguire la digestione del DNA genomico in un volume finale di 20-40 μL.
   NOTA: volumi maggioriDi 40 μL si trafigge i pozzetti del gel agarosio.
   1. Combinare 3 μg di DNA genomico e la quantità appropriata di tampone digestivo 10x (fornito con gli enzimi di restrizione) in modo che la concentrazione finale sia 1x, in un microprocessore. Aggiungere 1 μl di enzima di restriction RsaI (10.000 U / mL) e 1 μl di enzima di restringimento HinfI (10.000 U / mL) ad ogni tubo. Regolare il volume finale usando H ₂ O sterile, deionizzato. Miscelare bene. Centrifugare brevemente (10-15 s a 16.000 xg) per assicurare che tutti i componenti siano nella parte inferiore del tubo.
2. Incubare le digestioni a 37 ° C per ≥16 h. Dopo la digestione conservare il DNA digerito a 4 ° C o -20 ° C per non più di 2 giorni se necessario ¹⁷ .

4. Elettroforesi del DNA del DNA genomico

NOTA: Questa parte del protocollo descrive una procedura per l'utilizzo di un sistema di elettroforesi a gel da 20 cm x 25 cm. Elettrodo gel diversoPossono essere utilizzati sistemi phoresis, ma potrebbero essere necessari modifiche di variabili tra cui la tensione, il tempo di migrazione e la quantità di tampone di elettroforesi aggiunti al sistema per ottenere risultati ottimali.

1. Preparare la soluzione agarosica del 0,6% combinando 2,25 g di agarosio con elettroforesi a gel con 375 mL di tampone di elettroforesi, 1x TAE o 0,5 TBE (base 110 mM Tris, 90 mM acido borico, 2,5 mM EDTA, pH 8,3).
   NOTA: Per i telomeresi inferiori a 8.000 kB, si consiglia 0,5 x TBE, mentre 1x TAE è raccomandato per i telomeri tra 8.000 kB e 20.000 kB ¹ .
2. Microonde la soluzione fino a quando l'agarosio si è sciolto e la soluzione è chiara. Lasciare raffreddare la soluzione per 15 - 20 minuti a temperatura ambiente o fino a quando l'agarosio raggiunge i 50 ° C.
3. Mentre la soluzione agarosica è raffreddata, preparare il sistema di elettroforesi gel per la fusione di gel come descritto nel punto 2.2. Versare la soluzione di gel agarosio in un vassoio di fusione gel. Mettere un pettine inIl gel. Lasciare indurire il gel per 45 minuti scoperto a temperatura ambiente.
4. Preparare i campioni del DNA digerito per l'elettroforesi. Per una reazione di 40 uL, aggiungere 0,4 μL di colorante di caricamento da 10 volte in ciascun campione di DNA digerito. Brevemente centrifugare (10-15 s, 16.000 xg) per assicurare che tutta la soluzione sia nella parte inferiore del tubo.
5. Preparare il sistema di elettroforesi gel per la migrazione del DNA. Rimuovere le porte finali e pettine dal gel. Riempire il sistema di elettroforesi gel con 1x TAE o 0.5x TBE alla linea di riempimento, assicurando che il gel sia completamente sommerso nel tampone.
6. Caricare i pozzetti del gel con i campioni del DNA in modo che esista un pozzo vuoto tra i campioni. Evitare di causare bolle o di foratura del gel. Aggiungere 10 μL di una scala del DNA nei pozzetti sulle estremità opposte del gel.
   NOTA: Il tipo di scala del DNA dipenderà dalla lunghezza dei telomeri, che varia da persona a persona e tra fonti cellulari.
7. Esegui l'elettroforesi a gel a 150 V per 30 minuti per spostare rapidamente il DNA nel gel; Quindi regolare la tensione a 57 V ed eseguire per 18-24 h.

