Summary
I denne artikkelen diskuteres en detaljert protokoll for kvantifisering av telomerlengden ved hjelp av en modifisert terminalrestriksjonsfragmentanalyse som gir rask og effektiv direkte måling av telomerlengden. Denne teknikken kan brukes på en rekke cellekilder til DNA for kvantifisering av telomerlengden.
Abstract
Det finnes flere forskjellige teknikker for måling av telomer lengde, hver med sine egne fordeler og ulemper. Den tradisjonelle tilnærmingen, Telomere Restriction Fragment (TRF) analyse, benytter en DNA-hybridiseringsteknikk hvorved genomiske DNA-prøver spaltes med restriksjonsenzymer, etterlater telomere DNA-gjentagelser og noe subteltomer DNA. Disse separeres av agarosegelelektroforese, overføres til en filtermembran og hybridiseres til oligonukleotidprober merket med enten kjemiluminescens eller radioaktivitet for å visualisere telomer-restriksjonsfragmenter. Denne tilnærmingen, mens den krever en større mengde DNA enn andre teknikker som PCR, kan måle telomer-lengdefordelingen av en populasjon av celler og tillater måling uttrykt i absolutte kilobaser. Dette manuskriptet demonstrerer en modifisert DNA-hybridiseringsprosedyre for å bestemme telomerlengden. Genomisk DNA blir først fordøyd med restriktjonsenzymer (som ikke kuttesTelomerer) og separert av agarosegelelektroforese. Gelen blir deretter tørket og DNA-denaturert og hybridisert in situ til en radiomerket oligonukleotidprobe. Denne in situ hybridiseringen unngår tap av telomere DNA og forbedrer signalintensiteten. Etter hybridisering blir gelene avbildet ved bruk av fosforskjermbilder og telomerlengden kvantifiseres ved hjelp av et grafeprogram. Denne prosedyren ble utviklet av laboratoriene i Drs. Woodring Wright og Jerry Shay ved University of Texas Southwestern 1 , 2 . Her presenterer vi en detaljert beskrivelse av denne prosedyren, med noen modifikasjoner.
Introduction
Telomerer, som ligger i endene av kromosomer, er nukleotidrepetisjoner av sekvensen TTAGGG (på humane kromosomer) som spiller en kritisk rolle for å beskytte cellegenetisk informasjon 3 , 4 , 5 . Telomerer er flere tusen basepar i lengde og tjener til å beskytte integriteten til resten av kromosomet under DNA-replikasjon. Replikasjon av kromosomer er ikke perfekt, noe som resulterer i at endene av kromosomet ikke blir fullstendig kopiert. Denne ineffektiviteten i replikasjon kalles "end replikasjonsproblemet" og resulterer i tap av noen av telomere-gjentakelsene under hver omgang av replikering 6 , 7 . Telomer lengde kan gjenopprettes etter celledeling ved telomerase, et enzym som erstatter de tapt telomere sekvensene 8 , 9 . Telomerase er imidlertid ikkeAktivert i de fleste menneskelige somatiske celler, og som et resultat vil telomerer over tid forkorte, noe som til slutt resulterer i cellulær senescens 10 . På grunn av telomereforkortelse betraktes telomerer som en biomarkør av aldring og risiko for aldersrelaterte sykdommer 11 , 12 . I tillegg kan telomer lengde påvirkes av genetiske, miljømessige og livsstilsfaktorer og andre stimuli som oksidativt stress, noe som indikerer at telomer lengde kan spille en rolle som biomarkør i toksikologiske, epidemiologiske og atferdsstudier 13 , 14 , 15 .
Denne artikkelen demonstrerer en teknikk for å måle telomerlengden ved bruk av en modifisert terminalrestriksjonsfragment (TRF) analyse tilpasset fra Mender og Shay 2 og Kimura et al. 16 , og lik Herbert, Shay og WrigHt 1 og haussmann og Mauck 17 . Tradisjonelt involverer TRF-analyse en Southern blot-prosedyre. Southern blots betraktes som "gullstandarden" for å studere telomererlengde og brukes aktivt til å undersøke leukocyttelomererlengde i epidemiologiske studier 18 . Denne TRF-analysen bruker fordøyd genomisk DNA som etterlater telomere-gjentakelsene. DNA-fragmentene separeres deretter ved gelelektroforese, denatureres og overføres til en nitrocellulosemembran. Telomere-sekvensene hybridiseres til en telomer-oligonukleotidprobe. I stedet for å overføre de separerte telomerer til en membran, bruker andre TRF-teknikker in-gel hybridiseringsteknikker med og uten denaturering av DNA. Inkluderingen av denaturering er viktig når man vurderer deteksjon av interstitiale telomerer, som er blitt rapportert hos noen arter 19 . Prosedyrer som mangler denatureringstrinn, oppdager bare detE enkeltstrenget DNA overheng ved terminale telomerer og vil ikke binde seg til interstitiale telomere sekvenser 18 .
