Summary
I denna artikel diskuteras ett detaljerat protokoll för kvantifiering av telomerlängden med hjälp av en modifierad terminalrestriktionsfragmentanalys som ger snabb och effektiv direktmätning av telomerlängden. Denna teknik kan appliceras på en mängd olika cellkällor för DNA för att kvantifiera telomerlängden.
Abstract
Det finns flera olika tekniker för mätning av telomerlängden, var och en med sina egna fördelar och nackdelar. Det traditionella tillvägagångssättet, Telomere Restriction Fragment (TRF) -analys, utnyttjar en DNA-hybridiseringsteknik där genomiska DNA-prover digereras med restriktionsenzymer och lämnar bakom telomer-DNA-upprepningar och något subtelomer-DNA. Dessa separeras genom agarosgelelektrofores, överföres till ett filtermembran och hybridiseras till oligonukleotidprober märkta med antingen kemiluminescens eller radioaktivitet för att visualisera telomer-restriktionsfragment. Detta tillvägagångssätt, medan det krävs en större mängd DNA än andra tekniker, såsom PCR, kan mäta telomerlängdsfördelningen av en population av celler och tillåter mätning uttryckt i absoluta kilobaser. Detta manuskript demonstrerar en modifierad DNA-hybridiseringsprocedur för bestämning av telomerlängden. Genomiskt DNA digereras först med restriktionsenzymer (som inte skärsTelomerer) och separeras genom agarosgelelektrofores. Gelen torkas sedan och DNA-denatureras och hybridiseras in situ till en radioaktivt märkt oligonukleotidprobe. Denna in situ hybridisering undviker förlust av telomer-DNA och förbättrar signalintensiteten. Efter hybridisering avbildas gelerna med användning av fosforskärmar och telomerlängden kvantifieras med användning av ett grafprogram. Denna procedur har utvecklats av laboratorierna i Drs. Woodring Wright och Jerry Shay vid University of Texas Southwestern 1 , 2 . Här presenterar vi en detaljerad beskrivning av detta förfarande, med några ändringar.
Introduction
Telomerer, som ligger vid ändarna av kromosomer, är nukleotidrepetitioner av sekvensen TTAGGG (på mänskliga kromosomer) som spelar en kritisk roll för att skydda cellegenetisk information 3 , 4 , 5 . Telomerer är flera tusen baspar i längd och tjänar till att skydda integriteten hos resten av kromosomen under DNA-replikation. Reprovering av kromosomer är inte perfekt vilket resulterar i att kromosomändarna inte kopieras fullständigt. Denna ineffektivitet vid replikering benämns "end replikationsproblemet" och resulterar i förlust av några av telomereupprepningarna under varje omgång av replikering 6 , 7 . Telomerlängden kan återställas efter celldelning med telomeras, ett enzym som ersätter de förlorade telomersekvenserna 8 , 9 . Telomeras är dock inteAktiveras i de flesta mänskliga somatiska celler och som ett resultat kommer telomerer över tiden att förkorta, så småningom resultera i cellulär senescens 10 . På grund av telomererförkortning betraktas telomerer som en biomarkör av åldrande och risk för åldersrelaterade sjukdomar 11 , 12 . Dessutom kan telomerlängden påverkas av genetiska, miljömässiga och livsstilsfaktorer och andra stimuli som oxidativ stress, vilket indikerar att telomerlängden kan spela en roll som biomarkör i toxikologiska, epidemiologiska och beteendestudier 13 , 14 , 15 .
Denna artikel visar en teknik för att mäta telomerlängden med användning av en modifierad terminal-restriktionsfragment (TRF) -analys anpassad från Mender and Shay 2 och Kimura et al. 16 , och liknar Herbert, Shay och WrigHt 1 och haussmann och Mauck 17 Traditionellt innebär TRF-analys en Southern blot-procedur. Southern blots anses vara "guldstandarden" för att studera telomerlängden och används aktivt för undersökning av leukocyttelomererlängd i epidemiologiska studier 18 . Denna TRF-analys använder digererat genomiskt DNA som lämnar bakom telomereupprepningarna. DNA-fragmenten separeras sedan genom gelelektrofores, denatureras och överförs till ett nitrocellulosamembran. Telomer-sekvenserna hybridiseras till en telomer-oligonukleotidsond. I stället för att överföra de separerade telomererna till ett membran använder andra TRF-tekniker in-gel-hybridiseringstekniker med och utan denaturering av DNA. Inkluderingen av denaturering är viktig när man beaktar detektion av interstitiella telomerer, vilka har rapporterats hos vissa arter 19 . Förfaranden som saknar denatureringssteg upptäcker bara thE enkelsträngad DNA-överhängning vid terminala telomerer och kommer inte binda till interstitiella telomersekvenser 18 .