5. Imaging e Ibridazione Fluorescenti Gel

1. Dopo 18-24 ore, disattivare la fonte di alimentazione dell'elettroforesi gel. Rimuovere il vassoio di fusione gel con il gel dal tampone di elettroforesi. Slice dall'angolo in alto a destra del gel per servire come riferimento per l'orientamento del gel.
2. Preparare un pezzo di carta filtrante tagliando la carta per essere una dimensione leggermente più grande del gel. Posizionare la carta filtrante sulla parte superiore del gel nel vassoio di fusione e lasciare che la carta solleva la soluzione in eccesso sul gel. Rimuovere con cautela le bolle d'aria tra la carta filtrante e il gel usando una pipetta come rullo per spremere le bolle attraverso i lati.
3. Rimuovere il gel dal vassoio di fusione spostando il gel e filtrando la carta in modo che la carta sia sotto il gel. Trasferire il gel con la carta filtrante ad un asciugatore per gel e coprire ilGel con involucro in plastica. Rimuovere tutte le bolle d'aria tra l'involucro di plastica e il gel utilizzando una pipetta come rullo.
4. Asciugare il gel per 2 ore a 50 ° C.
5. Una volta asciugata, rimuovere l'involucro di plastica e trasferire il gel e la carta filtrante su un piatto di vetro contenente 250 ml di acqua deionizzata (sufficiente per coprire il gel). Rimuovere con cautela la carta filtrante e incubare il gel a temperatura ambiente per 15 minuti. Il gel sarà sottile, rigido e facile da manipolare senza strappi.
6. Preparare la soluzione 5x SSC (750 mM NaCl; 75 mM citrato di sodio) in acqua deionizzata.
7. Posare il gel sopra una maglia di nylon (12 in x 12 in). Roll la maglia di nylon e il gel insieme assicurandosi che il gel non sia in contatto con se stesso. Posizionare la maglia e il gel in un tubo di ibridazione ( ad esempio , 12 in tubo con diametro di 1,5 ").
   NOTA: quando viene rotolato correttamente, il gel sarà in contatto con la rete in nylon su entrambi i lati.
8. Combinare 100 mL di 5x SSC e 12 μL di nuclei fluorescenti verdi aMacchiare e collocare nel tubo di ibridazione. Proteggere la soluzione dalla luce e incubare per 30 minuti a 42 ° C in un forno di ibridazione con rotazione.
9. Rimuovere la maglia / gel di nylon dal tubo di ibridazione, rotolare e collocare in un piatto di vetro contenente 250 ml di acqua deionizzata e rimuovere delicatamente la maglia di nylon. Immagine il gel utilizzando un fosforo. Utilizzare le impostazioni fluorescenti: 520 BP, 40 Blue e 488 nm. Impostare il tubo fotomoltiplicatore (PMT) a 375, il piano focale a +3 mm e la sensibilità al normale. Salvare l'immagine in un file.