Foruten TRF analyse er det flere andre teknikker for måling av telomere lengde som hver har sine egne fordeler og ulemper. Flow-FISH teknikken kan måle gjennomsnittlig telomer lengde av individuelle celler av en distinkt celletype ved hjelp av flytcytometri 16 , 20 . Selv om det er nøyaktig å merke telomerer med svært spesifikke sonder og redusere menneskelig feil gjennom automatisering, er Flow-FISH dyrere, mindre effektiv og krever friske prøver og en høyt kvalifisert tekniker som begrenser sin evne til epidemiologi studier 16 . I tillegg utgjør denne metoden ikke potensielle endringer i antall kromosomer i cellepopulasjonen. En annen teknikk, qPCR, er allment akseptert som et middel til å måle telomerlengden for epidemiologi studier 21 .
TRF-prosedyren har sine egne mangler som begrenser bruken av dette til noen studier. TRF teknikker krever en stor mengde DNA sammenlignet med andre metoder (mellom 2 og 3 μg per prøve). Dette begrenser teknikkens anvendelser for å undersøke telomererlengden av kliniske prøver for hvilke tilstrekkelig genomisk DNA kan samles, og kan ikke brukes på nedbrytte DNA-prøver. I tillegg er TRF-analysen kostbar og arbeidsintensiv, og krever 4-5 dager for å gi resultater. Imidlertid gir TRF en lav variasjonskoeffisientGi reproduserbarhet. Mens denne protokollen er forskjellig fra den tradisjonelle Southern blot (ved bruk av in situ gel hybridisering), er de to teknikkene i utgangspunktet de samme.
Teknikken som presenteres her er en kombinasjon av en Southern blot og in-gel hybridisering; Assosierer DNA-denatureringstrinnet fra Southern blots med in-gel hybridiseringen. Denne kombinasjonen har den ekstra fordelen av forbedret sondesignalstyrke sammenlignet med Southern blot og har konsekvent gitt kvantifiserbare resultater i laboratoriet. I tillegg gir bruk av radioaktive sonder snarere enn kjemiluminescerende prober høyere signalintensitet og muliggjør visualisering og kvantifisering med en fosforimager, noe som gjør analysene av TRF-brukervennlige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Genomisk DNA-ekstraksjon
- Utfør en genomisk DNA-ekstraksjon fra cellene (her, cellelinje BJ-hTERT) som skal analyseres ved hjelp av et kommersielt DNA-ekstraksjonssett, i henhold til produsentens instruksjoner.
- Mål DNA-konsentrasjonen med et spektrofotometer. Hvis DNA-konsentrasjonen er mindre enn 100 μg / ml, utfelles DNA'et med etanol og resuspenderes i et volum av TE-buffer (10 mM Tris-Cl; 0,1 mM EDTA (Etylendiamintetraeddiksyre) pH 8,0) for å sikre en DNA-konsentrasjon av 100-600 μg / ml).
2. DNA Integrity Assessment
MERK: Denne delen av protokollen skisserer en DNA-integritetsvurdering ved hjelp av et gelelektroforesystem med en 11 cm x 14 cm gel. Andre systemer og gelstørrelser kan også brukes, men spenningen og DNA-migrasjonstiden kan variere.
- Klargjør en 1% agarosegel ved å kombinere 1 g elektroforese grade agarose i 100 ml 1x TAE buffer (40 mM Trer-base; 20 mM eddiksyre; 2 mM EDTA; PH 8,5) og mikrobølgeovn til agarosen er oppløst og løsningen er tydelig. Avkjøl oppløsningen ved romtemperatur til den når 50 ° C (ca. 15-20 minutter).
- Mens agaroseoppløsningen er avkjøling, tilbereder gelstøpebrett ved å legge støpe endeportene til støpebrettet. For å unngå agaroselekkasje, avkjøl sluttportene til 4 ° C før du festes til støpebakken.
- Når agaroseoppløsningen er avkjølt til 50 ° C, tilsett 10 μl etidiumbromid (10 mg / ml i dH20) og hell agaroseoppløsningen i gelstøpebrettet. Legg kammen til støpebrettet.
- La agaroseoppløsningen herdes i 45 minutter ved romtemperatur.
- Forbered DNA-prøver for elektroforese ved å fortynne 25 ng genomisk DNA ved å bruke 1x TE-buffer til et sluttvolum på 9 μl og tilsett 1 μl 10x Loading Dye (0,25% (w / v) bromfenolblått, 0,25% (vekt / volum) xylen Cyano-FF, 30% (vol / vol) glyserol). Bland godt.
- Kjør DNA-migrasjonen ved 100 V i ca. 2 timer eller til bromfenolblått fargestoff er omtrent halvveis gjennom gelen.
- Bild gelen ved hjelp av en ultraviolett lys-transilluminator eller tilsvarende.
MERK: DNA-prøver med god integritet har bånd med høy molekylvekt uten smøring (det skyldes skjæret eller ødelagt DNA). Hvis DNA-båndene er smurt, har de lav integritet og er ikke egnet for Southern blot-analysen, og DNA-en må isoleres med friske celler.
3. Genomisk DNA-fordøyelse
- Utfør fordøyelsen av det genomiske DNA i et sluttvolum på 20-40 μl.