Förutom TRF-analys finns det flera andra tekniker för mätning av telomerlängden som var och en har sina egna fördelar och nackdelar. Flow-FISH-tekniken kan mäta genomsnittlig telomerlängd av individuella celler av en distinkt celltyp med användning av flödescytometri 16 , 20 . Medan det med säkerhet kan märka telomerer med mycket specifika sonder och minska mänskligt fel genom automatisering, är Flow-FISH dyrt, mindre effektivt och kräver färska prover och en högkvalificerad tekniker som begränsar sin förmåga till epidemiologiska studier 16 . Dessutom står denna metod inte för potentiella förändringar i antalet kromosomer i cellpopulationen. En annan teknik, qPCR, är allmänt accepterad som ett sätt att mäta telomerlängden för epidemiologiska studier 21 .
TRF-förfarandet har sina egna brister som begränsar användningen för vissa studier. TRF-tekniker kräver en stor mängd DNA jämfört med andra metoder (mellan 2 och 3 μg per prov). Detta begränsar teknikens tillämpningar för att undersöka telomerlängden av kliniska prover för vilka tillräckligt genomiskt DNA kan samlas och kan inte användas på nedbrytna DNA-prover. Dessutom är TRF-analysen dyr och arbetsintensiv, vilket kräver 4-5 dagar för att ge resultat. TRF ger emellertid en låg variationskoefficientGer reproducerbarhet. Även om detta protokoll är annorlunda än det traditionella Southern blot (utnyttjande in situ gel hybridisering), är de båda teknikerna i grunden samma.
Tekniken som presenteras här är en kombination av en Southern blot och in-gel hybridisering; Associering av DNA-denatureringssteget från sydliga blottar med in-gel-hybridiseringen. Denna kombination har den extra fördelen med förbättrad sond signalstyrka jämfört med Southern blot och har konsekvent givit kvantifierbara resultat inom vårt laboratorium. Dessutom ger användningen av radioaktiva sonder snarare än kemiluminescerande sonder högre signalintensitet och möjliggör visualisering och kvantifiering med en fosforbildare, vilket gör analyserna av användarvänliga TRF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Genomisk DNA-extraktion
- Utför en genomisk DNA-extraktion från cellerna (här celllinjen BJ-hTERT) som ska analyseras med användning av ett kommersiellt DNA-extraktionssats enligt tillverkarens instruktioner.
- Mät DNA-koncentrationen med en spektrofotometer. Om DNA-koncentrationen är mindre än 100 μg / ml, fäll ut DNA med etanol och resuspendera i en volym TE-buffert (10 mM Tris-Cl; 0,1 mM EDTA (etylendiamintetraättiksyra), pH 8,0) för att säkerställa en DNA-koncentration av 100-600 | ig / ml).
2. DNA-integritetsbedömning
OBS: Denna del av protokollet beskriver en DNA-integritetsbedömning med användning av ett gelelektroforesystem med en 11 cm x 14 cm gel. Andra system och gelstorlekar kan också användas, men spänningen och DNA-migrationstiden kan variera.
- Förbered en 1% agarosgel genom att kombinera 1 g elektroforesskala agaros i 100 ml 1x TAE-buffert (40 mM Trär-bas; 20 mM ättiksyra; 2 mM EDTA; PH 8,5) och mikrovågsugn tills agarosen är upplöst och lösningen är klar. Kyl lösningen vid rumstemperatur tills den når 50 ° C (ca 15-20 min).
- Medan agaroslösningen kyler, förbereda gelgjutningsfacket genom att lägga till gjutningsportar till gjutbrickan. För att förhindra agarosläckage, kyla ändportarna till 4 ° C innan du sätter fast på gjutbrickan.
- När agaroslösningen har svalnat till 50 ° C, tillsätt 10 μl etidiumbromid (10 mg / ml i dH20) och häll agaroslösningen i gelstödbrickan. Lägg kammen i gjutfacket.
- Låt agaroslösningen härda i 45 minuter vid rumstemperatur.
- Förbered DNA-prover för elektrofores genom utspädning av 25 ng genomiskt DNA med användning av 1x TE-buffert till en slutlig volym av 9 | il och tillsätt 1 | jL 10x laddningsfärg (0,25% (vikt / volym) bromfenolblått, 0,25% (vikt / volym) xylen Cyano-FF, 30% (volym / volym) glycerol). Blanda väl.
- Kör DNA-migrationen vid 100 V i ca 2 h eller tills bromfenolblåttfärgen är ungefär halvvägs genom gelén.
- Bilda gelén med hjälp av en ultraviolett ljustransilluminator eller motsvarande.
OBS: DNA-prover med god integritet har band med hög molekylvikt utan smetning (det beror på skjuvt eller trasigt DNA). Om DNA-banden smetsas, har de låg integritet och är inte lämpliga för Southern blot-analysen, och DNA måste återisoleras med färska celler.
3. Genomisk DNA-digestion
- Utför uppslutning av det genomiska DNA i en slutlig volym av 20-40 | il.