6. Ibridazione

1. Preparare la sonda telomere radioattiva.
   1. Combinare 2 μl (2 ng) di sonda telomera (5- (CCC TAA) ₄ 3 '), 2,5 μL di tampone di reazione polinucleotide chinasi 10x, 3 μl di γ ³² P-dATP (6000 Ci / mmol), 4 μl di T4 Polinucleotide chinasi e DNasi libera, l'acqua deionizzata sterile fino ad un volume finale di 20 μL in un micrTubo di ocentrifuga.
      Attenzione: attenersi alla sicurezza radioattiva delle strutture e ai regolamenti quando si utilizza la radioattività.
2. Brevemente centrifugare (10-30 s a 16.000 xg) e incubare in bagno d'acqua a 37 ° C per 1 ora. Centrifugare per 10-30 s a 16.000 xg e incubare a 65 ° C per 20 minuti per fermare la reazione.
3. Utilizzando una colonna di microspin di cromatografia G-25, mescolare il contenuto della colonna vortexando, quindi centrifugare per 1 min a 700 xg a temperatura ambiente. Scartare il filtrato.
4. Caricare la soluzione di sonda radioattiva nella colonna di cromatografia G-25 e centrifugare per 2 min a 700 x g. Salva il filtrato.
   NOTA: conservare il filtrato in quanto contiene la sonda telomere radioattiva. La sonda radioattiva può essere conservata a 4 ° C se necessario.
5. Preparare 250 ml di soluzione di denaturazione composta da 1,5 M NaCl e 0,5 M NaOH in acqua sterile deionizzata.
6. Posizionare il gel in un piatto di vetro contenente 250 ml di soluzione denaturante e incubareMangiato per 15 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione di denaturazione e sostituire con 250 ml di acqua sterile deionizzata. Incubare per 10 minuti su un agitatore orbitale (40 - 50 giri / min) a temperatura ambiente.
7. Preparare 250 ml di soluzione di neutralizzazione composta da 1,5 NaCl e 0,5 M di acido tris-cloridrico, pH 8,0, in acqua sterile deionizzata.
8. Rimuovere l'acqua deionizzata e sostituire con soluzione di neutralizzazione da 250 ml e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
9. Durante l'incubazione nella soluzione di neutralizzazione, preparare 50 ml di soluzione di ibridazione composta da 5x SSC, 5x Denhardt soluzione (0.1% polimero sintetico non ionico, 0.1% polivinilpirrolidina, 0.1% albumina bovina serba), 10 mM fosfato di sodio (Na ₂ HPO ₄ ) e 1 mM di sodio pirofosfato tetrabasico decaidrato (Na ₄ P ₂ O _7, 10 H ₂ O) in acqua sterile deionizzata.
10. Girare il gel in maglia di nylon e collocare nel tubo di ibridazione (passo5.7). Aggiungere 20 ml della soluzione di ibridazione e incubare in un forno di ibridazione a 42 ° C per 10 min con rotazione.
11. Rimuovere la soluzione di ibridazione e sostituire con 20 ml di soluzione di ibridazione fresca. Aggiungere la totalità della sonda telomera e incubare in un forno di ibridazione a 42 ° C per una notte con rotazione.

7. Lavaggio del gel, esposizione dello schermo di fosforo e radiofotografia

1. Preparare 500 ml di soluzione 2x SSC (300 mM NaCl, 30 mM citrato di sodio) in acqua sterile deionizzata.
2. Preparare 250 ml di 0,1x SSC (15 mM NaCl, 1,5 mM citrato di sodio) e 0,1% Sodio Dodecil Solfato (SDS) in acqua deionizzata.
3. Rimuovere il gel e la maglia dal tubo di ibridazione e collocare in un piatto di vetro contenente 250 mL di 2x SSC. Srotolare e rimuovere la maglia di nylon dal piatto. Posizionare il piatto di vetro su un agitatore orbitale e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
4. Rimuovere il 2x SSC e sostituire con 250 mL di 0.1x SSC e 0.1% SDS e incubare per 15 minuti su un agitatore orbitale a temperatura ambiente.
5. Durante l'incubazione, esporre la schermata Phosphor alla gomma dell'immagine per 15 minuti.
6. Rimuovere la soluzione 0.1x SSC e 0.1% SDS e sostituire con 250 mL di 2x SSC. Incubare per 15 minuti su un agitatore orbitale.
7. Rimuovere il gel dalla soluzione 2x SSC e avvolgere il gel in un involucro di plastica o collocare in un sacchetto sigillabile a caldo. Rimuovere tutte le bolle e le tasche d'aria tra il gel e l'involucro di plastica o la borsa di plastica. Posizionare il gel in una cassetta di esposizione con lo schermo Phopshor. Esporre la schermata del fosforo al gel durante la notte.
8. Immagine dello schermo Phosphor esposto utilizzando un fosforimagnetico.