MERK: Volumene er størreEnn 40 ul vil overflate brønnene av agarosegelen.- Kombiner 3 μg genomisk DNA og riktig mengde 10x DNA-fordøyelsespuffer (levert med restriksjonsenzymer) slik at den endelige konsentrasjonen er 1x, i en mikrotube. Tilsett 1 μL RsaI restriksjonsenzym (10.000 U / ml) og 1 μl HinfI restriksjonsenzym (10.000 U / ml) til hvert rør. Juster sluttvolumet ved hjelp av steril, deionisert H 2 O. Bland godt. Sentrifuger kort (10-15 s ved 16.000 xg) for å sikre at alle komponenter er i bunnen av røret.
- Inkuber fordøyelsen ved 37 ° C i 16 timer. Etter fordøyelsen, oppbevar det fordøydede DNA ved 4 ° C eller -20 ° C i ikke mer enn 2 dager om nødvendig 17 .
4. Genomisk DNA-gelelektroforese
MERK: Denne delen av protokollen skisserer en fremgangsmåte for bruk av et 20 cm x 25 cm gelelektroforesystem. Ulike gelelektroPhoresis systemer kan brukes, men flere variabler må kanskje modifiseres, inkludert spenning, tid for migrasjon og mengde elektroforese buffer lagt til systemet for å gi optimale resultater.
- Klargjør 0,6% agaroseoppløsning ved å kombinere 2,25 g gelelektroforese grade agarose med 375 ml elektroforesebuffer, enten 1x TAE eller 0,5x TBE (110 mM Tris base; 90 mM borsyre; 2,5 mM EDTA; pH 8,3).
MERK: For telomerer mindre enn 8 000 kB anbefales 0,5x TBE mens 1x TAE anbefales for telomerer mellom 8 000 kB og 20 000 kB 1 . - Mikrobølgeovn løsningen til agarosen er oppløst og løsningen er tydelig. La løsningen avkjøle i 15 - 20 minutter ved romtemperatur eller til agarosen når 50 ° C.
- Mens agaroseoppløsningen er avkjøling, tilberedes gelelektroforesystemet for gelstøpning som beskrevet i trinn 2.2. Hell agarosegeloppløsningen i en gelstøpebrett. Sett en kam inn iGelen. La gelen herdes i 45 minutter avdekket ved romtemperatur.
- Forbered de fordøyede DNA-prøvene for elektroforese. For en 40 uL-reaksjon, tilsett 0,4 μl 10x ladingsfargestoff i hver prøve av fordøyd DNA. Kort sentrifuge (10-15 s, 16 000 xg) for å sikre at hele løsningen er på bunnen av røret.
- Forbered gelelektroforesystemet for DNA-migrasjon. Fjern endeportene og kammen fra gelen. Fyll gelelektroforesystemet med 1x TAE eller 0,5x TBE til fyllelinjen, slik at gelen er helt nedsenket i bufferen.
- Legg brønnene på gelen med DNA-prøvene slik at det er en tom brønn mellom prøvene. Unngå å forårsake bobler eller punktere gelen. Tilsett 10 μl av en DNA-stige inn i brønner på motsatte ender av gelen.
MERK: Typen av DNA-stige vil avhenge av lengden på telomerer, som vil variere fra person til person og mellom cellekilder. - Kjør gelelektroforeseen ved 150 V i 30 minutter for raskt å flytte DNA inn i gelen; Juster deretter spenningen til 57 V og kjør i 18-24 timer.
5. Gel Fluorescerende Imaging og hybridisering
- Etter 18-24 timer, slår du av elektroforeseenergikilden. Fjern gelstøpebrettet med gelen fra elektroforesebufferen. Skjær av øverste høyre hjørne av gelen for å tjene som referanse for gelens orientering.
- Forbered et stykke filterpapir ved å kutte papiret for å være litt større enn gelen. Legg filterpapiret på toppen av gelen i støpebrettet og la papiret suge opp overflødig løsning på gelen. Fjern forsiktig luftboblene mellom filterpapiret og gelen med en pipette som en vals for å klemme boblene ut gjennom sidene.
- Fjern gelen fra støpebakken ved å bla gelen og filtrer papiret slik at papiret ligger under gelen. Overfør gelen med filterpapiret til en geltørker og dekk denGel med plastfolie. Fjern alle luftbobler mellom plastfolie og gel ved hjelp av en pipette som en vals.
- Tørk gelen i 2 timer ved 50 ° C.
- Når du har tørket, fjern plastfolien og overfør gelen og filtrer papiret til en glassfat som inneholder 250 ml deionisert vann (tilstrekkelig til å dekke gelen). Fjern forsiktig filterpapiret og inkuber gelen ved romtemperatur i 15 minutter. Gelen vil være tynn, fast og lett å manipulere uten å rive.
- Forbered 5x SSC-oppløsning (750 mM NaCl; 75 mM natriumcitrat) i deionisert vann.