OBS: Volymerna är störreÄn 40 | il kommer att överfälla brunnarna i agarosgelen.- Kombinera 3 μg genomiskt DNA och lämplig mängd 10x DNA-digereringsbuffert (försedd med restriktionsenzymerna) så att den slutliga koncentrationen är 1x i en mikrotub. Tillsätt 1 μl RsaI-restriktionsenzym (10 000 U / ml) och 1 μl HinfI-restriktionsenzym (10 000 U / ml) till varje rör. Justera slutvolymen med steril, avjoniserad H2O. Blanda väl. Centrifugera kort (10-15 s vid 16.000 xg) för att säkerställa att alla komponenter är i botten av röret.
- Inkubera matsmältningen vid 37 ° C i> 16 h. Efter matsmältningen, lagra den digererade DNA vid 4 ° C eller -20 ° C under högst 2 dagar, om det behövs 17 .
4. Genomisk DNA-gelelektrofores
OBS! Denna del av protokollet beskriver en procedur för användning av ett 20 cm x 25 cm gelelektroforesystem. Olika gelelektronikPhoresis-system kan användas, men flera variabler kan behöva modifieras, inklusive spänning, migreringstid och mängd elektroforesbuffert tillsatt till systemet för att ge optimala resultat.
- Bered 0,6% agaroslösning genom att kombinera 2,25 g gelelektroforesgrad agaros med 375 ml elektroforesbuffert, antingen 1x TAE eller 0,5x TBE (110 mM Tris-bas; 90 mM borsyra; 2,5 mM EDTA; pH 8,3).
OBS! För telomerer mindre än 8 000 kB rekommenderas 0,5x TBE medan 1x TAE rekommenderas för telomerer mellan 8 000 kB och 20 000 kB 1 . - Mikrovågsugn lösningen tills agarosen har upplösts och lösningen är klar. Låt lösningen svalna i 15-20 min vid rumstemperatur eller tills agarosen når 50 ° C.
- Medan agaroslösningen kyles, framställes gelelektroforesystemet för gelgjutning enligt beskrivningen i steg 2.2. Häll agarosgelgellösningen i en gelgjutningsfack. Placera en kam iGelén. Låt gelén härda i 45 minuter avtäckt vid rumstemperatur.
- Förbered de digererade DNA-proverna för elektrofores. För en 40 uL-reaktion tillsätt 0,4 | il 10x laddningsfärg i varje prov av digererad DNA. Kort centrifug (10-15 s, 16 000 xg) för att säkerställa att hela lösningen är i botten av röret.
- Förbered gelelektroforesystemet för DNA-migrering. Ta bort ändportarna och kammen från gelén. Fyll gelelektroforesystemet med 1x TAE eller 0,5x TBE till fyllningslinjen, se till att gelén är helt nedsänkt i bufferten.
- Ladda gelarna i gelén med DNA-proverna så att det finns en blank brunn mellan proverna. Undvik att orsaka bubblor eller punktera gelén. Tillsätt 10 μl av en DNA-stege i brunnar på de motsatta ändarna av gelén.
OBS: Typen av DNA-stege beror på längden på telomererna, som varierar från person till person och mellan cellkällor. - Kör gelelektroforesen vid 150 V i 30 min för att snabbt flytta DNA: t i gelén; Ställ sedan in spänningen till 57 V och kör i 18-24 h.
5. Gel fluorescerande bildbehandling och hybridisering
- Efter 18-24 h, stäng av elelektrofores strömkällan. Ta bort gelstödbrickan med gelén från elektroforesbufferten. Skiva av det högra högra hörnet av gelén för att fungera som referens för gelens orientering.
- Förbered en bit av filterpapper genom att klippa papperet för att vara en något större storlek än gelén. Placera filterpapperet ovanpå gelén i gjutfacket och låt pappret suga upp överflödig lösning på gelén. Ta försiktigt bort luftbubblorna mellan filterpappret och gelén med en pipett som en vals för att pressa bubblorna ut genom sidorna.
- Ta bort gelén från gjutfacket genom att vända gelén och filtrera papperet så att papperet ligger under gelén. Överför gelen med filterpapperet till en geltorkare och täckaGel med plastfolie. Ta bort alla luftbubblor mellan plastfolien och gelén med hjälp av en pipett som en vals.
- Torka gelén i 2 timmar vid 50 ° C.
- När du har torkat, ta bort plastfolien och överför gelén och filtrera papperet till en glasskål som innehåller 250 ml avjoniserat vatten (tillräckligt för att täcka gelén). Ta försiktigt bort filterpapperet och inkubera gelén vid rumstemperatur i 15 minuter. Gelen kommer att vara tunn, fast och lätt att manipulera utan att riva.
- Förbered 5x SSC-lösning (750 mM NaCl, 75 mM natriumcitrat) i avjoniserat vatten.
- Lägg gelén ovanpå ett nylonnät (12 i x 12 in). Rulla nylonnätet och gelén och se till att gelen inte är i kontakt med sig själv. Placera nätet och gelén i ett hybridiseringsrör (t ex 12 i rör med 1,5 i diameter).