8. Quantificazione della lunghezza di Telomere

1. Aprire il file fosforimagente contenente l'immagine fluorescente del gel verde fluorescente colorato acido nucleico ( Figura 1 ).
2. Seleziona 'Strumenti' e poi 'Pixel Distance'9 ;. Utilizzando il mouse, disegnare una linea dalla parte inferiore del gel fino alla metà della prima fascia di marcatori e registrare la distanza. Ripetere questa procedura per ogni banda marcatore ( Figura 2 ). Queste distanze saranno utilizzate nel programma di grafica come descritto di seguito.
3. Aprire la figura del fosforo del gel radiomarcato ( figura 3 ). Seleziona 'Object Manager' e poi 'Griglia'. Impostare la griglia su 1 colonna e 150 righe. Regolare la griglia in modo che si estenda dalla parte superiore del gel al fondo del gel. Regolare la larghezza della griglia in modo che sia uguale alla larghezza della corsia, facendo clic sul bordo della griglia e trascinando la larghezza della griglia per essere uguale alla larghezza della corsia.
4. Copiare questa griglia (in modo che la larghezza e l'altezza delle caselle rimangano uguali) e spostare la seconda griglia in una corsia vuota (per scopi di sfondo). Continuare a copiare e spostare ulteriori griglie per ulteriori percorsi di esempio.
   NOTA: al termine, dovrebbe esserciGriglie per ogni corsia di campionamento e una griglia di corsia vuota per lo sfondo ( Figura 4 ).
5. Selezionare "Analisi" e poi "Rapporto Volume" Selezionare tutte le griglie per il report Una volta che il rapporto di volume viene visualizzato, fare doppio clic sul report per attivare il programma di fogli di calcolo Salvare il foglio di foglio di calcolo I dati per questo file saranno Sotto la corsia "Volume".
6. Aprire un appropriato programma di grafica e creare nuovi dati e tabelle. Selezionare 'Y: Immettere e tracciare un singolo valore Y per ogni punto', quindi selezionare 'Crea'.
7. Etichetta la prima colonna (colonna X) come 'Distanza misurata' e contrassegnare la seconda colonna (colonna Y) come 'Peso molecolare'. Immettere i pesi molecolari del marcatore di ciascuna banda marcatrice nella colonna Y. Inserire le distanze di migrazione ottenute nel punto 8.2 corrispondenti a ciascun marcatore di peso molecolare.
8. Vai a 'Analisi' e seleziona 'Analizza' e poi 'regressi non lineariOn (curva fit) 'e selezionare' OK '. Nella schermata successiva, selezionare 'Esponenziale e poi' Decadimento di una fase '. Selezionare la scheda "Intervallo" e inserire "150" in "numero di punti che definiscono la curva" e selezionare "Crea una tabella delle coordinate XY per esportare o copiare la curva in un altro programma".
   NOTA: Il risultato, 'forma non lineare di dati 1', contiene il peso molecolare per ogni distanza nella riga Y.
9. Per l'analisi delle linee del campione, selezionare un'area di analisi che è sopra e sotto le bande telomere effettive. Non utilizzare l'intera lunghezza della corsia ( Figura 5 ). Determinare le posizioni della griglia per l'area di analisi di ciascuna corsia.
10. Seleziona 'File', 'Nuovo' 'Crea nuova tabella e grafico'. Selezionare 'Y: Immettere e tracciare un singolo valore Y per ogni punto', quindi selezionare 'Crea'. Copiare e incollare i valori di volume della corsia di sfondo (valori di intensità) dal file del foglio di calcoloNella prima colonna (X) ei valori di volume (valori di intensità) dalla corsia di campionamento nella prima colonna Y. Se ci sono più corsie di esempio, copiare ogni set di valori di volume dal file foglio di calcolo in colonne Y aggiuntive nel programma di grafica file.
11. Eliminare i valori dalla colonna di sfondo (X) e da ogni corsia di campionamento (Y) che sono al di fuori delle aree di analisi determinate nel passaggio 8.8.
    NOTA: la tabella dati deve contenere solo valori in quelle posizioni griglia corrispondenti alle aree di analisi.
12. Seleziona Analisi, quindi "Analizza" e "trasforma". Fai clic su "OK". Selezionare 'Trasformare valori Y utilizzando Y = YX'. Questo trasformerà i dati in Dati 2 (valore di intensità trasformata (Y) = intensità del campione (Y) - intensità di sfondo (X)).
    1. Seleziona Analisi quindi "Analizza", "Analisi Colonna" e "Statistiche Colonne". Selezionare OK. La scheda dei risultati 'Col. Le statistiche della trasformazione dei dati 2 'Sotto la riga "Sum", Σ (Int _i ).
13. Seleziona 'File', 'Nuovo', 'Crea nuova tabella e grafico'. Selezionare 'Y: Immettere e tracciare un singolo valore Y per ogni punto', quindi selezionare 'Crea'. Copiare e incollare i dati della colonna Y dalla pagina dei risultati 'Nonlin fit di Dati 1, curva' nella nuova colonna X. Copia e incolla i dati della colonna Y dalla pagina dei risultati "Trasforma i dati 2" nella nuova colonna Y. Seleziona Analisi quindi "Analizza" e "Trasforma". Fai clic su "OK". Selezionare 'Trasformare valori Y utilizzando Y = Y / X'.
    1. Seleziona Analisi quindi "Analizza", "Analisi Colonna" e "Statistiche Colonne". Selezionare OK. La scheda dei risultati 'Col. Le statistiche di trasformazione dei dati 3 'si trovano sotto la riga "Sum", Σ (Int _i / MW _i ). MW = peso molecolare.
14. Per calcolare la lunghezza media del telomero (TL) per ciascun campione, utilizzare il tastoFormula TL = Σ (Int _i ) / Σ (Int _i / MW _i ).