- Legg gelen på toppen av et nylonnett (12 i x 12 i). Rull nylonnett og gel sammen og sørg for at gelen ikke er i kontakt med seg selv. Plasser masken og gelen i et hybridiseringsrør ( f.eks . 12 i rør med 1,5 i diameter).
MERK: Når du har rullet opp riktig, vil gelen være i kontakt med nylonnettet på begge sider. - Kombinere 100 ml 5x SSC og 12 μL grønn fluorescerende nukleinsyre aCid flekk, og plasser i hybridiseringsrøret. Beskytt løsningen fra lys og inkuber i 30 minutter ved 42 ° C i en hybridiseringsovn med rotasjon.
- Fjern nylonsnettet / -gelen fra hybridiseringsrøret, rull opp og legg flat i en glassfat som inneholder 250 ml deionisert vann, og fjern forsiktig nylonnett. Bild gelen ved hjelp av en fosforimager. Bruk fluoresceringsinnstillingene: 520 BP, 40 Blå og 488 nm. Still fotomultiplikatorrøret (PMT) til 375, fokalplanet til +3 mm og følsomheten til normalt. Lagre bildet til en fil.
6. Hybridisering
- Klargjør den radioaktive telomere sonden.
- Kombiner 2 μL (2 ng) telomererprobe (5- (CCC TAA) 4 3 '), 2,5 μl 10x polynukleotidkinase-reaksjonsbuffer, 3 μl y32P-dATP (6000 Ci / mmol), 4 μl T4 Polynukleotidkinase og DNase fri, sterilt deionisert vann til et sluttvolum på 20 ul i en mikrOcentrifugerør.
Forsiktig: Følg anleggets radioaktive sikkerhet og forskrifter når du bruker radioaktivitet.
- Kombiner 2 μL (2 ng) telomererprobe (5- (CCC TAA) 4 3 '), 2,5 μl 10x polynukleotidkinase-reaksjonsbuffer, 3 μl y32P-dATP (6000 Ci / mmol), 4 μl T4 Polynukleotidkinase og DNase fri, sterilt deionisert vann til et sluttvolum på 20 ul i en mikrOcentrifugerør.
- Kort sentrifuger (10-30 s ved 16 000 xg) og inkuber i vannbad ved 37 ° C i 1 time. Sentrifuger i 10-30 s ved 16 000 xg og inkuber ved 65 ° C i 20 minutter for å stoppe reaksjonen.
- Ved hjelp av en G-25 kromatografisk mikrosirkulær kolonne blandes kolonneinnholdet ved vortexing, deretter sentrifuger i 1 min ved 700 xg ved romtemperatur. Kast filtratet.
- Last den radioaktive sondoppløsningen inn i G-25 kromatografikolonnen og sentrifuger i 2 minutter ved 700 x g. Lagre filtratet.
MERK: Behold filtratet da dette inneholder den radioaktive telomere sonden. Den radioaktive sonden kan lagres ved 4 ° C om nødvendig. - Tilbered 250 ml denatureringsløsning sammensatt av 1,5 M NaCl og 0,5 M NaOH i sterilt deionisert vann.
- Plasser gelen i en glassfat som inneholder 250 ml denatureringsoppløsning og inkubSpiste i 15 minutter ved romtemperatur. Fjern denatureringsløsningen og erstatt med 250 ml sterilt deionisert vann. Inkubér i 10 minutter på en orbital shaker (40 - 50 rpm) ved romtemperatur.
- Tilbered 250 ml nøytraliseringsløsning sammensatt av 1,5 NaCl og 0,5 M Tris-saltsyre, pH 8,0 i sterilt deionisert vann.
- Fjern deionisert vann og erstatt med 250 ml nøytraliseringsløsning og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur.
- Under inkuberingen i nøytraliseringsløsningen, tilbered 50 ml hybridiseringsløsning sammensatt av 5x SSC, 5x Denhardts løsning (0,1% ikke-ionisk syntetisk polymer, 0,1% polyvinylpyrrolidin, 0,1% bovint serumalbumin), 10 mM dinatriumfosfat (Na2 HPO 4 ) og 1 mM natriumpyrofosfattetrabasisk dekahydrat (Na4P207.10H20) i sterilt deionisert vann.
- Rull gelen inn i nylonnett og sett inn i hybridiseringsrøret (trinn5.7). Tilsett 20 ml hybridiseringsoppløsningen og inkuber i en hybridiseringsovn ved 42 ° C i 10 minutter med rotasjon.
- Fjern hybridiseringsløsningen og erstatt med 20 ml frisk hybridiseringsløsning. Tilsett helheten av telomeresonden og inkuber i en hybridiseringsovn ved 42 ° C over natten med rotasjon.
7. Gel vask, fosfor skjerm eksponering, og Radio Imaging
- Tilbered 500 ml 2x SSC-oppløsning (300 mM NaCl; 30 mM natriumcitrat) i sterilt deionisert vann.
- Tilbered 250 ml 0,1x SSC (15 mM NaCl; 1,5 mM natriumcitrat) og 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS) i deionisert vann.
- Fjern gelen og maske fra hybridiseringsrøret og sett i en glassfat som inneholder 250 ml 2x SSC. Unroll og fjern nylonnett fra parabolen. Plasser glassretten på en orbital shaker og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur.