OBS! När den är ordentligt rullad kommer gelen att vara i kontakt med nylonnätet på båda sidor. - Kombinera 100 ml 5x SSC och 12 μL grön fluorescerande nukleinsyra aCid fläck och placera in i hybridiseringsröret. Skydda lösningen från ljus och inkubera i 30 minuter vid 42 ° C i en hybridiseringsugn med rotation.
- Ta bort nylonnätet / -gelen från hybridiseringsröret, rulla upp och placera det i en glasskål som innehåller 250 ml avjoniserat vatten och försiktigt avlägsna nylonnätet. Bilda gelén med en fosforbildare. Använd fluorescerande inställningar: 520 BP, 40 Blå och 488 nm. Ställ fotomultiplikatorröret (PMT) på 375, fokuseringsplanet till +3 mm och känsligheten för normal. Spara bilden till en fil.
6. Hybridisering
- Förbered den radioaktiva telomeren sonden.
- Kombinera 2 μL (2 ng) telomererprobe (5- (CCC TAA) 4 3 '), 2,5 | il 10x polynukleotidkinasreaktionsbuffert, 3 | il av ^ 32P-dATP (6000 Ci / mmol), 4 | il T4 Polynukleotidkinas och DNasfritt, sterilt avjoniserat vatten till en slutlig volym av 20 | il i en mikronOcentrifugrör.
Varning: Följ anläggningarnas radioaktiva säkerhet och föreskrifter vid användning av radioaktivitet.
- Kombinera 2 μL (2 ng) telomererprobe (5- (CCC TAA) 4 3 '), 2,5 | il 10x polynukleotidkinasreaktionsbuffert, 3 | il av ^ 32P-dATP (6000 Ci / mmol), 4 | il T4 Polynukleotidkinas och DNasfritt, sterilt avjoniserat vatten till en slutlig volym av 20 | il i en mikronOcentrifugrör.
- Kortvarig centrifug (10-30 s vid 16 000 xg) och inkubera i vattenbad vid 37 ° C i 1 h. Centrifugera i 10-30 s vid 16 000 xg och inkubera vid 65 ° C under 20 minuter för att stoppa reaktionen.
- Använd kolonnens G-25-kromatografi, blanda kolonnens innehåll genom vortexing, centrifugera sedan i 1 minut vid 700 xg vid rumstemperatur. Kassera filtratet.
- Ladda den radioaktiva sondlösningen i G-25-kromatografikolonnen och centrifugera i 2 minuter vid 700 x g. Spara filtratet.
OBS: Behåll filtratet eftersom det innehåller radioaktiv telomersond. Den radioaktiva sonden kan lagras vid 4 ° C om det behövs. - Framställ 250 ml denatureringslösning bestående av 1,5 M NaCl och 0,5 M NaOH i sterilt avjoniserat vatten.
- Placera gelén i en glasskål innehållande 250 ml denatureringslösning och inkubÅt i 15 minuter vid rumstemperatur. Avlägsna denatureringslösningen och ersätt med 250 ml sterilt avjoniserat vatten. Inkubera i 10 minuter på en orbital shaker (40-50 rpm) vid rumstemperatur.
- Framställ 250 ml neutraliseringslösning bestående av 1,5 NaCl och 0,5 M Tris-saltsyra, pH 8,0 i sterilt avjoniserat vatten.
- Avlägsna dejoniserat vatten och ersätt med 250 ml neutraliseringslösning och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Under inkubationen i neutraliseringslösningen, bereda 50 ml hybridiseringslösning sammansatt av 5x SSC, 5x Denhardts lösning (0,1% icke-jonisk syntetisk polymer, 0,1% polyvinylpyrrolidin, 0,1% bovint serumalbumin), 10 mM dinatriumfosfat (Na2HPO 4 ) och 1 mM natriumpyrofosfattetrabas-dekahydrat (Na4P207.10H20) i sterilt avjoniserat vatten.
- Rulla gelén i nylonnät och placera i hybridiseringsröret (steg5,7). Tillsätt 20 ml hybridiseringslösningen och inkubera i en hybridiseringsugn vid 42 ° C under 10 min med rotation.
- Ta bort hybridiseringslösningen och ersätt med 20 ml frisk hybridiseringslösning. Tillsätt helheten av telomersonden och inkubera i en hybridiseringsugn vid 42 ° C över natten med rotation.
7. Gel Tvätt, Fosfor Skärm Exponering, och Radio Imaging
- Framställ 500 ml 2x SSC-lösning (300 mM NaCl; 30 mM natriumcitrat) i sterilt avjoniserat vatten.
- Framställ 250 ml 0,1x SSC (15 mM NaCl; 1,5 mM natriumcitrat) och 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS) i avjoniserat vatten.
- Ta bort gelén och maska från hybridiseringsröret och sätt i en glasskål som innehåller 250 ml 2x SSC. Lossa och ta bort nylonnätet från disken. Placera glasskålen på en orbital shaker och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Ta bort 2x SSC och ersätt med 250 mL 0.1x SSC och 0.1% SDS-lösning och inkubera i 15 minuter på en orbital shaker vid rumstemperatur.