Representative Results

Sono state analizzate tre concentrazioni di DNA (1, 2 e 3 μg) isolate dalla linea cellulare BJ-hTERT (telomerasi immortalizzate di fibroblasti umane prepuntite) ²² e cellule mononucleate periferiche umane umane (PBMCs) per lunghezza telomere. La tabella 1 mostra le assegnazioni della corsia per ciascun campione di DNA. La figura 1 mostra una macchia fluorescente dell'acido nucleico del gel. Gli standard di peso molecolare sono chiaramente visibili. La distanza dalla cima del gel a ogni standard di peso molecolare è stata determinata ( Figura 2 ). La figura 3 mostra l'immagine del fosforo del gel dopo l'ibridazione con la sonda telomera. Le bande di telomere sono mostrate come strisce in ogni corsia. Le griglie di 150 scatole sono state calcolate per ogni corsia più una corsia di fondo ( figura 4 ). Le aree di analisi corrispondenti alle aree delIl gel contenente le bande di telomero per ciascuna serie di campioni è mostrato in Figura 5 . Per ciascuna serie di campioni sono stati selezionati brani di sfondo separati per garantire che le intensità di sfondo siano simili per ciascun gruppo di campioni (corsie contrassegnate da B in Figura 5 ). La tabella 2 mostra le lunghezze di frammento di restrizione telomere per ciascun campione. La lunghezza media del telomero nella linea cellulare immortalizzata hTERT (BJ-hTERT) è superiore a quella osservata nei PBMC umani (confronta le corsie 2, 4 e 6 con le corsie 10, 12 e 14 in figura 3 ). Questi risultati dimostrano anche che la quantità di DNA genomico analizzata in ogni corsia è fondamentale per ottenere un segnale rilevabile dopo l'ibridazione. Per i campioni con telomeri che sono abbastanza uniformi ( cioè la linea cellulare BJ-hTERT) è stato rilevabile fino a 1 μg utilizzando questa procedura (anche se il segnale era molto debole). Tuttavia, per i campioni con telomeri che hanno aVarianza maggiore ( cioè PBMC umani), la quantità minima di DNA che fornisce un segnale affidabile è 2 μg.