- Fjern 2x SSC og erstatt med 250 mL 0.1x SSC og 0.1% SDS-løsning, og inkuber i 15 minutter på en orbital shaker ved romtemperatur.
- Under inkuberingen, utsett fosforskjermen til bildeglasseren i 15 minutter.
- Fjern 0,1x SSC og 0,1% SDS løsning og erstatt med 250 mL 2x SSC. Inkubér i 15 minutter på en orbital shaker.
- Fjern gelen fra 2x SSC-oppløsning, og sett inn gelen i plastfolie eller legg den i en varmeforseglet pose. Fjern alle bobler og luftlommer mellom gelen og plastfolien eller plastposen. Legg gelen i en eksponeringskassett med Phopshor-skjermen. Utsett fosforskjermen til gelen over natten.
- Bild det eksponerte fosforskjermen ved hjelp av en fosforimager.
8. Telomer lengde kvantifisering
- Åpne fosforimagerfilen som inneholder det fluorescerende bildet av den grønne fluorescerende nukleinsyre-farget gel ( Figur 1 ).
- Velg 'Verktøy' og deretter 'Pixel Distance'9 ;. Bruk musen til å trekke en linje fra bunnen av gelen godt til midten av det første markørbåndet og ta opp avstanden. Gjenta denne prosedyren for hvert markørbånd ( figur 2 ). Disse avstandene vil bli brukt i grafeprogrammet som beskrevet nedenfor.
- Åpne fosforimagen av den radiomerkede gelen ( Figur 3 ). Velg "Object Manager" og deretter "Grid". Sett grid til 1 kolonne og 150 rader. Juster rutenettet slik at den strekker seg fra toppen av gelen til bunnen av gelen. Juster bredden på rutenettet til lik bredden på banen, klikk på kanten av rutenettet og dra bredden på rutenettet til lik bredden på ruten.
- Kopier dette rutenettet (slik at bredden og høyden til boksene forblir de samme) og flytt det andre ruten til et tomt spor (for bakgrunnsformål). Fortsett å kopiere og flytte flere rister for flere prøvebaner.
MERK: Når du er ferdig, bør det væreRister for hver prøvebane og ett rutenett på en tom lane for bakgrunn ( figur 4 ). - Velg "Analyse" og deretter "Volumrapport". Velg alle nettene for rapporten. Når volumrapporten er vist, dobbeltklikk du på rapporten for å aktivere regnearkprogrammet. Lagre regnearkfilen. Dataene for denne filen blir Under "Volum" -banen.
- Åpne et passende grafikkprogram og opprett en ny data og tabell. Velg 'Y: Skriv inn og plott en enkelt Y-verdi for hvert punkt' og velg deretter 'Opprett'.
- Merk den første kolonnen (Kolonne X) som "Målt avstand" og merk den andre kolonnen (Kolonne Y) som "Molekylvekt". Skriv inn markørmolekylvektene til hvert markørbånd i kolonne Y. Angi migrasjonsavstandene oppnådd i trinn 8.2 som svarer til hver molekylvektmarkør.
- Gå til 'Analyse' og velg 'Analyser' og deretter 'ikke-lineær regressi'På (kurveformet) 'og velg' OK '. På neste skjermbilde velg 'Eksponentiell og deretter' One phase decay '. Velg kategorien 'Range' og skriv '150' i 'antall poeng som definerer kurven' og merk av 'Opprett et bord med XY-koordinater for å eksportere eller kopiere kurven til et annet program'.
MERK: Resultatet, "ikke-lineær passform av Data 1", inneholder molekylvekten for hver avstand i Y-raden. - For analyse av prøvebanene, velg et område med analyse som ligger over og under de faktiske telomerbåndene. Ikke bruk hele lengden på banen ( Figur 5 ). Bestem rutenettstedene for analysen av hver rute.
- Velg 'File', 'New' 'Create new Table and Graph'. Velg 'Y: Skriv inn og plott en enkelt Y-verdi for hvert punkt' og velg deretter 'Opprett'. Kopier og lim inn volumverdiene for bakgrunnsbanen (intensitetsverdier) fra regnearkfilenInn i den første kolonnen (X) og volumverdiene (intensitetsverdiene) fra prøvebanen til den første kolonnen Y. Hvis det er flere prøvebaner, kopierer du hvert sett med volumverdier fra regnearkfilen til ytterligere Y-kolonner i grafeprogrammet fil.
- Slett verdiene fra bakgrunns-kolonnen (X) og hver prøvebane (Y) som ligger utenfor analyseområdene bestemt i trinn 8.8.
MERK: Datatabellen skal bare inneholde verdier i de rutenettsteder som svarer til analysene. - Velg Analyse, deretter Analyser og transformer. Klikk på "OK". Velg 'Transform Y-verdier med Y = YX'. Dette vil forvandle dataene i Data 2 (transformert intensitetsverdi (Y) = sample intensitet (Y) - bakgrunnsintensitet (X)).