- Under inkubationen exponeras fosforskärmen till bildutjämnaren i 15 minuter.
- Ta bort 0,1x SSC och 0,1% SDS-lösning och ersätt med 250 ml 2x SSC. Inkubera i 15 minuter på en orbital shaker.
- Ta bort gelén från 2x SSC-lösning och vika gelén i plastfolie eller sätt i en värmeförseglingsbar påse. Ta bort alla bubblor och luftfickor mellan gelen och plastfolien eller plastpåsen. Placera gelén i en exponeringskassett med Phopshor-skärmen. Exponera fosforskärmen till gelén över natten.
- Bild den exponerade fosforskärmen med en fosforbildare.
8. Telomers längdkvantifiering
- Öppna fosforimagerfilen som innehåller den fluorescerande bilden av den gröna fluorescerande nukleinsyrafärgade gelén ( Figur 1 ).
- Välj "Verktyg" och sedan "Pixel Distance"9 ;. Använd musen genom att dra en linje från botten av gelén väl till mitten av det första markörbandet och registrera avståndet. Upprepa proceduren för varje markörband ( Figur 2 ). Dessa avstånd kommer att användas i grafprogrammet som beskrivs nedan.
- Öppna fosforimaget av den radiomärkta gelén ( Figur 3 ). Välj "Objekthanterare" och sedan "Grid". Ställ in rutnätet till 1 kolumn och 150 rader. Justera gallret så att det sträcker sig från toppen av gelén till botten av gelén. Justera bredden på rutnätet så att det motsvarar banans bredd, klicka på kanten av rutnätet och dra bredden på rutnätet så att det motsvarar banans bredd.
- Kopiera detta rutnät (så att rutorna bredd och höjd förblir desamma) och flytta det andra rutnätet till en tom fil (för bakgrundsändamål). Fortsätt att kopiera och flytta ytterligare rutor för ytterligare provbanor.
OBS! När du är klar ska det finnasRutor för varje provkörfält och ett rutnät på en tom körfält för bakgrund ( Figur 4 ). - Välj "Analys" och sedan "Volymrapportering". Välj alla rader för rapporten. När volymerapporten visas, dubbelklicka på rapporten för att aktivera kalkylarksprogrammet. Spara kalkylarkfilen. Data för den här filen kommer att vara Under volymen.
- Öppna ett lämpligt grafprogram och skapa en ny data och tabell. Välj "Y: Skriv och plott ett enda Y-värde för varje punkt" och välj sedan "Skapa".
- Märk den första kolumnen (Kolumn X) som "Måttavstånd" och märka den andra kolumnen (Kolumn Y) som "Molekylvikt". Ange markörmolekylvikterna för varje markörband i kolumn Y. Ange migrationsdistanserna erhållna i steg 8.2 motsvarande varje molekylviktmarkör.
- Gå till "Analys" och välj "Analysera" och sedan "nonlinear regressi"På (kurvform) 'och välj' OK '. På nästa skärm väljer du 'Exponentiell och sedan' En fasförfallning '. Välj fliken 'Räckvidd' och ange '150' i 'antal poäng som definierar kurvan' och kolla 'Skapa ett bord med XY-koordinater för att exportera eller kopiera kurvan till ett annat program'.
OBS: Resultatet, "olinjär passform för data 1", innehåller molekylvikten för varje avstånd i Y-raden. - För analys av provbanorna välj ett analysområde som ligger ovanför och under de faktiska telomerbanden. Använd inte hela banans längd ( Figur 5 ). Bestäm gridplatserna för analysområdet för varje bana.
- Välj "Arkiv", "Ny" "Skapa ny tabell och graf". Välj "Y: Skriv och plott ett enda Y-värde för varje punkt" och välj sedan "Skapa". Kopiera och klistra in volymen för bakgrundsbanans volym (intensitetsvärden) från kalkylarkfilenIn i den första kolumnen (X) och volymvärdena (intensitetsvärden) från provbanan till den första kolumnen Y. Om det finns flera provbanor kopierar du varje uppsättning volymvärden från kalkylarkfilen till ytterligare Y-kolumner i grafprogrammet fil.
- Ta bort värdena från bakgrundskolumnen (X) och varje provbanan (Y) som ligger utanför analysområdena bestämda i steg 8.8.
OBS: Datatabellen ska bara innehålla värden i de rutnät som motsvarar analysområdena. - Välj Analys, sedan Analysera och Transformera. Klicka på "OK". Välj "Transform Y-värden med Y = YX". Detta kommer att omvandla data i Data 2 (omvandlat intensitetsvärde (Y) = provintensitet (Y) - bakgrundsintensitet (X)).