Figura 1 : Gel verde macchiato di acido nucleico fluorescente verde. Fosforo del gel agarosico secco macchiato con macchia verde fluorescente di acido nucleico che mostra l'ubicazione delle bande di scala del DNA (corsie 1 e 8). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Determinazione della Distanza di Migrazione della Band Marker . Le frecce blu indicano la distanza misurata dalla parte superiore del gel a eaCh banda di scala del DNA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Figura di fosforo di campioni di DNA prolattati con la sonda Telomere. Le righe 2, 4 e 6 contengono DNA BJ-hTERT (rispettivamente 1,2, e 3 μg). Le righe 10, 12 e 14 contengono DNA umano PBMC (rispettivamente 1, 2 e 3 μg). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : Posizione della griglia. Schermata che mostra la posizione di150 griglie di conteggio per ogni corsia analizzata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5 : Settori di analisi. Fosforo immagine delle bande di telomere che mostrano le aree selezionate di analisi per ciascuna serie di campioni. Le tracce 2, 4 e 6 contengono il DNA BJ-hTERT; Le strade 10, 12 e 14 contengono DNA umano PBMC. B = percorsi di fondo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

corsia	Campione
1	Scala del DNA
2	BJ-hTERT 1 &# 181; g
3	vuoto
4	BJ-hTERT 2 μg
5	vuoto
6	BJ-hTERT 3μg
7	vuoto
8	Scala del DNA
9	vuoto
10	PBMCs 1μg
11	vuoto
12	PBMCs 2μg
13	vuoto
14	PBMCs 3μg
	Campioni di DNA separati sul gel agarosico del 0,6%

Tabella 1: Assegnazioni del campione di agarosio del DNA.

Campione (Lane)	& #8721; (Int i )	Σ (Int i / MW i )	Lunghezza telomere media = Σ (Int i ) / Σ (Int i / MW i )
BJTert 1ug (1)	268.691	20596	13.04578559
BJTert 2ug (2)	1357000	103204	13.14871517
BJTert 3ug (3)	1962000	148.411	13.22004434
PBMC 1ug (4)	-416.337	-142.585	2.91992145
PBMC 2ug (5)	286.653	62845	4,561,269791 millions
PBMC 3ug (6)	1880000	524123	3,586,944286 millions

Tabella 2: Calcoli medi di lunghezza telomere.

Discussion

Dopo l'elettroforesi, la macchia genomica del DNA è superiore a 800 bp. Ciò può verificarsi se gli enzimi di restrizione sono difettosi o se sono necessari ulteriori enzimi (come sopra descritto). Una seconda possibile spiegazione è che la proteina è ancora attaccata al DNA. Nel determinare la concentrazione del DNA mediante spettrofotometro, il rapporto 260/280 dovrebbe essere di circa 1,8. Se questo rapporto è <1,5, vi è contaminazione di proteine ​​che può interferire con la digestione dell'enzima di restrizione. Il campione di DNA dovrà essere ri-isolato o la proteina dovrebbe essere rimossa con una digestione di proteinasi K e fenolo: estrazione di cloroformio seguita da precipitazione di etanolo. L'uso di un kit di isolamento del DNA commerciale provoca sistematicamente il DNA con un rapporto 260/280 di 1,8-1,85.

Dopo l'esposizione del gel a uno schermo di fosforo, non sono stati rilevati frammenti di telomere. Ciò può derivare da una scadente sonda di telomere con etichetta radio, impropria ibridazioneCondizioni o quantità insufficiente di DNA genomico di partenza. Durante la preparazione della sonda di telomere, alla fine della centrifugazione della colonna G-25, deve essere facilmente rilevabile la radioattività nel flusso (che rappresenta la sonda telometrica a radiofrequenza). Se la radioattività non viene rilevata, si è verificato un problema con la preparazione della sonda. È altresì importante garantire che la temperatura di ibridazione non superi i 42 ° C (per prevenire la fusione della sonda: il complesso di template) e che il tampone di ibridazione interiora completamente il gel nella camera di ibridazione. La quantità minima di DNA genomico che fornisce telomeri rilevabili è di 2,0-3,0 μg. Le quantità minime di materiale di partenza possono causare un segnale molto debole a nessun segnale dopo l'ibridazione.

Questo protocollo richiede 2-3 μg per ogni determinazione della lunghezza del telomere. Se i campioni devono essere eseguiti in duplicati o in triplice copia, è necessario 6-12 μg di DNA. Ciò impedisce la th È la procedura da utilizzare sui campioni con quantità limitata di DNA. La procedura è abbastanza laboriosa che richiede 3-4 giorni per completare. Il numero di campioni analizzati in una sola volta è limitato al numero di impianti di elettroforesi gel e della dimensione del pettine per gel agarosio. Di conseguenza, è meno che ideale per gli studi che impiegano un gran numero di campioni (come studi epidemiologici).