- Velg Analyse og deretter Analyser, Kolonneanalyse og Kolonnestatistikk. Velg OK. Resultatfanen 'Col. Statistikk for Transform of Data 2 'viserUnder 'Sum' -raden, Σ (Int i ).
- Velg 'File', 'New', 'Create New Table and Graph'. Velg 'Y: Skriv inn og plott en enkelt Y-verdi for hvert punkt' og velg deretter 'Opprett'. Kopier og lim inn Y-kolonnedata fra resultatsiden 'Nonlin passe til Data 1, Curve' i den nye X-kolonnen. Kopier og lim inn Y-kolonnedata fra resultatsiden 'Transform of Data 2' til den nye Y-kolonnen. Velg Analyse og deretter Analyser og Transform. Klikk på "OK". Velg 'Transform Y-verdier med Y = Y / X'.
- Velg Analyse og deretter Analyser, Kolonneanalyse og Kolonnestatistikk. Velg OK. Resultatfanen 'Col. Statistikk for Transform of Data 3 'vises under' Sum '-raden, Σ (Int i / MW i ). MW = molekylvekt.
- For å beregne gjennomsnittlig telomer lengde (TL) for hver prøve, brukFormel TL = Σ (Int i ) / Σ (Int i / MW i ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tre DNA-konsentrasjoner (1, 2 og 3 μg) isolert fra cellelinjen BJ-hTERT (telomerase-immortaliserte humane forhuden fibroblaster) 22 og humane perifere blodmononukleære celler (PBMCs) ble analysert for telomerlengden. Tabell 1 viser kjørefeltene for hver DNA-prøve. Figur 1 viser en nukleinsyre-fluorescerende flekk av gelen. Molekylvektstandardene er tydelig synlige. Avstanden fra toppen av gelen til hver molekylvektsstandard ble bestemt ( figur 2 ). Figur 3 viser fosforimaget av gelen som følger hybridisering med telomer-proben. Telomere-båndene vises som smører i hver bane. Rutenett på 150 bokser ble beregnet for hver bane pluss en bakgrunnsbane ( figur 4 ). Analysene som svarer til områdene avGel inneholdende telomerbåndene for hvert sett av prøver er vist i figur 5 . Separate bakgrunnsbane ble valgt for hvert sett med prøver for å sikre at bakgrunnsintensitetene var lik for hver prøvegruppe (baner merket B i figur 5 ). Tabell 2 viser telomer-restriksjonsfragmentlengder for hver prøve. Den gjennomsnittlige telomerlengden i hTERT-immortaliserte cellelinjen (BJ-hTERT) er høyere enn den som er sett i humane PBMCer (sammenligne banene 2, 4 og 6 med banene 10, 12 og 14 i figur 3 ). Disse resultatene viser også at mengden av genomisk DNA analysert i hver bane er kritisk for å oppnå et påvisbart signal etter hybridisering. For prøver med telomerer som er ganske ensartede ( dvs. BJ-hTERT-cellelinjen) så lite som 1 μg, ble detekterbar ved hjelp av denne prosedyren (selv om signalet var svært svakt). Men for prøver med telomerer som har aStørre varians ( dvs. humane PBMCer), er den minste mengden av DNA som gir et pålitelig signal 2 μg.
Figur 1 : Grønn fluorescerende Nucleic Acid Stained Gel. Fosforimage av den tørkede agarosegelen farget med grønn fluorescerende nukleinsyreflekk som viser plasseringen av DNA-stigebåndene (spor 1 og 8). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 : Bestemmelse av Marker Band Migration Distance . Blåpiler angir avstanden målt fra toppen av gelen til eaCh DNA stigebånd. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 : Fosforimering av DNA-prøver som ble bedt om med telomererproben. Banene 2, 4 og 6 inneholder BJ-hTERT DNA (henholdsvis 1, 2 og 3 μg). Banene 10, 12 og 14 inneholder humant PBMC-DNA (henholdsvis 1, 2 og 3 μg). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 : Gridplassering. Skjermbilde som viser plasseringen av150 tellernettet for hver analysert kjørefelt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5 : Analysområder. Fosforimage av telomerbånd som viser de utvalgte analysene for hvert sett av prøver. Banene 2, 4 og 6 inneholder BJ-hTERT DNA; Banene 10, 12 og 14 inneholder humant PBMC-DNA. B = bakgrunnsbane. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Lane | Prøve |
| 1 | DNA-stige |
| 2 | BJ-HTERT 1 &# 181; g |
| 3 | Blank |
| 4 | BJ-HTERT 2 μg |
| 5 | Blank |
| 6 | BJ-hTERT 3μg |
| 7 | Blank |
| 8 | DNA-stige |
| 9 | Blank |
| 10 | PBMCs 1μg |
| 11 | Blank |
| 12 | PBMCs 2μg |
| 1. 3 | Blank |
| 14 | PBMCs 3μg |
| DNA-prøver separert på 0,6% agarosegel |
Tabell 1: Prøveoppgaver for DNA-agarose.