- Välj Analys sedan 'Analysera', 'Kolumnanalys' och 'Kolumnstatistik'. Välj OK. Resultatfliken "Col. Statistik för Transform of Data 2 'visarUnder "Sum" raden, Σ (Int i ).
- Välj "File", "New", "Create New Table and Graph". Välj "Y: Skriv och plott ett enda Y-värde för varje punkt" och välj sedan "Skapa". Kopiera och klistra in Y-kolumndata från resultatsidan 'Nonlin fit of Data 1, Curve' till den nya X-kolumnen. Kopiera och klistra in Y-kolumndata från resultatsidan "Transform of Data 2" till den nya Y-kolumnen. Välj Analys sedan 'Analysera' och 'Transformera'. Klicka på "OK". Välj "Transform Y-värden med Y = Y / X".
- Välj Analys sedan 'Analysera', 'Kolumnanalys' och 'Kolumnstatistik'. Välj OK. Resultatfliken "Col. Statistiken för transformation av data 3 'visas under "Sum" raden, Σ (Int i / MW i ). MW = molekylvikt.
- För att beräkna den genomsnittliga telomerlängden (TL) för varje prov, användFormel TL = Σ (Int i ) / Σ (Int i / MW i ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tre koncentrationer av DNA (1, 2 och 3 μg) isolerade från cellinjen BJ-hTERT (telomeras immortaliserade humana förhudsfibroblaster) 22 och humana perifera blodmononukleära celler (PBMC) analyserades för telomerlängden. Tabell 1 visar banans uppdrag för varje DNA-prov. Figur 1 visar en nukleinsyra fluorescerande fläck av gelén. Molekylviktsstandarderna är tydligt synliga. Avståndet från toppen av gelén till varje molekylviktstandard bestämdes ( Figur 2 ). Figur 3 visar fosforimagen av gelén som följer hybridisering med telomererproben. Telomerbanden visas som smuts i varje lane. Grids med 150 lådor beräknades för varje lane plus en bakgrundslane ( figur 4 ). De analysområden som motsvarar områdena iGel innehållande telomerbanden för varje uppsättning prover visas i figur 5 . Separata bakgrundsbanor valdes för varje uppsättning prover för att säkerställa att bakgrundsintensiteterna var lika för varje provuppsättning (banor markerade B i figur 5 ). Tabell 2 visar telomer-restriktionsfragmentlängderna för varje prov. Den genomsnittliga telomerlängden i den immortaliserade hTERT-linjen (BJ-hTERT) är högre än den som ses i humana PBMC (jämför banorna 2, 4 och 6 med banorna 10, 12 och 14 i figur 3 ). Dessa resultat visar också att mängden genomiskt DNA som analyseras i varje bana är kritiskt för att erhålla en detekterbar signal efter hybridisering. För prover med telomerer som är ganska likformiga ( dvs. BJ-hTERT-cellinjen) så lite som 1 ug kunde detekteras med användning av denna procedur (även om signalen var mycket svag). För prov med telomerer som har aStörre varians ( dvs. humana PBMC), är den minsta mängden DNA som ger en pålitlig signal 2 μg.
Figur 1 : Grön fluorescerande nukleinsyrafärgad gel. Fosforimage av den torkade agarosgelen färgad med grön fluorescerande nukleinsyra-fläck som visar platsen för DNA-stegbanden (banorna 1 och 8). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2 : Bestämning av Marker Band Migration Distance . Blåpilar indikerar avståndet uppmätt från toppen av gelén till eaCh DNA ladderband. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3 : Fosforimage av DNA-prov som proberas med telomererproben. Banorna 2, 4 och 6 innehåller BJ-hTERT-DNA (1, 2 respektive 3 μg). Banorna 10, 12 och 14 innehåller humant PBMC-DNA (1, 2 respektive 3 μg). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4 : Rutnätplats. Skärmdump som visar platsen för150 räkningslister för varje analyserad lane. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5 : Analysområden. Fosforimage av telomerband som visar de valda analysområdena för varje uppsättning prover. Banorna 2, 4 och 6 innehåller BJ-hTERT-DNA; Banorna 10, 12 och 14 innehåller humant PBMC-DNA. B = bakgrundsbanor. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
| Körfält | Prov |
| 1 | DNA-stegen |
| 2 | BJ-HTERT 1 &# 181; g |
| 3 | Tom |
| 4 | BJ-hTERT 2 μg |
| 5 | Tom |
| 6 | BJ-hTERT 3 μg |
| 7 | Tom |
| 8 | DNA-stegen |
| 9 | Tom |
| 10 | PBMCs 1 ug |
| 11 | Tom |
| 12 | PBMC 2μg |
| 13 | Tom |
| 14 | PBMC 3μg |
| DNA-prov separerade på 0,6% agarosgel |
Tabell 1: DNA-agarosprovuppdrag.