Le tecniche di ibridazione del DNA dei telomeresi separate dall'elettroforesi del gel rimangono il gold standard per determinare la lunghezza del telomere. Nessuna altra procedura misura direttamente la lunghezza del telomero con conseguente dimensione telomere reale.

Ci sono diversi passi critici in questa procedura. In primo luogo, il campione del DNA deve avere una buona integrità, vale a dire non tagliata. Il DNA che è stato tagliato può provocare risultati false di lunghezza della telomere. È anche importante che le digestioni del DNA siano complete. La digestione del DNA genomico dovrebbe provocare una striscia di DNA di 800 bp o meno"Xref"> 2. Per garantire una corretta digestione, alcune procedure hanno descritto un totale di 6 enzimi di restrizione (anziché RsaI e Hinf1 come descritto in questa procedura). Gli enzimi aggiuntivi di restrizione includono HhaI, MspI, HaeIII e AluI2. Un secondo passo critico è consentire il funzionamento del gel agarosico abbastanza a lungo per ottenere una corretta separazione del DNA digerito. Se c'è una migliore separazione, allora c'è maggiore precisione nelle analisi. Il tempo di esecuzione del gel dovrebbe essere abbastanza lungo in modo che i frammenti di DNA che rappresentano 1 Kbp si trovino nella parte inferiore del gel ( Figura 1 ). A seconda della dimensione del gel e della tensione dell'elettroforesi, questo può richiedere 12 a 24 h. Un terzo passo critico è l'ibridazione. Deve essere presente un sufficiente tampone di ibridazione nel tubo della camera per immergere l'intero gel quando il tubo è orizzontale. Livelli insufficienti di tampone di ibridazione possono provocare ibridazione irregolare della sonda telomera.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biologics
Rsa1, restriction enzyme	New England Biolabs, Inc	R0167S	10,000 U/mL, DNA digestion.  Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer)
Hinf1, restriction enzyme	New England Biolabs, Inc	R0155S	10,000 U/mL, DNA digestion.  Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer)
Seakem GTG Agarose	Lonza	50071	electrophoresis grade agarose
Optikinase	affymetrix	78334X 500 UN	T4 Polynucleotide Kinase
SYBR Green Nucleic Acid Stain I	ThermoFisher Scientific	S7567	Syber Green
exactGene DNA Ladder 24- kB	Fisher Scientific	BP2580100
C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5)	Integrated DNA Technologies		Custom ordered DNA oligonucleotide
Gamma-ATP-P32	Perkin Elmer	BLU502Z	Radioisotope
Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit	Qiagen	13323	DNA extraction kit
GE Illustra Microspin G-25 column	GE Healthcare Life Sciences	27-5325-01	For purification of readioactive oligo probe
Ficoll 400			non-ionic synthetic polymer
Equipment/Software
Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm)	ThermoFisher Scientific	A5	Gel electrophoresis
Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm)	Corel Life Sciences	11068020	Gel electrophoresis
Nylon mesh, 50, 12" x 12"	Ted Pellam, Inc	41-12105
GE Storage Phosphor Screens	GE Healthcare Life Sciences	28-9564-75
Phosphor Screen Exposure Cassette	GE Healthcare Life Sciences	63-0035-44
Isotemp Hybridzation Incubator	Fisher Scientific	13-247-20Q
Cylindrical hybridization tubes	Fisher Scientific	13-247-300
The Belly Dancer orbital shaker	Sigma-aldrich	Z768499-1EA	Orbital shaker
Typhoon 9400	ABI		For imaging of gels and phosphor screens
GraphPad Prism 6	GraphPad	Version 6.05	Graphing Program
Microsoft Excel	Microsoft	Office 365	Spreadsheet program
Nanodrop	Thermo Scientific	Nanodrp 2000	Spectrophotometer