| Eksempel (bane) | & #8721; (Int i ) | Σ (Int i / MW i ) | Gjennomsnittlig telomer lengde = Σ (Int i ) / Σ (Int i / MW i ) |
| BJTert 1ug (1) | 268691 | 20596 | 13.04578559 |
| BJTert 2ug (2) | 1357000 | 103204 | 13.14871517 |
| BJTert 3ug (3) | 1962000 | 148411 | 13.22004434 |
| PBMC 1ug (4) | -416337 | -142585 | 2.91992145 |
| PBMC 2ug (5) | 286653 | 62845 | 4,561269791 |
| PBMC 3ug (6) | 1880000 | 524123 | 3,586944286 |
Tabell 2: Gjennomsnittlig telomere lengdeberegninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Etter elektroforese er det genomiske DNA-smear høyere enn 800 bp. Dette kan oppstå hvis restriktjonsenzymer er defekte, eller hvis det er behov for ytterligere enzymer (som beskrevet ovenfor). En annen mulig forklaring er at proteinet fortsatt er festet til DNA. Ved bestemmelse av DNA-konsentrasjonen ved spektrofotometer, bør 260/280 forholdet være rundt 1,8. Hvis dette forholdet er <1,5, er det proteinforurensning som kan forstyrre restriktionsenzymfordøyelsen. Enten måtte DNA-prøven bli isolert, eller proteinet ville bli fjernet med en proteinase K-fordøyelse og fenol: kloroformekstraksjon fulgt av etanolutfelling. Bruken av et kommersielt DNA-isolasjonssett resulterer rutinemessig i DNA med et 260/280 forhold på 1,8-1,85.
Etter eksponering av gelen til en fosforskjerm, er det ikke påvist telomerfragmenter. Dette kan skyldes en dårlig radiomerket telomer sonde, feil hybridiseringTilstander eller utilstrekkelig mengde av start-genomisk DNA. Ved fremstilling av telomere sonden, ved slutten av sentrifugeringen av G-25 kolonnen, bør det være lett detekterbar radioaktivitet i gjennomstrømmingen (som representerer den radiomerkede telomererprobe). Hvis radioaktivitet ikke oppdages, var det et problem med prepareringen av proben. Det er også viktig å sikre at hybridiseringstemperaturen ikke overskrider 42 ° C (for å hindre smelting av sonden: malkomplekset) og at hybridiseringsbufferen fullstendig nedsenker gelen i hybridiseringskammeret. Minimumsmengden av genomisk DNA som gir detekterbare telomerer er 2,0-3,0 μg. Mindre mengder utgangsmateriale kan resultere i svært svakt eller intet signal etter hybridisering.
Denne protokollen krever 2-3 μg for hver telomer lengdebestemmelse. Hvis prøvene skal kjøres i to eksemplarer eller tre eksemplarer, kreves 6-12 μg DNA. Dette forhindrer th Er prosedyren fra å bli brukt på prøver med begrenset DNA-mengde. Prosedyren er ganske arbeidskrevende og krever 3-4 dager å fullføre. Antallet prøver som er analysert på en gang, er begrenset til antall gelelektroforese-rigger og størrelsen på agarosegelkammen. Som et resultat er det mindre enn ideelt for studier med stort antall prøver (som epidemiologiske studier).
DNA-hybridiseringsteknikker av telomerer separert ved gelelektroforese forblir gullstandarden for å bestemme telomerlengden. Ingen annen prosedyre måler direkte telomer lengde som resulterer i faktiske telomere størrelser.
Det er flere kritiske skritt i denne prosedyren. For det første må DNA-prøven ha god integritet, dvs. ikke skåret. DNA som er skåret kan resultere i falske telomer lengde resultater. Det er også viktig at DNA-fordøyelsen er fullført. Fordøyelsen av genomisk DNA bør resultere i et DNA-smear på 800 bp eller mindre"Xref"> 2. For å sikre riktig fordøyelse har noen prosedyrer beskrevet totalt 6 restriksjonsenzymer (i stedet for bare RsaI og Hinf1 som beskrevet i denne prosedyren). De ytterligere restriksjonsenzymer inkluderer HhaI, MspI, HaeIII og AluI2. Et annet kritisk trinn er at agarosegelet kan løpe lenge nok til å få riktig separasjon av det fordøyede DNA. Hvis det er bedre separasjon, så er det bedre presisjon i analysene. Gelens kjøretid bør være lang nok slik at DNA-fragmenter som representerer 1 Kbp, befinner seg på bunnen av gelen ( figur 1 ). Avhengig av gelstørrelsen og spenningen til elektroforeseen, kan dette kreve 12 til 24 timer. Et tredje kritisk trinn er hybridiseringen. Det må være tilstrekkelig hybridiseringsbuffer i kammerrøret for å fordype hele gelen når røret er horisontalt. Utilstrekkelige nivåer av hybridiseringsbuffer kan resultere i ujevn hybridisering av telomererproben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner støtten fra University of Pittsburgh Cancer Institute Biobehavioral Oncology felles anlegg som delvis støttes ved pris P30CA047904.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biologics | |||
| Rsa1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0167S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Hinf1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0155S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Seakem GTG Agarose | Lonza | 50071 | electrophoresis grade agarose |