| Prov (Lane) | & #8721; (Int i ) | Σ (Int i / MW i ) | Genomsnittlig telomerlängd = Σ (Int i ) / Σ (Int i / MW i ) |
| BJTert 1ug (1) | 268.691 | 20.596 | 13.04578559 |
| BJTert 2ug (2) | 1357000 | 103.204 | 13.14871517 |
| BJTert 3ug (3) | 1962000 | 148.411 | 13.22004434 |
| PBMC 1ug (4) | -416.337 | -142.585 | 2.91992145 |
| PBMC 2ug (5) | 286.653 | 62845 | 4,561269791 |
| PBMC 3ug (6) | 1880000 | 524.123 | 3,586944286 |
Tabell 2: Genomsnittlig telomerlängdberäkningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Efter elektrofores är den genomiska DNA-smeten högre än 800 bp. Detta kan inträffa om restriktionsenzymerna är defekta eller om ytterligare enzymer (som beskrivna ovan) behövs. En andra möjlig förklaring är att proteinet fortfarande är fäst vid DNA: n. Vid bestämning av DNA-koncentrationen genom spektrofotometer bör 260/280 förhållandet vara omkring 1,8. Om detta förhållande är <1,5, är det proteinförorening som kan störa restriktionsenzym digestion. Antingen skulle DNA-provet behöva isoleras igen, eller proteinet skulle behöva avlägsnas med en proteinas K-digestion och fenol: kloroformutvinning följt av etanolutfällning. Användningen av ett kommersiellt DNA-isoleringskit resulterar rutinmässigt i DNA med ett 260/280 förhållande av 1,8-1,85.
Efter exponering av gelén på en fosforskärm detekteras inga telomerfragment. Detta kan bero på en dålig radiomärkt telomersond, felaktig hybridiseringTillstånd eller otillräcklig mängd av start-genom-DNA. Vid beredning av telomererproben, vid slutet av centrifugeringen av G-25-kolonnen, bör det vara lätt detekterbar radioaktivitet i genomströmningen (representerande den radiomärkta telomererproben). Om radioaktivitet inte detekteras var det ett problem med beredningen av proben. Det är också viktigt att säkerställa att hybridiseringstemperaturen inte överstiger 42 ° C (för att förhindra smältning av sonden: mallkomplexet) och att hybridiseringsbufferten helt nedsänker gelén i hybridiseringskammaren. Den minsta mängden genomiskt DNA som ger detekterbara telomerer är 2,0-3,0 μg. Mindre mängder utgångsmaterial kan resultera i mycket svag eller ingen signal efter hybridisering.
Detta protokoll kräver 2-3 μg för varje telomerlängdsbestämning. Om proven ska köras i dubblett eller triplikat krävs 6-12 μg DNA. Detta förhindrar th Är proceduren från att användas på prover med begränsad DNA-kvantitet. Förfarandet är ganska mödosamt och kräver 3-4 dagar att slutföra. Antalet prov som analyseras vid en tidpunkt är begränsat till antalet gelelektroforesriggar och storleken av agarosgelkammen. Som ett resultat är det mindre än perfekt för studier som använder ett stort antal prover (såsom epidemiologiska studier).
DNA-hybridiseringstekniker av telomerer separerade genom gelelektrofores förblir guldstandarden för bestämning av telomerlängden. Inget annat förfarande mäter direkt telomerlängden vilket resulterar i faktiska telomerstorlekar.
Det finns flera kritiska steg i denna procedur. Först måste DNA-provet ha god integritet, dvs inte skjuvad. DNA som skjuvas kan resultera i falska telomerlängdsresultat. Det är också viktigt att DNA-matsmältningen är komplett. Spjälkningen av genomiskt DNA bör resultera i ett DNA-smitt av 800 bp eller mindre"Xref"> 2. För att säkerställa korrekt matsmältning har vissa förfaranden beskrivit totalt 6 restriktionsenzymer (i stället för bara RsaI och Hinf1 enligt beskrivningen i denna procedur). De ytterligare restriktionsenzymerna innefattar HhaI, MspI, HaeIII och AluI2. Ett andra kritiskt steg möjliggör att agarosgelen löper tillräckligt länge för att få ordentlig separation av den digererade DNA. Om det finns bättre separation, så finns det bättre precision i analyserna. Gelkörningstiden bör vara tillräckligt lång så att DNA-fragment som representerar 1 Kbp finns i botten av gelén ( Figur 1 ). Beroende på gelstorlek och spänning av elektrofores kan detta kräva 12 till 24 timmar. Ett tredje kritiskt steg är hybridiseringen. Det måste finnas tillräcklig hybridiseringsbuffert i kammarröret för att fördjupa hela gelén när röret är horisontellt. Otillräckliga nivåer av hybridiseringsbuffert kan resultera i ojämn hybridisering av telomererproben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Författarna bekräftar stöd från University of Pittsburgh Cancer Institute Biobehavioral Oncology delad anläggning som delvis stöds genom utmärkelse P30CA047904.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biologics | |||
| Rsa1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0167S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Hinf1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0155S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Seakem GTG Agarose | Lonza | 50071 | electrophoresis grade agarose |