| Optikinase | affymetrix | 78334X 500 UN | T4 Polynucleotide Kinase |
| SYBR Green Nucleic Acid Stain I | ThermoFisher Scientific | S7567 | Syber Green |
| exactGene DNA Ladder 24- kB | Fisher Scientific | BP2580100 | |
| C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5) | Integrated DNA Technologies | Custom ordered DNA oligonucleotide | |
| Gamma-ATP-P32 | Perkin Elmer | BLU502Z | Radioisotope |
| Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit | Qiagen | 13323 | DNA extraction kit |
| GE Illustra Microspin G-25 column | GE Healthcare Life Sciences | 27-5325-01 | For purification of readioactive oligo probe |
| Ficoll 400 | non-ionic synthetic polymer | ||
| Equipment/Software | |||
| Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm) | ThermoFisher Scientific | A5 | Gel electrophoresis |
| Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm) | Corel Life Sciences | 11068020 | Gel electrophoresis |
| Nylon mesh, 50, 12" x 12" | Ted Pellam, Inc | 41-12105 | |
| GE Storage Phosphor Screens | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-75 | |
| Phosphor Screen Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | 63-0035-44 | |
| Isotemp Hybridzation Incubator | Fisher Scientific | 13-247-20Q | |
| Cylindrical hybridization tubes | Fisher Scientific | 13-247-300 | |
| The Belly Dancer orbital shaker | Sigma-aldrich | Z768499-1EA | Orbital shaker |
| Typhoon 9400 | ABI | For imaging of gels and phosphor screens | |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad | Version 6.05 | Graphing Program |
| Microsoft Excel | Microsoft | Office 365 | Spreadsheet program |
| Nanodrop | Thermo Scientific | Nanodrp 2000 | Spectrophotometer |
References
- Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. Analysis of telomeres and telomerase. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 18 Unit 18 16 (2003).
- Mender, I., Shay, J. W. Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis. Bio Protoc. 5 (22), (2015).
- Blackburn, E. H. Telomeres and Telomerase: The Means to the End (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7405-7421 (2010).
- Greider, C. W. Telomerase Discovery: The Excitement of Putting Together Pieces of the Puzzle (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7422-7439 (2010).
- Szostak, J. W. DNA Ends: Just the Beginning (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7386-7404 (2010).
- Watson, J. M., Riha, K. Telomeres, Aging, and Plants: From Weeds to Methuselah - A Mini-Review. Gerontology. 57 (2), 129-136 (2011).
- Lu, W., Zhang, Y., Liu, D., Songyang, Z., Wan, M.
- MacNeil, D. E., Bensoussan, H. J., Autexier, C. Telomerase Regulation from Beginning to the End. Genes (Basel). 7 (9), 64 (2016).
- Fouquerel, E., Opresko, P. Convergence of The Nobel Fields of Telomere Biology and DNA Repair. Photochem Photobiol. , Epub ahead of print (2016).
- Bernadotte, A., Mikhelson, V. M., Spivak, I. M. Markers of Cellular Senescence. Telomere Shortening as a Marker of Cellular Senescence. Aging (Albany NY). 8 (1), 3-11 (2016).
- Opresko, P. L., Shay, J. W.
- Chiodi, I., Mondello, C. Telomere and Telomerase Stability in Human Diseases and Cancer. Front Biosci (Landmark Ed). 1 (21), 203-224 (2016).
- Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. Human Telomere Biology: A Contributory and Interactive Factor in Aging, Disease Risks, and Protection. Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).
- Lindqvist, D., et al. Psychiatric Disorders and Leukocyte Telomere Length: Underlying Mechanisms Linking Mental Illness with Cellular Aging. Neurosci Biobehav Rev. 55, 333-364 (2015).
- Bodelon, C., Savage, S. A., Gadalla, S. M.
- Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Haussmann, M. F., Mauck, R. A. TECHNICAL ADVANCES: New strategies for telomere-based age estimation. Mol Ecol Resour. 8 (2), 264-274 (2008).
- Nussey, D. H., et al. Measuring telomere length and telomere dynamics in evolutionary biology and ecology. Methods Ecol Evol. 5 (4), 299-310 (2014).
- Delany, M. E., Krupkin, A. B., Miller, M. M. Organization of telomere sequences in birds: evidence for arrays of extreme length and for in vivo shortening. Cytogenet Cell Genet. 90 (1-2), 139-145 (2000).
- Baerlocher, G. M., Vulto, I., de Jong, G., Lansdorp, P. M. Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH). Nat Protoc. 1 (5), 2365-2376 (2006).
- Sanders, J. L., Newman, A. B. Telomere length in epidemiology: a biomarker of aging, age-related disease, both, or neither. Epidemiol Rev. 35, 112-131 (2013).
- Parikh, D., Fouquerel, E., Murphy, C. T., Wang, H., Opresko, P. L. Telomeres are partly shielded from ultraviolet-induced damage and proficient for nucleotide excision repair of photoproducts. Nat Commun. 6, 8214 (2015).