| Optikinase | affymetrix | 78334X 500 UN | T4 Polynucleotide Kinase |
| SYBR Green Nucleic Acid Stain I | ThermoFisher Scientific | S7567 | Syber Green |
| exactGene DNA Ladder 24- kB | Fisher Scientific | BP2580100 | |
| C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5) | Integrated DNA Technologies | Custom ordered DNA oligonucleotide | |
| Gamma-ATP-P32 | Perkin Elmer | BLU502Z | Radioisotope |
| Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit | Qiagen | 13323 | DNA extraction kit |
| GE Illustra Microspin G-25 column | GE Healthcare Life Sciences | 27-5325-01 | For purification of readioactive oligo probe |
| Ficoll 400 | non-ionic synthetic polymer | ||
| Equipment/Software | |||
| Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm) | ThermoFisher Scientific | A5 | Gel electrophoresis |
| Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm) | Corel Life Sciences | 11068020 | Gel electrophoresis |
| Nylon mesh, 50, 12" x 12" | Ted Pellam, Inc | 41-12105 | |
| GE Storage Phosphor Screens | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-75 | |
| Phosphor Screen Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | 63-0035-44 | |
| Isotemp Hybridzation Incubator | Fisher Scientific | 13-247-20Q | |
| Cylindrical hybridization tubes | Fisher Scientific | 13-247-300 | |
| The Belly Dancer orbital shaker | Sigma-aldrich | Z768499-1EA | Orbital shaker |
| Typhoon 9400 | ABI | For imaging of gels and phosphor screens | |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad | Version 6.05 | Graphing Program |
| Microsoft Excel | Microsoft | Office 365 | Spreadsheet program |
| Nanodrop | Thermo Scientific | Nanodrp 2000 | Spectrophotometer |
References
- Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. Analysis of telomeres and telomerase. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 18 Unit 18 16 (2003).
- Mender, I., Shay, J. W. Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis. Bio Protoc. 5 (22), (2015).
- Blackburn, E. H. Telomeres and Telomerase: The Means to the End (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7405-7421 (2010).
- Greider, C. W. Telomerase Discovery: The Excitement of Putting Together Pieces of the Puzzle (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7422-7439 (2010).
- Szostak, J. W. DNA Ends: Just the Beginning (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7386-7404 (2010).
- Watson, J. M., Riha, K. Telomeres, Aging, and Plants: From Weeds to Methuselah - A Mini-Review. Gerontology. 57 (2), 129-136 (2011).
- Lu, W., Zhang, Y., Liu, D., Songyang, Z., Wan, M.
- MacNeil, D. E., Bensoussan, H. J., Autexier, C. Telomerase Regulation from Beginning to the End. Genes (Basel). 7 (9), 64 (2016).
- Fouquerel, E., Opresko, P. Convergence of The Nobel Fields of Telomere Biology and DNA Repair. Photochem Photobiol. , Epub ahead of print (2016).
- Bernadotte, A., Mikhelson, V. M., Spivak, I. M. Markers of Cellular Senescence. Telomere Shortening as a Marker of Cellular Senescence. Aging (Albany NY). 8 (1), 3-11 (2016).
- Opresko, P. L., Shay, J. W.
- Chiodi, I., Mondello, C. Telomere and Telomerase Stability in Human Diseases and Cancer. Front Biosci (Landmark Ed). 1 (21), 203-224 (2016).
- Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. Human Telomere Biology: A Contributory and Interactive Factor in Aging, Disease Risks, and Protection. Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).
- Lindqvist, D., et al. Psychiatric Disorders and Leukocyte Telomere Length: Underlying Mechanisms Linking Mental Illness with Cellular Aging. Neurosci Biobehav Rev. 55, 333-364 (2015).
- Bodelon, C., Savage, S. A., Gadalla, S. M.
- Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Haussmann, M. F., Mauck, R. A. TECHNICAL ADVANCES: New strategies for telomere-based age estimation. Mol Ecol Resour. 8 (2), 264-274 (2008).
- Nussey, D. H., et al. Measuring telomere length and telomere dynamics in evolutionary biology and ecology. Methods Ecol Evol. 5 (4), 299-310 (2014).
- Delany, M. E., Krupkin, A. B., Miller, M. M. Organization of telomere sequences in birds: evidence for arrays of extreme length and for in vivo shortening. Cytogenet Cell Genet. 90 (1-2), 139-145 (2000).
- Baerlocher, G. M., Vulto, I., de Jong, G., Lansdorp, P. M. Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH). Nat Protoc. 1 (5), 2365-2376 (2006).
- Sanders, J. L., Newman, A. B. Telomere length in epidemiology: a biomarker of aging, age-related disease, both, or neither. Epidemiol Rev. 35, 112-131 (2013).
- Parikh, D., Fouquerel, E., Murphy, C. T., Wang, H., Opresko, P. L. Telomeres are partly shielded from ultraviolet-induced damage and proficient for nucleotide excision repair of photoproducts. Nat Commun. 6, 8214 (2015).
